BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE

PUEBLA

ESCUELA DE BIOLOGA
Licenciatura en Biotecnologa

MANUAL DE PRCTICAS
BIORREMEDIACIN

AUTORES:

M.C. Dolores Castaeda Antonio.

D.C. Gloria Merino Guzmn.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 1

 Jos Alfonso Esparza Ortiz
Rector

Ren Valdiviezo Sandoval

Secretario General

Mara del Carmen Martnez Reyes

Vicerrectora de Docencia

Hctor Rafael Eliosa Len

Director
Escuela de Biologa

Adriana Berenice Silva Gmez

Secretaria Acadmica
Escuela de Biologa

Carlos Castaeda Posadas

Secretario Administrativo
Escuela de Biologa

Elsa Iracena Castaeda Roldn

Coordinadora Lic. en Biotecnologa

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 2

 NDICE GENERAL

ndice...... 3

Instrucciones generales del Laboratorio de Biorremediacin.....4

Normas de seguridad en el laboratorio5

Prctica I: Degradacin de colorante azul indigo por el genero Trichoderma7

Prctica II: Preparacin de muestra de un suelo y contaminacin de suelo...11

Prctica III: Determinacin de humedad en suelo..16

Prctica IV: Determinacin de la materia orgnica del suelo.19

Prctica V: Determinacin de grasas y aceites por Mtodo Soxhlet.....22

Proyectos de Biorremediacin.....25

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 3

INSTRUCCIONES GENERALES DEL LABORATORIO DE BIORREMEDIACION
1. REGLAS GENERALES PARA EL INGRESO DE ESTUDIANTES AL
LABORATORIO
1. Se impartir una sesin por semana en el laboratorio que se designe.
2. El ingreso al laboratorio debe ser con puntualidad y se darn 10 minutos de tolerancia, no
se permitir el ingreso al laboratorio despus de esa tolerancia.
3. Se pasar lista de asistencia al inicio de la prctica.
4. Se repartir un vale por el material que se requiera por prctica, el cual debe ser
regresado al final y verificado que todo el material este en buen estado.
5. En caso de que el material de vidrio se rompa, los alumnos de equipo debern cubrir y/o
regresar el material nuevo.
6. Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la prctica y sin el
consentimiento del profesor se considerara que no asisti a la prctica
7. Las faltas en el laboratorio se calificarn con cero.
9. El reporte se entregar una semana despus de realizada la prctica.
10. El alumno utilizar el instructivo de laboratorio en cada sesin.

2. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

A) PERSONALES
1. El alumno asistir al laboratorio con bata blanca debidamente abrochada.

B) DE TRABAJO EN EL LABORATORIO
o En la zona de trabajo del laboratorio no se permitir comer, beber, fumar, jugar,
guardar alimentos.
o No se podrn utilizar celulares, audfonos, ipods, ni aplicar cosmticos.
o Durante el desarrollo de la prctica queda prohibida la entrada a personas ajenas al
grupo.
o El laboratorio deber mantenerse ordenado y limpio, retirando del mismo, cualquier
material que no tenga relacin con el trabajo.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 4

 o Las superficies de trabajo se descontaminarn al iniciar y terminar el trabajo de
siembra.
o Los alumnos se lavarn las manos antes y despus de haber concluido el trabajo en
el laboratorio.
o Slo se permitir el paso a la zona de trabajo del laboratorio a los alumnos inscritos.
Durante el trabajo se mantendrn cerradas las puertas del laboratorio.
o Los artculos personales como bolsas, mochilas debern colocarse en los lugares
asignados.
o Las personas con el cabello largo debern traerlo amarrado o en su defecto utilizar
una cofia.
o Los hombres deben evitar la barba o bien usarla muy corta.

