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ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

INFORME FINAL DEL EXPERIMENTO N01

CURSO:
LABORATORIO DE INGENIERA DE BIOPROCESOS
DOCENTE:
CASTILLO CALDERN AUGUSTO

TEMA:
INGENIERA DEL CULTIVO CELULAR POR LOTES DE PICHIA
STIPITIS NRRL Y-7124
INTEGRANTES:

FARFN ZAPATA JAVIER

NOLASCO MALDONADO ARNOLD
RODRGUEZ TOMAS ANDY
VSQUEZ BACILIO EVELYN FABIOLA
 2017

INDICE

RESUMEN

Se llev acabo el desarrollo del cultivo celular de la cepa Pichia stipitis NRRL Y
7124, aplicando toda la metodologa de un diseo de cultivo por lote con la
manipulacin desde su estado inactivo en agar. Se sigui una serie de procedimientos
secuenciales tales como activacin en el shaker, inoculacin en agar,
proporcionndoles todas las condiciones y facilidades para que pueda crecer, asimismo
siguiendo con la secuencia se inoculo en un medio denominado rico (15ml), el cual
contiene todos los nutrientes que esta bacteria requiere para su ptimo desarrollo.
Se evidencio el crecimiento en el medio rico, la totalidad de este medio es diluido
dentro de otro medio al que se denomina mnimo (100 ml) por sus limitaciones en
cuanto a nutrientes, ya que este contiene solo los componentes necesarios para que el
microorganismo pueda subsistir, tales como fuente de carbono que en nuestro caso fue
Xilosa.
Se procedi a observar y comparar como se va produciendo el crecimiento celular con
los nutrientes exactamente necesarios y establecidos para tal efecto y al mismo tiempo
como va disminuyendo el sustrato en este caso principalmente la Xilosa, por el
consumo que realiza el microorganismo como fuente principal para su desarrollo. Y
esto es posible determinar haciendo evaluaciones tales como crecimiento de biomasa
mediante absorbancia (640 nm en el espectrofotmetro) y el ensayo con reactivo DNS
para el caso del sustrato con una absorbancia de 540 nm en el espectrofotmetro y la
generacin de productos como el etanol el cual ser medido mediante CG
(cromatografa de gases) usando como factor externo n-propanol.
Los tres aspectos (crecimiento de biomasa, consumo de sustrato y generacin de
producto) evaluados en un determinado tiempo, son expresados en grficas adems de
ser comparados en una curva de calibrado para ambos casos, nos darn informacin
sobre el microorganismo tales como un max igual 0.37 h -1, un tiempo de crecimiento
(t) equivalente a 10 horas (Pichia stipitis NRRL Y 7124).

INTRODUCCION.

En la actualidad los productos bioindustrializados son obtenidos gracias al manejo y

conocimiento del crecimiento de microorganismos. La cintica de crecimiento y
produccin de metabolitos resulta fundamental en el tratamiento cuantitativo de los
procesos biotecnolgicos. Basta por ahora con establecer que el adecuado
conocimiento de la cintica de un cultivo permite la prediccin del transcurso de la
fermentacin, la evaluacin de velocidades, rendimiento, productividades y entrega
informacin til para establecer estrategias de produccin y optimizacin del proceso.
El comportamiento cintico de una poblacin est determinado por un complejo
conjunto de factores genticos y ambientales. Entre estos ltimos destacan las
llamadas condiciones de operacin (composicin del medio, temperatura, pH y otras) y
la modalidad de cultivo, entre las que distinguimos el cultivo por lotes.
Para ello la preparacin de medios de cultivo para estos microorganismos es un buen
punto de partida para conocer sobre su comportamiento as como tambin el
seguimiento de la cintica nos proporciona datos mucho ms prcticos y exactos sobre
la velocidad y caractersticas del crecimiento del microorganismo tratado.
En esta modalidad de cultivo se cargan los nutrientes inicialmente y luego se inocula
con una determinada cantidad de clulas viables. Se inicia as el cultivo, el que
transcurre de una forma caracterstica, dada por la llamada curva de crecimiento, hasta
que algn evento, tal como el agotamiento de un nutriente lo detiene.
Es as que para esta prctica hemos centrado nuestra atencin en el tratamiento de un
microorganismo (Pichia stipitis NRRL Y 7124), iniciando desde su resiembra, para
luego sembrarlo en medio rico procurando su rpida activacin, para que luego de un
determinado tiempo podamos sembrar la bacteria pero en un medio mnimo; es decir
con los mnimos requerimientos; en el cual es ms factible determinar la cintica de
crecimiento.

OBJETIVOS:

Objetivos Generales:

Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces

empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y 7124.

Determinacin de los parmetros cinticos de la cepa Pichia stipitis NRRL Y

7124.

Objetivos Especficos:
Disear el medio lquido de cultivo.

Activacin celular y desarrollo del inculo

Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.

Determinar de la cintica de consumo de la fuente de carbono.

Determinar la cintica de generacin de Etanol.

Determinacin del M y ks ; los rendimientos del nutriente limitante en clulas y

en etanol adems de las respectivas productividades en clulas y en etanol.

Evaluar el valor del pH durante la cintica.