C) MATERIALES
o Todo el material contaminado se descontaminarn o se esterilizarn antes de ser
eliminados o de volver a utilizarlos.
o No se permitir utilizar pipetas sin su tapn de algodn.
o Se prohbe llevarse objetos o sustancias a la boca durante la prctica.
o Todos los recipientes para almacenar sustancias deben estar etiquetados, los frascos
sin etiqueta, cajas Petri, matraces, tubos etc. que no tengan etiqueta sern
automticamente desechados.
o Se proporcionarn contenedores adecuados para el material de desecho y el material
de vidrio roto se colocar en un recipiente especial para ello,
o Revisar que las llaves de agua y gas estn siempre bien cerradas al final de cada
prctica.
o Los medios de cultivo debern estar tapados perfectamente para evitar su
hidratacin.
o Utilizar un vidrio de reloj, papel aluminio o charolitas especiales para pesar,
tomando las muestras con esptulas limpias. Despus de utilizar la balanza, limpiar
el platillo, con un pincel.
o Si no se sabe utilizar algn equipo, solicitar apoyo al profesor antes de iniciar el
experimento.
o Todos lo anterior con la intencin de evitar accidentes y exposiciones a material
infeccioso.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 5

 o A cada equipo le corresponder esterilizar, lavar material utilizado en cada una de
las prcticas. Si el material no es lavado los integrantes del equipo se vern
afectados en su calificacin.

INDIVIDUAL
o Manual de laboratorio engargolado
o Asa bacteriolgica
o Marcador Indeleble

POR EQUIPO
o Un rollo de masking-tape ancho
o Una caja de porta objetos
o Un barniz de uas transparente
o Un metro de franela
o Encendedor
o Tijeras de punta recta
o Jabn para manos lquido
o Paquete de sanitas
o Regla graduada
o Pinza de punta roma
o Ligas

3. EVALUACIN DE LAS PRCTICAS DE LABORATORIO.

El laboratorio se evala conforme a lo establecido en el programa de la materia.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 6

PRACTICA I
DEGRADACIN DE COLORANTE AZUL INDIGO POR El GENERO
Trichoderma.
INTRODUCCIN
La fabricacin de los diversos productos textiles se lleva a cabo por varios procesos, en el
teido de dichos productos se generan grandes volmenes de aguas residuales que van de 5
hasta 1500 mg L-1 de concentracin, ya que el colorante no se queda completamente en las
fibras. Estos residuos tienen un impacto negativo en el medio ambiente, debido a que los
colorantes son sustancias altamente recalcitrantes, por ser molculas con una gran
estabilidad qumica. Adems son sustancias txicas y no son biodegradables.
Frecuentemente los colorantes son vertidos en cuerpos de agua, en sitios donde no se
cuentan con plantas tratadoras de aguas residuales por sus altos costos, y por la falta de
conocimiento sobre los daos que pueden provocar los efluentes contaminados con
colorantes a la flora y fauna acutica. Estas sustancias pueden absorber la luz de sol
impidiendo que organismos tales como bacterias puedan desarrollarse y que la flora
acutica pueda llevar a cabo la fotosntesis (Las alternativas biolgicas para el tratamiento
de sitios contaminados por colorantes se basa en la bioremediacin, de la cual surge una
amplia variedad de procesos como son la biosorcin, biodegradacin y la biodegradacin
por mtodos enzimticos. Los hongos son una estrategia econmica y competitiva a los
procesos fisicoqumicos para el tratamiento de aguas residuales con colorantes. Los
miembros del gnero Trichoderma tienen el potencial de sintetizar y liberar diversas
enzimas como polisacarasas, celulasas, xilanasas y quitinasas. Esta capacidad enzimtica se
ha tratado de aprovechar en procesos industriales.
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DEL COLORANTE AZUL NDIGO
Con respecto a las propiedades fisicoqumicas del azul ndigo, este colorante tambin
conocido como indigotina, indigofera, indigotinsulfato o azul cido 74, su nombre
sistemtico es 3,3-dioxo-2,2-bi-indolildeno-5,5-disulfato disdico, formula qumica
C16H10N2O2 (Fig. 1). Se sublima en forma de vapor por encima de 170 C y su punto de
fusin es 390-392 C. La mxima absorbancia de este colorante en un disolvente polar tal
como el dimetil sulfxido es 620 nm, es muy estable a la luz y al calor.