 FUNDAMENTO TEORICO

MEDIO DE CULTIVO

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y

elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo
de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en
auttrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y
hetertrofos si utilizan carbono orgnico.
La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo
que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa
alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%),
azufre (entorno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K,
Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos.
Como ya se explic, los componentes de los medios constituyen los efectores
externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos
ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de
productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el
mantenimiento celular.
En el caso de Pichia stipitis NRRL Y 7124 la frmula elemental ms concreta es
CH1.79 O0.6 N0.17 esta composicin puede variar ligeramente en funcin de las
condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la frmula
elemental del microorganismo que se cultiva facilita la formulacin del medio de
cultivo ms adecuado para el mismo.

DISEO

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los

componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta
todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los
sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del
microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los
componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son
tambin importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previas y
posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos
bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos.
CRECIMIENTO MICROBIANO EN EL MEDIO LQUIDO

FIGURA N 1: CREIMIENTO MICROBIANO

Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que
se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose
una suspensin de clulas libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar
cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento
microbiano:
Fase logartmica o de adaptacin
Durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas
condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para
iniciar la fase de crecimiento exponencial.
Fase exponencial o logartmica:
En ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo.
Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del
medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con los
modelos matemticos que describiremos a continuacin.
 Fase estacionaria:
En ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del
cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de
la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de
metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente
esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la
fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano.
La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con
mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes
naturales.
Fase de muerte:
Se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

COMPOSICION DE MEDIOS

Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de carbono utilizadas en la

industria de la fermentacin. Por razones econmicas la glucosa la sacarosa puras
rara vez son utilizadas como nica fuente de carbono, excepto en los procesos que
exigen un control exacto de la fermentacin.
El extracto de malta
Un extracto acuoso de la cebada malteada (cebada germinada que produce
enzimas que hidrolizan el almidn), es un sustrato excelente para muchos hongos
filamentosos, levaduras y actinomicetos. El extracto seco de malta contiene
aproximadamente 90-92% de carbohidratos y est compuesto de hexosas (glucosa
y fructosa), disacridos (maltosa, sacarosa), trisacridos (maltotriosa) y dextrinas
(polmeros de glucosa 1,4 con ramificaciones 1,6). Las sustancias nitrogenadas
presentes en el extracto de malta incluyen protenas, pptidos, aminocidos,
purinas, pirimidinas y vitaminas. Los medios de cultivo que contienen extracto de
malta deben ser esterilizados cuidadosamente. Cuando existe sobrecalentamiento
se produce la reaccin de Maillard debido al bajo pH y a la alta proporcin de
azcares reductores. En esta conversin los grupos aminos de las aminas,
aminocidos (especialmente lisina) o las protenas reaccionan con los grupos
carbonilo de los azcares reductores, aldehdos y cetonas, lo que resulta en la
formacin de productos de condensacin de color tostado. Estos productos de
reaccin no son sustratos adecuados para los microorganismos.

Los extractos de levadura

Son excelentes sustratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura
contiene aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos.

Las peptonas (hidrolizados de protenas).

Las fuentes de peptonas incluyen la carne, casena, gelatina, queratina, semillas de
cacahuete, harina de soja, semillas de algodn y semillas de girasol. La
composicin de las peptonas vara dependiendo de su origen. El producto final est
tambin influido por el tipo de hidrlisis (cida o enzimtica) especialmente en relacin
a su contenido en triptfano

El agar
Presenta algunos inconvenientes; el principal consiste en ofrecer una aireacin
insuficiente que puede afectar el crecimiento de algunos tejidos. Por otra parte, la
composicin del agar es variable y, a veces, mal definida y podra aportar
oligoelementos que actan favorablemente sobre el crecimiento.
PARMETROS A TENER EN CUENTA EN UN MEDIO DE CULTIVO.

Aporte de nutrientes:
La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por
el rendimiento de un producto en especial adems de los requerimientos nutricionales
del microorganismo
pH:
Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las
sustancias producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:
Utilizacin de carbohidratos Produccin de cidos orgnicos Acidificacin

Catabolismo de protenas Produccin de materiales nitrogenados

Alcalinizacin

Estos cambios durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio

de cultivo, normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en el
medio substancias que acten como tampn (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje
del ptimo.

Necesidades de gases:
Los gases principales que afectan al desarrollo microbiano son el oxgeno y el dixido
de carbono. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxgeno libre
clasificndose en cuatro grupos:

Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre.

Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre.

Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como

en ausencia de oxgeno libre.

Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de

oxgeno libre.
Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitacin
constante o introduciendo aire estril en el medio.
Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la
exposicin de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de
anaerobiosis por los siguientes mtodos:
Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato
sdico, para disminuir el contenido de O2.

Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y reemplazndolo por N2 o CO2.

 Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de
cultivo inoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por
ejemplo: al encender una vela se transforma el oxgeno en dixido de carbono

Control de la temperatura:
El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas, y la velocidad con
que se efectan estas reacciones est influida por la temperatura, por lo que la
temperatura puede en parte determinar la velocidad de crecimiento de los
microorganismos.
El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada
reaccin qumica individual, de todas las que conforman el metabolismo, es
afectada por la temperatura, por lo que un incremento de sta resulta en una mayor
velocidad de reaccin.

Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que
catalizan las reacciones, con lo que la velocidad de reaccin decrece rpidamente.
La temperatura ptima resulta de la interaccin de estos dos efectos.

FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

El pH

Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de

microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual
mueren rpidamente.

Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de
crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH
del medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva
frente a otros microorganismos competidores.
La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la
liberacin de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico) por ciertos
microorganismos.

Biomasa

Se representa mediante una formula basada en su composicin elemental. De ella

es posible calcular un peso molecular promedio aparente, que es un submltiplo de
lo que sera el verdadero peso molecular calculado en base a la composicin de la
clula. La masa celular est correctamente representa por el producto del peso
molecular por el coeficiente estequiomtrico respectivo.

Para su desarrollo y reproduccin las clulas necesitan de ciertos nutrientes en el

medio. Estos nutrientes deben, a lo menos, aportar los elementos de los que
aquellos estn compuestos.

TABLA N 01: Composicin qumica de las levaduras

Se puede apreciar que cuantitativamente los elementos ms importantes son: el C,
H, O y N, luego viene un segundo grupo compuesto por Mg, S, P, Ca, Na y K;
mientras que los restantes elementos se encuentran presentes en niveles muy
bajos.

CRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO

Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los

cultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de
crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de
clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa.

Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido,
el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se
denomina unidad formadora de colonia (UFC) Se le denomina as a una clula
bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y
ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso
de tiempo.

Pichia stipitis NRRL Y 7124

Stipitis Pichia (aka stipitis Scheffersomyces) es una especie de levadura, que

pertenece a la "CUG Clade" de levaduras ascomycetous. Este es un grupo de
hongos que serina sustituto de leucina cuando se encuentra el codn CUG. S.

stipitis est lejanamente relacionado con la levadura de cerveza, Saccharomyces

cerevisiae, que utiliza el sistema codn convencional. Encontrado, entre otros
lugares, en los intestinos de los escarabajos passalid, S. stipitis es capaz tanto de
fermentacin aerbica limitada y oxgeno, y tiene la capacidad natural de la mejor
conocida de cualquier levadura para fermentar directamente xilosa, la conversin a
etanol, una potencial valor econmico rasgo. La xilosa es un azcar hemicelulosa
se encuentra en todas las plantas angiospermas. Como tal xilosa constituye el
segundo resto de carbohidrato ms abundante en la naturaleza. La xilosa puede
ser producido a partir de madera o residuos agrcolas a travs de la hidrlisis
automtica o cido. La produccin de etanol a partir de tales residuos
lignocelulsicos no compite con la produccin de alimentos a travs del consumo
de grano.

Dada la abundancia de xilosa y su potencial para la bioconversin de materiales

lignocelulsicos a los combustibles renovables, Pichia stipitis se ha estudiado
ampliamente. La secuenciacin completa de su genoma se anunci en 2007. [1]
cepas nativas de S. stipitis han demostrado producir 50 g / l de etanol en 48 h a
partir de xilosa pura en medio mnimo definido usando urea como fuente de
nitrgeno. S. stipitis es una levadura haploide predominantemente pero las cepas
puede ser inducido a aparearse con ellos mismos o con otras cepas de S. stipitis
por cultivo de clulas en medio mnimo que contiene cantidades limitantes de
fuentes de carbono y nitrgeno. Una amplia caja de herramientas gentica se ha
desarrollado para S. stipitis que incluye marcadores de resistencia a frmacos
sintticos para gen nourseotricina acetiltransferasa (NAT1), higromicina (HPH) y
una forma sinttica de Cre que permite la extirpacin de los marcadores. Cepas
manipuladas genticamente de S. stipitis producirn 57 g / l de etanol a partir de
xilosa pura en menos de 48 h y cepas adaptadas producirn cantidades
significativas de etanol a partir de hidrolizados cidos de lignocelulosa.

pH:

Este es un factor importante en la fermentacin, debido a su importancia en el

control de la contaminacin bacteriana como tambin al efecto en el crecimiento de
las levaduras, en la velocidad de fermentacin y en la formacin de alcohol.
Durante la fermentacin la levadura toma el nitrgeno de los aminocidos
orgnicos, perdiendo su carcter anftero y pasando a cidos, lo cual origina una
disminucin del pH del medio. Cuanto ms bajo el pH del medio, tanto menor el
peligro de infeccin, pero si se trabaja con pH muy bajos la fermentacin es muy
lenta, ya que la levadura no se desarrolla de la forma conveniente.
 Concentracin de nutrientes:

Como ya se dijo, la presencia de sustancias nutritivas adecuadas es una condicin

necesaria para el crecimiento y desarrollo de la levadura, siendo su concentracin
un factor primordial en la actividad vital de la levadura. Las principales sustancias
nutritivas y las ms influyentes son el nitrgeno, fsforo, azufre, vitaminas y trazas
de algunos elementos.

Aireacin:

El aire es un factor decisivo en toda fermentacin, ya que su presencia hace ms

vigoroso el crecimiento de la levadura. Hay tres puntos de vista de gran importancia
que favorecen el rendimiento debido a una buena aireacin:

El libre y constante abastecimiento de oxgeno de cada clula en el sustrato.