Figura 1. Estructura qumica del colorante azul ndigo

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 7

La toxicidad de azul ndigo es poco conocido en la literatura, no obstante se han realizado
algunos estudios para conocer los efectos txicos de este colorante, sobre diversos
organismos como ratas, perros y humanos (pruebas de inhalacin y drmicas), los
resultados de estos experimentos demostraron no tener grandes efectos txicos y no
generaron efectos crnicos en las dosis utilizadas. Sin embargo, es importante tener claro
que todas las sustancias son txicas dependiendo de la concentracin y del tiempo de
exposicin.
FUNDAMENTO
La preparacin del medio de cultivo ser de acuerdo a la norma NOM-065-SSA1-1993 que
establece las especificaciones sanitarias y generalidades de los medios de cultivo. El
manejo y mantenimiento de las cepas se regir bajo la norma NOM-010-SEMARNAT-
1996 establece los procedimientos criterios y especificaciones para realizar el
aprovechamiento transporte y mantenimiento de hongos. Son 4 normas elaboradas por la
CNA y el Instituto Nacional de Ecologa que regulan la contaminacin del agua que
proviene de todas las ramas industriales y del drenaje urbano y municipal NOM-001-
ECOL-1996, NOM-002-ECOL-1996, NOM-002-ECOL-1996 y NOM-127-SSA1-1994.
OBJETIVO
Analizar la factibilidad de un proceso de biorremediacin, en aguas residuales de la
industria textil a traves del hongo ligninolitico Trichoderma sp.

MATERIAL Y EQUIPO
o Agar papa dextrosa
o Balanza analtica
o Matraz Erlenmeyer de 250 ml
o Placas petri con tapa de 100 X 15 mm
o Tubos de vidrio de 15 ml con tapa de 17 x 100 mm
o Autoclave
o Incubadora
o Colorante azul ndigo
o Recipientes de cristal seis (para realizar la prueba 2)
o Espectrofotmetro

METODOLOGA
Aislamiento, siembra y conservacin del hongo ligninolitico.
1 Aislamiento: Los hongos ligninoliticos 2 cepas de Trichoderma sp. se someteran a
un lavado con agua destilada esteril para eliminar impurezas de las muestras.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 8

 2 Siembra: se utilizara el medio agar papa dextrosa (39 gramos en un litro) que sirve
para aislar todo tipo de hongos. Se esteriliza a una presin de 103 kPa y una
temperatura de 121C, con temperatura y presin constante durante 15 a 20
minutos. Por ltimo en la cmara de flujo laminar, el medio preparado se coloca en
las cajas petri y se realiza la siembra de las muestras de hongos ligninolticos.
3 Conservacin: Se procede a aislar las muestras en cajas petri y tubos de ensayo
aplicando la tcnica en pico de flauta para asegurar el mantenimiento de las cepas
puras. La cepa de hongo ligninolitico se deja crecer a temperatura ambiente durante
siete dias.
PRUEBA 1
Colorante indigo disuelto en agar.
En cajas petri con medio agar papa dextrosa colocamos el contaminante colorante azul
ndigo(.5, 1 y 1.5 ppm) como medio de desarrollo fngico seguido de la respectiva cepa
aislada a valorar. Para reportar resultados se realizara el clculo de la velocidad de
crecimiento micelial. Las ppm corresponden a los mg de colorante en un litro.Ejemplo:
Para calcular los ppm se divide el peso en mg por el volumen en litros, por ejemplo, una
disolucin de 15 gramos (g) en 3 metros cbicos de agua.