La eliminacin rpida del CO2, porque en concentraciones relativamente
pequeas inhibe el crecimiento.
El mantener en suspensin las clulas de levadura, a fin de que en la
tumultosidad de la mezcla se renueve constantemente el contacto entre la
membrana celular y el sustrato nutritivo.
En este trabajo se ha utilizado el microorganismo Pichia stipitis, tambin llamado
Scheffersomyces stipitis, debido a sus buenas cualidades, ya que puede fermentar
glucosa y xilosa con buenos rendimientos de etanol. Por tanto, se evita la
complejidad de utilizar un microorganismo modificado genticamente o un
cocultivo. La figura siguiente muestra la ruta metablica de obtencin de etanol
caracterstica de la levadura P. stipitis a partir de glucosa y xilosa.
FIGURA N 02. Ruta metablica de la levadura Pichia stipitis a partir de glucosa y
xilosa (Fuente: Pea, 2008)

MATERIALES Y METODOS

Preparacin del medio solido de mantencin (50ml)

 Materiales
02 Pipetas de 10 ml.

07 Tubos de ensayo
con tapas

Varilla de vidrio

Matraz Erlenmeyer 250 ml

Probeta graduada

Mechero Bunsen

Esptula grande y pequea

Guantes.

06 Capachos de aluminio

Vaso de precipitados 250ml

Instrumentos e Equipos

Balanza analtica
 Olla a presin (autoclave)

Mechero Bunsen

Reactivos

Componentes segn la tabla N1

Extracto de levadura 3g/L de solucin

Peptona 5g/L de solucin

Extracto de malta 3g/L

Agar 20g/L de sokucin

Glucosa 10g/L

Muestra: Pichia sttpitis NRRL Y 7124

 Sustrato: Xilosae

Agua destilada

Agua destilada

Preparacin de la curva de calibrado DNS

Hidrolisis de la xilosa

a) Materiales

7 tubos de ensayo con tapa

Gradilla

Micro pipeta con punta

2 pipetas para NaOH y HCl

2 vasos precipitados (50ml y 500ml)

Papel aluminio

Olla con trpode

Hielo
b) Instrumentos y equipos
 Mechero Bunsen

Agitador Maxi Mix

Bao Maria

c) Reactivos

HClcc

Sacarosa

NaOH 1.7M

Agua destilada
DNS

a) Materiales

7 tubos de ensayo con tapa

Gradilla

Micro pipeta con puntas

Vasos precipitado
 Olla con trpode
Hielo

Celdas

Papel toalla

b) Instrumentos y equipos

Mechero Bunsen

Agitador Maxi Mix

Espectrofotmetro

c) Reactivos
DNS
Agua destilada

Preparacin del medio de activacin (20ml)

 a) Materiales

1 Matraz de 125ml

2 tubos de ensayo con tapa

1 pipeta de 5ml

Gradilla

b) Instrumentos e Equipos

Autoclave

Mechero bunsen

c) Reactivos

Glucosa

Extracto de levadura
 Extracto de malta

Solucin de sales

Agua destilada
1 Matraz de 500ml

2 tubos de ensayo con tapa

Gradilla

b) Instrumentos e Equipos

Autoclave

Mechero bunsen

c) Reactivos

Sacarosa

Extracto de levadura

Solucin de sales
 Tampn citrato

Agua destilada
Cintica de cultivo
d) Materiales

Alcohol 96

Algodn

Jabn

2 Pipeta 10 ml y 5 ml

7 viales

Tubos de celda

Papel toalla

Taper de plstico

a) Instrumentos e Equipos

Mechero bunsen

Centrifuga
 Espectrofotmetro

Refrigeradora

b) Reactivos

Agua destilada

Determinacin de la concentracin celular por D.O.

Diluciones
a) Materiales
1 matraz (medio rico)
2 pipeta (5ml y 2 ml)
1 gradilla
3 tubos de ensayo
Tubos de celda
b) Instrumentos y equipos
Espectrofotmetro
c) Reactivos
Agua destilada
Peso Seco
a) Materiales

3 capachos de aluminio
1 matraz (medio rico)
2 pipetas 5ml
Celdas (tubo)
3 tubos de ensayo
b) Instrumentos y equipos
Espectrofotmetro
Centrifuga
Estufa
 Balanza analtica
c) Reactivos
Agua destilada

Determinacin de la concentracin de glucosa

Hidrolisis de la Glucosa
a) Materiales
8 tubos de ensayo sin tapa
Gradilla
Micropipeta con puntas
2 pipetas para NaOH y HCl
2 vasos precipitados (50ml y 500ml)
Olla con trpode
Hielo

b) Instrumentos y equipos
Agitador Maxi Mix
Bao Maria
c) Reactivos
Sobrenadantes (medio rico)
HClcc
NaOH 1.7M
Agua destilada
DNS
a) Materiales
8 tubos de ensayo sin tapa
Gradilla
Micropipeta con puntas
Vasos precipitado
Olla con trpode
Hielo
Celdas
 b) Instrumentos y equipos
Mechero Bunsen
Agitador Maxi Mix
Espectrofotmetro

c) Reactivos
DNS
Muestra de la hidrolisis de la sacarosa
Agua destilada

METODOLOGIA EXPERIMENTAL

DISEO DE MEDIOS DE CULTIVOS:

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los

componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal finalidad se debe tener en
cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y
los sustratos que van a ser empleados, para ello se debe considerar los
requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del
proceso.
 Para el Diseo del medio de cultivo:

La levadura usada es la Pichia stipitis NRRL Y 7124, siendo el sustrato la D-

xilosa. La frmula qumica de Pichia stipitis es la siguiente:

(Levadura -formula qumica)

No obstante que los microorganismos (Pichia stipitis NRRL Y-7124) varan

considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible
efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes como son los
macronutrientes representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg y
micronutrientes representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co.

requerimientos nutricionales:

Para ello utilizamos un Medio de cultivo mnimo.

Solucin de sales:

Solucin de sales concentrada (100 veces)

Fuente de Ca : CaCl2
Fuente de Na : NaCl
Fuente de Fe : FeSO4.7 H2O
Fuente de Cu : CuSO4.5 H2O
Fuente de Mn : MnCl2.6H2O
 Fuente de Mo : MoO3
Fuente de Co : CoCl2.6H2O
Fuente de Zn : ZnSO4.7H2O

Condiciones de cultivo

Metabolismo celular Autotrfico

Ph 4.5
Estado Medio
liquido
Volumen del medio 30% - 40% del Fermentador
Composicin Qumicamente definido

DISEO DE CURVA DE CALIBRADO POR METODO DE DNS

Preparacin del reactivo de DNS

Para la elaboracin de dicho reactivo se utiliz las siguientes muestras: 1g de DNS,

1.6 g de NaOH y 30 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado. El
procedimiento para dicha elaboracin fue la siguiente: La mezcla se puso a bao
mara a 38C. Luego, gradualmente se fue agregando DNS y se procedi a 20
minutos de agitacin en el agitador magntico.

Preparacin de la curva de calibrado con el reactivo DNS

Para esta operacin, se tiene la solucin estndar de 2g/L de glucosa. Luego se
sigui con el procedimiento descrito a continuacin: Se utiliz 7 tubos de ensayo,
de los cuales un tubo fue el blanco y 500 L fue el volumen requerido para cada
tubo. En el primero, solo se aadi 500 L de la muestra de glucosa; en el
segundo, 400 L de glucosa + 100 L de agua destilada; en el tercero, 200 L de
glucosa + 300 L de agua destilada; en el cuarto, 100 L de glucosa + 400 L de
agua destilada; en el quinto, 50 L de glucosa + 450 L de agua destilada; y por
ltimo, en el sptimo tubo, solo se agreg 500 L de agua destilada. Luego se dej
hervir el agua, mientras se le adicion con una micropipeta 500 L de DNS a cada
tubo, posteriormente se amarraron los tubos con una liga para evitar cadas y se
introdujeron al agua hirviendo por 5 minutos. Despus, se retiraron de la olla y se
colocaron en agua con hielo por 3 minutos, seguidamente se le aadi 5 ml de
agua destilada y se dej reposar por 15 minutos. En el minuto 13, se comenz a
agitar en el agitador magntico, y se midi la absorbancia en el espectrofotmetro a
540 nm. Finalmente en Excel se grafic la curva de calibrado de concentracin vs.
absorbancia, se obtuvo la lnea de tendencia y la ecuacin se utiliz,
posteriormente, para la determinacin de azucares reductores.

DETERMINACIN DE CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA:

Para la determinacin de la curva de calibrado de biomasa se procedi de 20 ml

del matraz Erlenmeyer del medio de activacin. En donde se coloc en 3 tubos de
ensayo con una dilucin de 1:8 (1 ml de clula con 7 ml de agua destilada) para la
primera medicin de absorbancia en el espectrofotmetro para cada tubo de
ensayo.

Despus que se obtuvo las absorbancias de los 3 tubos de ensayo para la primera
medicin, estos se llevaron a la centrifuga con un tubo de ensayo con agua
destilada para el contrapeso (8 ml), la cual fueron por un tiempo de 20 minutos para
la primera lavada.

Pasado el tiempo de centrifuga se botaron los sobrenadantes de cada tubo de

ensayo y nos quedamos con las clulas (pelex) de cada tubo de ensayo, luego se
coloc 5 ml de agua destilada a cada tubo de ensayo con el pelex. De esta manera
se procedi 3 lavados a la clula (pelex).

Posteriormente se coloc los 3 tubos de ensayo en el agitador de tubos y se llev a

la centrifuga con un tubo de ensayo con 5 ml de agua destilada (para el
contrapeso) por un tiempo de 15 minutos. De esta manera se realiz por 2 veces.
Luego de los lavados de los 3 tubos de ensayo, los pelex fueron colocados en 3
capachos para ser llevados a la estufa por un tiempo de 24 horas.

Una vez terminado la parte mencionada anteriormente, se pas a realizar las

dems diluciones con el medio de activacin en 6 tubos de ensayo y cada uno se
llev al espectrofotmetro para obtener las absorbancias.

Luego al da siguiente de obtener los pesos secos de cada pelex se procedi a

calcular las concentraciones para la primera medicin de absorbancia (se realiz
un promedio de los 3 tubos de ensayo para obtener nuestra concentracin X). Por
ultimo al tener las 7 absorbancias y la primera concentracin X, se calcul las
dems concentraciones y se grafic la curva de calibracin para la biomasa.

ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INOCULO

Para la inoculacin partimos con la cepa incubada en medio slido liofilizado

(Pichia stipitis NRRL Y-7124). Se toma una aza bacteriolgica se somete al fuego
del mechero bunsen hasta alcanzar el rojo vivo y se deja enfriar por unos
segundos, luego del tubo de ensayo que contena las clulas en un medio liofizado,
se extrae una gota, se flamea el tubo para cerrarlo y se inocula en el matraz con los
30 ml del medio de activacin. Luego tapamos el tubo con un tapn de gasa y
algodn. Se Lleva al Shaker a 120 rpm, T = 30C y un t = 8 h., con el fin de
alcanzar un desarrollo celular, evidenciado el incremento en la turbidez del medio y
la formacin de un anillo en el matraz. Despus que sale del shaker es colocado en
refrigeracin para hacer la cintica al da siguiente.

PREPARACIN PREVIA AL SEMBRADO (SLIDO - LQUIDO)

Primero, se incubo la cepa durante 1 hora y media aproximadamente con el fin de
activar a las clulas, luego se acondicion el lugar de trabajo en el laboratorio para
sembrar (condiciones adecuadas de asepsia), finalmente se encendi el shaker.

SEMBRADO Y MEZCLA DE MEDIOS SOLIDO (MICROBIO) Y LIQUIDO

(MEDIO DE ACTIVACIN)

Primero, se mezcl los medios de activacin frente al mechero (tubos a matraz)

para evitar posible contaminacin luego se homogeneiz la muestra. Seguidamente
se cogi una asada de cepa Pichia Stipitis y luego se sembr en un matraz, se
homogeneiz y finalmente se coloc el shaker a 120 rpm.

PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN (20 ML)

Se hizo taras de aluminio, las cuales serviran para pesar las muestras necesarias.
Luego, se pes 0.1 g de glucosa, 0.06 g de extracto de levadura, 0.1 g de extracto
de malta y 0.1 ml de solucin de sales. La operacin se hizo por duplicado. Luego,
se sigui el siguiente procedimiento: en cada matraz de 125 ml se agreg la
glucosa y se aadi 10 ml de agua destilada, luego se utiliz dos tubos de ensayo:
en el primero, se agreg extracto de levadura y extracto de malta y se aadi 5 ml
de agua destilada, en el segundo, se agreg 0.1 ml de la solucin de sales y luego
se aadi 4.9 ml de agua destilada. Con ello se consigui un volumen de 20 ml, el
cual se necesita. Luego estas muestras fueron llevadas al autoclave para ser
esterilizadas. Se introdujeron y se empez a controlar 15 minutos luego de la
aparicin de una burbuja en la tapa.

PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN (200 ML)

Se hizo taras de aluminio, las cuales serviran para pesar las muestras necesarias.
Luego, se pes 0.1 g de glucosa, 0.932 g de xilosa, 0.6 g de extracto de levadura,
0.349 g de (NH4)2SO4, 0.070 g de KH2PO4, 0.028 g de MgSO4-7H2O, 1ml de
solucin de sales y 20 ml de tampn. La operacin se hizo por duplicado. Luego, se
sigui el siguiente procedimiento: en cada matraz de 500 ml se agreg 0.1 g de
glucosa y 0.932 g de xilosa y se aadi 130 ml de agua destilada, luego se utiliz
un matraz de 125 ml y dos tubos de ensayo: en el matraz, se agreg 0.6 g de
extracto de levadura y 20 ml de tampn citrato, en el primer tubo, se agreg 1 ml de
la solucin de sales concentradas y luego se aadi 14 ml de agua destilada y en
el segundo tubo, se agreg sales y 15 ml de agua destilada. Con ello se consigui
un volumen de 200 ml, el cual se necesita. Luego estas muestras fueron llevadas al
autoclave para ser esterilizadas. Se introdujeron y se empez a controlar 15
minutos luego de la aparicin de una burbuja en la tapa.

DETERMINACIN DE LA CINTICA DE LA BIOMASA:

Para conocer el comportamiento de la Pichia Stipitis en la mezcla de nuestra fuente

de carbono (xilosa ms glucosa), en sta determinacin de la cintica de la
biomasa primero llegamos a sacar nuestro inoculo que se encontraba refrigerado y
le echamos agua fra del cao alrededor por unos minutos y luego lo colocamos en
la incubadora a 120 rpm con una temperatura de 30C por 1 hora.

Posteriormente bajo condiciones de asepsia en el lugar de nuestro trabajo en el

laboratorio, encendimos el mechero y comenzamos a vaciar los tubos de ensayo
con las sales, levaduras y el matraz del inoculo, a nuestro matraz de fermentacin.