5g x 1000 mg/g= 15000 mg

3m3 1000 l/m3= 3000 l
Concentracin: 15000 / 3000 = 5 mg/l = 5 ppm

PRUEBA 2
Biorremediacin del colorante ndigo en aguas residuales de la industria textil a traves
de hongos ligninolticos.
Las muestras para biorremediacin seran regidas por las siguientes variables e indicadores:
Temperatura ambiente en grados centigrados, pH, concentracin del colorante en ppm y
velocidad de decoloracin en das la actividad microbiolgica se registrara durante 8 das.
Los resultados seran reportados en tabla y grficos.
RESULTADOS
DISCUSIN DE RESULTADOS
CONCLUSION
BIBLIOGRAFA
Coronel, V., Tenesaca, M. (2013). Estudio de la factibilidad de un proceso de
biorremediacin del colorante ndigo presente en aguas residuales de la industria textil en la
MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 9
ciudad de Cuenca, a travs de hongos ligninolticos.Licenciatura. Universidad Politcnica
Salesiana Sede Cuenca.
Dvila Gustavo & Rafael Vzquez. 2006. Enzimas Ligninolticas fngicas para fines
ambientales. Departamento de Bioqumica, Facultad de medicina, Universidad Nacional
Autnoma de Mxico.
Hadibarata, T., Yusoff, A.R.M., Kristanti, R.A., 2012. Decolorization and metabolism of
anthraquionone-type dye by laccase of white-rot fungi Polyporus sp. S133. Water Air Soil
Pollution. 223, 933-941.
Kandelbauer, A., Guebitz, G.M., 2005. Bioremediation for the decolorization of textile
dyes a review. In: Lichtfouse, E., Schwarzbauer, J., Robert, D., Environmental Chemistry,
Springer Berlin Heidelberg, 269-288.
Rannung, U., Bramsteat, H., Nilsson, U., 1992. The presence of genotoxic and bioactive
components in indigo dyed fabrics- a possible health risk? Mutation Research. 282, 219-
225.
CUESTIONARIO
1. Que otros gneros de hongos tienen la capacidad enzimtica para degradar colorantes?
2. Investiga el proceso por el cual Trichoderma puede degradar el colorante azul indigo.
3.Que otra tcnica de bioremediacin podrias aplicar en el caso de aguas residuals?

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 10

Prctica II

PREPARACIN DE MUESTRA DE UN SUELO Y CONTAMINACIN

DE SUELO

INTRODUCCIN
Uno de los objetivos del muestreo y anlisis de suelo es el diagnosticar su estado
nutrimental con la finalidad de hacer una recomendacin sobre la cantidad y tipo de
fertilizante o algn mejorador que ser aplicado en un terreno para un determinado cultivo
o suelo.
Realizar un buen muestro de suelo es una condicin fundamental para lograr un anlisis
representativo de la situacin de campo que se requiere evaluar. Constituye el primer paso
del anlisis qumico y fsico, y el cuidado que se tenga en la toma de la muestra del suelo,
determinar en gran parte la validez de los resultados. Es un procedimiento para la
obtencin de una o ms muestras representativas en un terreno. Mediante el muestreo la
heterogeneidad de los parmetros del suelo a ser evaluados; pH, humedad, conductividad y
materia orgnica pueden ser estimados en su valor promedio, colectando un determinado
nmero de muestras o de muestras compuestas derivadas de submuestras.
FUNDAMENTO
La preparacin de muestreo del suelo siguiendo el mtodo de la NOM-021-RECNAT-2000,
nos indica que el suelo debe tener una forma de torta circular para obtener las muestras
requeridas y, posteriormente, caracterizarlo.

OBJETIVO
o Aplicar la NOM-021-RECNAT-2000 para la preparacin de una muestra de suelo
o Preparar un suelo contaminado, realizar los anlisis qumicos correspondientes y
aplicar una tcnica de biorremediacin.

MATERIAL Y EQUIPO
o Bolsa de basura negra
o Balanza analtica

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 11

 o Pala
o Recipiente de plstico (tina)
o Tamiz
o Diesel

METODOLOGA
1. Preparacin de la muestra de suelo
Para realizar los anlisis del suelo se debe llevar a cabo una preparacin de las muestras,
primeramente el suelo se coloca sobre una bolsa de plstico y se homogeniza (Fig.1.A),
retirando rocas y material orgnico, despus se forma una especie de crculo para realizar el
cuarteo (Fig.1. B.C) y se eliminan dos de las partes diagonalmente opuestas (Fig.1. D.E).
Se sigue mezclando y homogeneizando el material restante y cuartendolo sucesivamente
hasta reducir la muestra al tamao requerido para las pruebas. Posteriormente se tamiza la
muestra (Fig. 1.F).
Al trmino de la preparacin de la muestra de suelo se limpia cuidadosamente el lugar de
trabajo.
Figura 1. Preparacin de la muestra de suelo A) homogenizado, B y C) cuarteo, D y E)
eliminacin de suelo y F) tamizado.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 12

CONTAMINACIN DEL SUELO
Pesar la muestra obtenida de la preparacin y apartar una parte del suelo para usar como
suelo control aproximadamente de 500g.
Contaminar el suelo restante con 20 g/ kg de diesel y homogenizar (aproximadamente de 1
a 2 kg). Almacenar el suelo en una bolsa de plstico.