Luego sacamos 5 ml a un tubo de ensayo para poder leer la absorbancia en el

espectrofotmetro a 640 nm. Tomamos 10 puntos y colocamos el tubo a la
centrifuga por 15 minutos y de esa manera iremos obteniendo el comportamiento
del crecimiento de la biomasa.

Tambin de cada tubo de ensayo procederemos a separar el sobrenadante de las

clulas que se obtuvieron en la centrfuga, y los sobrenadantes fueron colocados
en viales. En ello obtuvimos la medicin del pH y los viales fueron llevados a
congelacin. Las clulas fueron dejamos en los tubos en la centrifuga.

DETERMINACIN DE AZUCARES REDUCTORES MEDIANTE EL

MTODO DEL DNS
Se retir del refrigerador los 10 viales obtenidos anteriormente en la cintica de
biomasa, se dej a temperatura ambiente y, posteriormente, se prosigui con el
procedimiento: con una micropipeta se tom 1000 L para los 5 primeros tubos sin
tapa y 500 L para los siguientes 5 tubos con tapa, despus, se llev a agitacin a
los primeros 5 tubos y se extrajo 500 L de la muestra y se introdujo en los tubos
con tapa. A su vez, se tuvo un blanco, el cual tena 500 L de agua destilada.
Luego se dej hervir el agua, mientras se le adicion con una micropipeta 500 L
de DNS a cada tubo, posteriormente se amarraron los tubos con una liga para
evitar cadas y se introdujeron al agua hirviendo por 5 minutos. Al trmino de este
tiempo, se dej reposar en agua helada por 3 minutos y, despus, se aadi 5 ml
de agua destilada y se dej reposar por 15 minutos. En el minuto 13, se comenz a
agitar en el agitador magntico, finalmente se midi la absorbancia en un
espectrofotmetro a 540 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

DNS

XILOSA GRUPO A-1

XILOSA
N (2g/l) ABS 540 nm
1 2 1,135
2 1,6 0,925
3 1,2 0,743
4 0,8 0,461
5 0,4 0,201
6 0,2 0,091
7 0 0
TABLA N1- CURVA DE CALIBRADO DNS

GRAFICA N1 CURVA DE CALIBRADO DE DNS GRUPO A-1

DILUCION abs x(g/L)
1 0.54 1.58
2 0.25 0.72
3 0.13 0.39
4 0.06 0.19
5 0.02 0.07
BIOMASA

TABLA N02 CURVA DE CALIBRADO DE LA BIOMASA A-1

GRAFICA N02 CURVA DE CALIBRADO PARA BIOMASA CELULAR (Todos los

Grupos)

BIOMASA Y SUSTRATO

BIOMASA

horas ABS X(g/L)

0 0.071 0.20838218
 1 0.111 0.32561547
2 0.14 0.41060961
3 0.195 0.57180539
4 0.285 0.8355803
5 0.422 1.23710434
6 0.643 1.88481829
7 0.679 1.99032825
8 0.796 2.33323564
9 0.896 2.62631887
10 1.386 4.06242673
TABLA N3 CURVA DE CALIBRADO DE LA BIOMASA

SUSTRATO

N ABS XILOSA XILOSA

(g/l) 1:5 (g/l)
1 0.755 1.31 6.54
2 0.734 1.27 6.36
3 0.698 1.21 6.05
4 0.712 1.23 6.17
5 0.701 1.22 6.08
6 0.762 1.32 6.60
7 0.712 1.23 6.17
9 0.707 1.23 6.13
10 0.709 1.23 6.15
11 0.680 1.18 5.90
 TABLA N3 CURVA DE CALIBRADO DE LA SUSTRATO

GRAFICA N 03 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia

con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de carbono
GRUPO A-1

ETANOL

LINEALIDAD

GRAFICA N 04 Curva del crecimiento celular para determinar el umax en la

experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de
carbono.
 GRAFICA N 05 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para determinar
el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como
fuente de carbono.

TABLA N04: Parmetros cinticos y rendimientos determinados en la experiencia con

Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando XILOSA como fuente de carbono.

Parmetro cintico y rendimientos Valor obtenido experimentalmente

Y x/s 6.013 g/g
td (h) 1,81 h
Qmx x/s (g/L*h) 0.258
Qtotal (gr/L*h) 0.256
m (h-1) 0,382 h-1

GLUCOSA GRUPO A-2

GRAFICA N 06 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia con
Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como fuente de carbono GRUPO A-
2

GRAFICA N 07 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para determinar
el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando GLUCOSA como
fuente de carbono

GLUCOSA + XILOSA GRUPO A-3

GRAFICA N 08 Crecimiento cintico y consumo del sustrato en la experiencia con

Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando la mezlca de GLUCOSA + XILOSA como fuente
de carbono GRUPO A-3

GRAFICA N 09 Curva del crecimiento celular con los puntos lineales para determinar
el umax en la experiencia con Pichia stipitis NRRL Y-7124 utilizando la mezcla de
GLUCOSA +XILOSA como fuente de carbono
 CONCLUSIONES
 DISCUSIONES
 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
 Castillo Plata Ana K. 2010. Determinacin de parmetros de cultivo de
scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae para la fermentacin
de residuos lignocelulosicos para la obtencin de bioethanol.