El suelo contaminado se almacena en una bolsa de plstico por 24 horas y posteriormente

se iniciaran los anlisis qumicos como determinacin de pH, contenido de humedad y
materia orgnica.
RESULTADOS
DISCUSIN
CONCLUSIN
BIBLIOGRAFA
Fernndez, L., Rojas, N., Roldn, T. and Ramrez, M. (2006). Manual de tcnicas de
anlisis de suelos. 1st ed. [ebook] Mxico: Secretara de Medio Ambiente y Recursos
Naturales, Instituto Nacional de Ecologa, pp.3-25. Available at:
http://www.inecc.gob.mx/descargas/publicaciones/509.pdf [Accessed 2 Jun. 2016].

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 13

INECC-CCA, (2010). Gua para Elaborar Planes de Muestreo Representativos. Mxico
p.43
Lpez, Raymond Chang, Kenneth A. Goldsby ; revisin tcnica, Rodolfo lvarez Manzo,
Silvia Ponce (2013). Qumica (11a. ed. edicin). Mxico; Madrid [etc.]: MacGraw-Hill.
ISBN 978-607-15-0928-4.
SEMARNAT. (2002). Nom-021-Semarnat-2000. Diario Oficial de La Federacin, 85.
SEMARNAT (2010) Gua Tcnica para orientar en la Elaboracin de Estudios de
Caracterizacin de Sitios Contaminados. Mxico, 217 p.

CUESTIONARIO

1. Cules son los objetivos de cuartear la muestra?

2. Cmo se determina la concentracin del contaminante en el suelo contaminado?
3. Cmo se elige el contaminante para cuantificar la contaminacin presente en el suelo?

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 14

Datos de la muestra de suelo

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 15

Prctica III

DETERMINACIN DE HUMEDAD EN SUELO

INTRODUCCIN
La cantidad de humedad en el suelo es tambin de gran importancia en la hidrologa,
silvicultura, etc. En consecuencia, mucho esfuerzo se ha invertido en los ltimos 50 aos en
el desarrollo de mtodos y equipos de medida la humedad del suelo en condiciones de
campo.
Determinacin de la humedad del suelo es una de las medidas ms difciles en el campo de
la hidrologa. La medicin de la humedad del suelo oscila entre el mtodo de sentir el suelo
para el uso de equipo electrnico, y el uso de sustancias radiactivas. El desarrollo de
equipos se ha dirigido principalmente hacia instrumentos que miden continuamente los
cambios en el contenido de humedad en un solo punto de muestreo.
La importancia del contenido de agua que presenta un suelo representa junto con la
cantidad de aire, una de las caractersticas ms importantes para explicar el comportamiento
de este (especialmente en aquellos de textura ms fina), como por ejemplo cambios de
volumen, cohesin, estabilidad mecnica.

FUNDAMENTO
Mtodo gravimtrico para la determinacin del contenido de humedad de los suelos, sean
estos orgnicos o minerales, este mtodo se basa en la medicin o determinacin de la
cantidad de agua expresada en gramos que contiene una muestra de suelo, esta masa de
agua hace referencia de la masa de suelo seco de la muestra. La determinacin de la masa
de agua se realiza por la diferencia en peso entre la masa de suelo hmedo y la masa de
suelo seco. Se considera como suelo seco aqul secado a la estufa a 105C hasta obtener un
peso constante.

MATERIAL Y EQUIPO
Botes de aluminio o equivalente
Pinzas
Estufa

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 16

Balanza analtica
Desecadores

METODOLOGIA
1 El mtodo tradicional de determinacin de la humedad del suelo en laboratorio, es
por medio del secado a horno, donde la humedad de un suelo es la relacin
expresada en porcentaje entre el peso del agua existente en una determinada masa
de suelo y el peso de las partculas slidas, o sea:
w = (Ww / Ws ) * 100 ( % ) donde:
w = contenido de humedad expresado en %
W w = peso del agua existente en la masa de suelo
Ws = peso de las partculas slidas
2 Pesar el recipiente con el suelo hmedo (PB + Psh)
3 Tarar el recipiente a usar una vez que est limpio y seco a peso constante
4 Colocar 30g o una alcuota de suelo en el bote, evitando no ensuciar externamente
5 Introducir el recipiente a la estufa a una temperatura de 105C
6 Despus de 4 horas sacar el recipiente de la estufa y pesarlo, este peso ser el peso
del bote ms el peso del suelo seco (PB+ Pss), Hasta peso constante

Donde:
PB Peso del bote
PsH Peso de suelo hmedo
Pss Peso de suelo seco
Ph Peso humedad
RESULTADOS
DISCUSIN
CONCLUSIN
BIBLIOGRAFA
Susan C. Wilson & Kevin C. Jones . (3/junio/1992). BIOREMEDIATION OF SOIL
CONTAMINATED WITH POLYNUCLEAR AROMATIC HYDROCARBONS (PAHs): .

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 17

1/junio/2016, de Environmental Pollution Sitio web:
https://www.researchgate.net/profile/Kevin_Jones15/publication/8611478_Bioremediation
_of_Soil_Contaminated_With_Polynuclear_Aromatic_Hydrocarbons_(PAHs)_A_Review/l
inks/00463531defa464ac7000.
Zamora A., Ramos J., Arias Marianela. (2012). Efecto de la contaminacin por
hidrocarburos sobre algunas propiedades qumicas y microbiolgicas de un suelo de
sabana.. 1/junio/2016, de Bioagro Sitio web:
http://www.ucla.edu.ve/bioagro/Rev24(1)/1.%20Efecto%20de%20la%20contaminaci%C3
%B3n.pdf.
Business Dictionary. Sitio web:
http://www.businessdictionary.com/definition/hydrocarbon.html.
Cassio Luiselli Fernandez. (31/DICIEMBRE/2002). Norma Oficial Mexicana NOM-021-
SEMARNAT-2000. 01/junio/2016, de Secretaria de medio ambiente y recursos naturales
Sitio
CUESTIONARIO
1. Cmo se determina el peso constante?
2. Qu se usa en los desecadores para saber que estn en condicin de enfriar las muestras
sin absorber agua?
3. Si tuvieras un suelo donde es un 50% de agua y una 50% de slidos, como tomas la
muestra?

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 18

Practica IV
DETERMINACIN DE LA MATERIA ORGNICA DEL SUELO
INTRODUCCIN
La materia orgnica de suelo est compuesta por compuestos orgnicos que provienen de
los restos de organismos que alguna vez estuvieron vivos, tales como plantas y animales y
sus productos de residuo en el ambiente natural. Las estructuras bsicas estn formadas de
celulosa, tanino, cutina, y lignina, junto con varias otras protenas, lpidos, y azcares. Es
muy importante en el movimiento de nutrientes en el medio ambiente y juega un rol en la
retencin del agua en la superficie del planeta Tierra.
Es un indicador muy importante en la calidad del suelo pues de esta depende en desarrollo
de microorganismos. La materia orgnica del suelo es fundamental para mantener la
estructura del suelo, retener el agua necesaria y actuar como reserva nutritiva. Ciertos usos
del suelo pueden disminuir de forma drstica el contenido de materia orgnica del suelo.
Las causas principales que desencadenan este proceso son: la agricultura intensiva y la
quema de los residuos de las cosechas in situ, desechos industriales, residuos de
hidrocarburos etc.
FUNDAMENTO
La determinacin de materia orgnica del suelo se evala a travs del contenido de carbono
orgnico con el mtodo de Walkley & Black, por oxidacin qumica de la materia orgnica.
La determinacin de materia orgnica mediante el mtodo de Walkley & black se basa en
una oxidacin incompleta del carbono orgnico por una mezcla oxidante de dicromato de
potasio (K2Cr2O7) y un cido sulfrico (H2SO4) acentuada por el calor de dilucin acuosa
del H2SO4 dependiendo de la temperatura inicial de los reactivos, contenido de materia
orgnica y tamao del recipiente de la reaccin. La cantidad de agente oxidante consumido
en esta, se determina por foto colorimetra midiendo la intensidad del color verde de los
iones Cr+6 amarillos del dicromato inicial y comparando con las lecturas de una curva de
calibracin preparada en la misma forma con patrones conocidos de solucin de sacarosa o
glucosa. Los iones Cr+3 producidos son proporcionales a la cantidad de carbono oxidado.
MATERIAL Y EQUIPO
o Dicromato de potasio al 0.166M o 1N. Disolver 48.82 g de dicromato de postasio
en agua destilada aforando a 100 Ml en matraz volumtrico
o cido sulfrico concentrado GRA
o cido fosfrico concentrado GRA
o Indicador de difenilamina. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 mL de agua y
aadir 100 mL de cido sulfrico concentrado.
o Sulfato ferroso 1.0M (aproximadamente). Disolver 278g de sulfato ferroso
heptahidratado en agua a la que previamente se le aadieron 80mL de cido