Ertola Rodolfo, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone. 2011. Monografa

redactada: Medios de Fermentacin. Programa Regional de Desarrollo
Cientfico y Tecnolgico de la OEA. Departamento de Microbiologa y
Gentica. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca.

Enari, T. M. and M. L. Suihko. 1984. Biotechnol. Bioprocess. Department

of Molecular Science and Technology. Korea.

Martnez, A., Rodrguez M. E. & York S. W. 2011. Ethanol production of

pentose and hexoses from cellulose materials. CRC Crit. Rev. Biotechnol.
Vol. 28, pp. 151.
 ANEXOS

Hallando el % de clulas:

Microorganismo
(levadura) Formula elemental

Pichia stipitis NRRL Y-

7124 CH1.79O0.6N0.17

Para poder terminar los diversos % de elemento en la clula se tiene q hallar el peso
(gr) de cada elemento y el peso total

Peso (g) = peso molecular * cantidad

Porcentaje de carbono (C) en la clula:

Porcentaje de hidrogeno (H) en la clula:

 Porcentaje de oxgeno (O) en la clula:

Porcentaje de nitrgeno (N) en la clula:

Tabla de porcentaje de elementos en celula:

%DE
PESO
ELEMENTO CANTIDAD PESO (g) ELEMENTO EN
MOLECULAR
CELULA

C 12 1 12 46.57

H 1 1.79 1.79 6.95

O 16 0.6 9.6 37.25

N 14 0.17 2.38 9.24

TOTAL 25.77

Nota: Se determin tericamente el porcentaje de los elementos restantes en la clula.

Tabla de elemento restantes en clula de Pichia Stipitis:

 Elemento Porcentaje PROMEDIO

S 0.01 0.24 0.13%

Mg 0.1 0.6 0.35%

K 1 4 2.50%

P 0.8 2.6 1.70%

Para la xilosa C5H10O5:

Peso molecular de la Xilosa C5H10O5 = 5(12.001) + 10(1.008) + 5(15.999)

Peso molecular de la Xilosa C5H10O5 = 150.08

Carbono:

Clculo del porcentaje en compuesto:

150.08 100%

60.005 x

X = 39.98%

Clculo del rendimiento Y x/s:

 Clculo del So (g/L):

Clculo del S0 (g/L):

Para el Sulfato de Amonio (NH4)2SO4:

Peso molecular del Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 = 2(14.007) + 8(1.008) +

(32.06) + 4(15.999)

Peso molecular del Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 = 132.134

Nitrgeno:

 Clculo del porcentaje en compuesto

132.134 100%
28.014 x
X = 21.20%

Clculo del rendimiento Y x/s:

Clculo del So (g/L):

Clculo del So (g/L):

Para el Sulfato de Amonio (NH4)2SO4:

 Peso molecular del Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 = 2(14.007) + 8(1.008) +
(32.06) + 4(15.999)

Peso molecular del Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 = 132.134

Azufre:

Clculo del porcentaje en compuesto:

132.134 100%

32.06 x

X = 24.26%

Clculo del rendimiento Y x/s:

Clculo del So (g/L):

Clculo del So (g/L):

 Para el Fosfato dicido de potasio KH2PO4:

Peso molecular del Fosfato dicido de potasio KH2PO4 = (39.0983) +2(1.008)

+ (30.973) +4(15.999)

Peso molecular del Fosfato dicido de potasio KH2PO4 = 136.0833

Potasio:

Clculo del porcentaje en compuesto:

136.0833 100%
39.0983 x X =
28.73%

Clculo del rendimiento Y x/s:

Clculo del So (g/L):

Clculo del So (g/L):

 Fosforo:

Clculo del porcentaje en compuesto:

136.0833 100%

30.973 x X =
22.76%

Clculo del rendimiento Y x/s:

Clculo del So (g/L):

Clculo del So (g/L):

Para el Sulfato de magnesio Heptahidratado MgSO4.7H2O:

Peso molecular del Sulfato de magnesio Pentahidratado MgSO 4.7H2O =

(24.305) + (32.06) +4(15.999) + 7*2(1.008) +7(15.999)
 Peso molecular del Sulfato de magnesio Pentahidratado MgSO 4.7H2O =
246.466

Magnesio:

Clculo del porcentaje en compuesto:

246.466 100%

24.305 x X =
9.86 %

2. Clculo del rendimiento Y x/s:

Clculo del So (g/L):

Clculo del So (g/L):

Para el Sulfato de magnesio Pentahidratado MgSO4.7H2O:

 Peso molecular del Sulfato de magnesio Pentahidratado MgSO 4.7H2O =
(24.305) + (32.06) +4(15.999) + 7*2(1.008) +7(15.999)

Peso molecular del Sulfato de magnesio Pentahidratado MgSO 4.7H2O =

246.466

Azufre:

Clculo del porcentaje en compuesto:

246.466 100%
32.06 x
X = 13.01%

2. Clculo del rendimiento Y x/s:

3. Clculo del So (g/L):

4. Clculo del So (g/L):