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 19

 sulfrico concentrado, enfriar y diluir a un litro. Valorar con dicromato de potasio
1N antes de realizar la determinacin.
o Matraces Erlenmeyer de 500mL
o Bureta para dicromato de potasio de 50mL
o Pipeta volumtrica de 10mL
o Probeta de vidrio de 25 mL

METODOLOGA
1. Para preparar las muestras, control, estndares pesar 0.5 g de suelo previamente
secado
2. Adicionarlo en un matraz de 500mL. Procesar un blanco con reactivo por triplicado.
3. Adicionar 10 mL de dicromato de potasio GRA. Adicionar lentamente y por las
paredes del matraz 20 ml de cido sulfrico concentrado GRA a la suspensin,
agitar por un minuto y colocarlo sobre una franela evitando tocar la lmina fra de
acero porque se puede romper el fondo del matraz. Dejarla reposar durante 30
minutos
4. Adicionar 200 mL de agua destilada lentamente y por las paredes del matraz.
5. Aadir lentamente por las paredes 10 ml de cido fosfrico concentrado grado
reactivo
6. Adicionar 5 gotas de indicador de indicador de difenilamina.
7. Titular con la disolucin de sulfato ferroso hasta llegar a una tonalidad verde
esmeralda. Anotar el volumen usado en cada titulacin.
8. Aplicar las siguientes frmulas para calcular el porcentaje de materia orgnica
9. %C orgnico= (B-T/g)(N) (0.39 mcf
10. B Volumen de sulfato ferroso usado para la titulacin del blanco
11. T Volumen de sulfato ferroso usado para titular la muestra
12. N Normalidad real del Sulfato ferroso
13. 0.39 Factor de correccin
14. mcf factor de correccin de humedad. Solo si es necesario
15. %Materia orgnico= % carbono orgnico x 1.724
16. Realizar la discusin de resultados con la tabla comparativa indicada en la norma

DISCUSIN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
Alcanzar J.G. Ectchevers B .J .D y Aguilar S.A. Los anlisis fsicos y qumicos. Su
aplicacin en agronoma. Centro de Edafologa. Colegio de postgraduados. Montecillo,
Mxico.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 20

Cano Garca Adn, MANUAL DE PRCTICAS DE LA MATERIA DE EDAFOLOGIA,
Revisado el 17 de Junio de 2016.
Determinacin de Materia Orgnica,
http://www.sian.inia.gob.ve/repositorio/manuales_suelos/analisis_suelos_fertiidad/3.1.pdf,
Revisado el 16 de Junio de 2016.
Lpez F. J. y Lpez M.J. 1978. El diagnostico de suelos y plantas. Mtodos de campo y
laboratorio 4ta. Edicin. Editorial Mundi-prensa. Espaa.
CUESTIONARIO
1. Cmo se clasific el suelo, con base a su contenido de materia orgnica?
2. Cul fue la normalidad real del Sulfato ferroso?
3. Por qu es importante la determinacin de este parmetro?

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 21

Prctica V

DETERMINACIN DE GRASAS Y ACEITES POR METODO SOXHLET

INTRODUCCIN
La determinacin de grasa es un indicador de contaminacin por aceites o hidrocarburos,
dependiendo de la concentracin en suelo es la contaminacin si se encuentra arriba del
mximo permisible. El suelo en su ambiente natural contiene fracciones mnimas de grasa
pero estas no actan como contaminante sino como residuos de materia orgnica en
descomposicin.
El mtodo de Soxhlet es aplicable en muestra de alimentos en general y en alimentos que
no han sido sometidos a tratamientos trmicos.
Para la determinacin de grasas y aceites es aplicable para determinar lpidos biolgicos,
hidrocarburos ya sea fracciones pesadas o relativamente polares del petrleo y cuando los
niveles de grasas no voltiles pueden alterar el lmite de solubilidad del solvente Los
jabones metlicos solubles son hidrolizados por acidificacin. Slo los aceites y las grasas
slidas o viscosas presentes se separan de la muestra lquida por filtracin sobre una matriz
slida absorbente. Despus de la extraccin en un aparato Soxhlet con solvente orgnico, se
pesa el residuo que queda de la evaporacin del solvente para determinar el contenido en
grasa y aceite.
FUNDAMENTO
El mtodo Soxhlet se puede aplicar a diversos tipos de muestra. Una cantidad
homogenizada y seca, medida se somete a una extraccin. Despus se realiza la
determinacin de materia grasa libre por Soxhlet.
El mtodo es aplicable en aguas residuales o afluentes tratados que contengan estos
materiales, aunque la complejidad de la muestra puede producir resultados desviados a
causa de la falta de especificidad

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 22

MATERIALES Y EQUIPO
o Sistema extractor Soxhlet
o Bao termorregulado
o Balanza analtica
o Papel filtro o dedal de celulosa
o Estufa
o Manto calefactor
o Embudo de vidrio
o Papel filtro
o Reactivos:
o Hexano
METODOLOGA
1 Pesar 1 gramo de muestra de suelo contaminado y muestra con un tratamiento y
guardarlo en el papel filtro previamente pesado. Despus secar el matraz de
extraccin (en caso de que est hmedo) y pesarlo (Registrar m1).

2 Poner el matraz de extraccin en el sistema Soxhlet y adicionar el solvente

(Hexano) al matraz, y los sobrecitos de muestra meterlos en el tubo de extraccin.

3 Extraer la muestra con el solvente por 6 a 8 horas, sin embargo, en esta prctica se
llevar la extraccin solo 2 horas debido a la designacin del tiempo de laboratorio
de la materia.

4 Una vez terminada la extraccin recuperar el solvente por evaporacin en rotavapor

o bao mara bajo campana. Hasta que no se detecte olor al solvente.

CLCULOS
El resultado debe expresarse en mg de HTP/kg de suelo seco, aplicando la siguiente
formula HTPs=(R_B-R_A)* (FC)/ (P*FH)
Donde:

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 23

HTPs (mg kg-1 de s.s.) = hidrocarburos totales del petrleo en mg/ kg de suelo seco.
RA = peso (mg) del recipiente vaco a peso constante.
RB = peso (mg) del recipiente con el extracto orgnico concentrado.
P = cantidad de suelo extrado (g).
FH = factor de correccin de humedad (1-(%humedad/100)).
FC = factor de correccin para transformar a kg de s.s. = 1 000
RESULTADOS
DISCUSION
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
Acar, Y.B., and Alshawabkeh, A.N. 1993. Principles of electrokinetic remediation.
Environmental Science and Technology.
Aceves, E. 1979. Los terrenos ensalitrados y los mtodos para su recuperacin. Universidad
Autnoma de Chapingo, Mxico.
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Environmental pollution
Irene Ortiz Bernad Juana Sanz Garca. Tcnicas de recuperacin contaminados. Fundacin
para el conocimiento Madrid
Muoz, I. D. J.; Mendoza, C. A.; Lpez, G. F.; Soler, A. A.; Hernndez, M. M. (2000).
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Total petroleum hydrocarbon criteria working group series. Association of American
Railroads BP Oil Company. United States Air Force, Armstrong Laboratory, Occupational
Medicine Division.

MANUAL DE PRACTICAS DE BIORREMEDIACIN 24

PROYECTOS DE BIORREMEDIACIN

Aislamiento y caracterizacin de cepas degradadoras de contaminantes orgnicos

persistentes (pesticidas, hidrocarburos, PCBs).
Aislamiento y caracterizacin de cepas resistentes a metales pesados.
Diseo y caracterizacin de cepas modificadas genticamente para la
bioremediacin de suelos contaminados (metales pesados, compuestos aromticos)
Degradacin bacteriana de compuestos aromticos.
Biorremediacin de herbicidas en suelos agrcolas.
Biorremediacin de suelos contaminados con metales pesados.
Biorremediacin (bioaumentacin y biestimulacin) de suelos contaminados con
hidrocarburos del petrleo.
Ecologa microbiana: Anlisis de comunidades microbianas en suelos.
Estudio de microorganismos del ciclo de nitrgeno (nitrificacin).

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