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MONOGRFICO

Diagnstico microbiolgico de la tuberculosis

El diagnstico de certeza de la La tuberculosis humana es una enfermedad producida


tuberculosis es microbiolgico. La por bacterias del gnero Mycobacterium, y dentro de
importancia de realizar un buen ste por tres especies que pertenecen al complejo M.
tuberculosis: M. tuberculosis es la especie aislada con
diagnstico y seguimiento microbiolgico
ms frecuencia, M. bovis produce una enfermedad in-
de la tuberculosis est claramente distinguible clnicamente de la producida por M. tuber-
reconocida y consensuada en todos los culosis y M. africanum causa enfermedad en frica
programas de control de la tuberculosis. tropical, pudiendo ser considerada como una forma in-
Obviamente, la estrategia fundamental termedia entre M. tuberculosis y M. bovis1,2.
para el control de la enfermedad
tuberculosa debe ser el rpido y
Caractersticas bacteriolgicas del gnero
correcto diagnstico de los casos de
Mycobacterium
tuberculosis activa y, sobre todo, de los
enfermos bacilferos. Son bacilos delgados de forma recta o ligeramente cur-
vada, de tamao de 1-10 de largo por 0,2-0,6 de an-
cho. Ocasionalmente forman ramificaciones verdaderas
M.L. Prez del Molino, V. Tuez Bastida, observadas en cultivos enriquecidos y en frotis de gan-
M.R. Garca Ramos y F.L. Lado Lado glios linfticos. Son bacilos aerobios estrictos, inmvi-
Complejo Hospitalario Universitario de Santiago. les, sin cpsula, que no forman esporas y se tien con
Santiago de Compostela. La Corua
dificultad con la tincin de Gram (irregularmente gram-
positivos) (fig. 1).
La estructura de su gruesa pared celular, responsable de
su caracterstica coloracin cido-alcohol resistente,
presenta en su lado interno una capa de polmeros de
arabinosa y galactosa, seguida de otra formada por ci-
dos miclicos (cidos grasos de gran importancia en la
taxonoma del gnero Mycobacterium, y otra superfi-
cial formada por lpidos, como los sulfolpidos y mic-

Fig. 1. Tincin de Ziehl-Neelsen positiva (100). Cord-factor de


M. tuberculosis en tuberculosis renal.

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sidos, lo que hace que presenten un alto contenido en Lquidos orgnicos


lpidos. Es probable que los cidos grasos y los lpidos
En los lquidos cefalorraqudeos, pleurales, sinoviales,
sean los responsables de su gran resistencia a la deseca-
pericrdicos o ascticos es necesario enviar al laborato-
cin y a la accin de los descontaminantes poderosos,
rio la mayor cantidad posible, ya que la concentracin
tanto cidos como alcalinos. Son sensibles al calor h-
de micobacterias en este tipo de muestra es muy baja.
medo y se destruyen a temperatura de pasteurizacin.
Es muy importante recordarlo cuando existe una alta
El crecimiento bacteriano es lento; en condiciones pti-
sospecha de meningitis tuberculosa, dada la gravedad
mas de cultivo (temperatura 37 C, pH = 7) el tiempo
de la enfermedad y la relevancia de la realizacin de un
de duplicacin es de 15-18 h, tardando de una a 3 se-
diagnstico microbiolgico de certeza.
manas en aparecer colonias visibles en medios de culti-
vo slidos3,4.
La tuberculosis ms frecuente es la pulmonar, por lo que Biopsias
la mayora de las muestras procedern del aparato respi-
Siempre que se biopsie un rgano en el que exista sos-
ratorio; pero la tuberculosis puede afectar a casi todos los
pecha de tuberculosis deber enviarse una muestra al
rganos. En la actualidad la tuberculosis extrapulmonar
laboratorio de microbiologa y para evitar su deseca-
representa 22-39%, por lo que se puede recibir en el la-
cin se debe aadir unas gotas de agua destilada. En el
boratorio un gran diversidad de muestras4,5. La calidad,
caso de sospecha de tuberculosis intestinal se debe re-
cantidad y representatividad de la muestra condicionarn
currir, si es posible, a biopsiar la lesin, ya que la renta-
la posibilidad de realizar el diagnstico.
bilidad del procesamiento de las heces es muy baja.

Obtencin y transporte de muestras Hemocultivos


clnicas
Normalmente slo deben ser utilizados en pacientes in-
Es necesario enviar las muestras en frasco estril, trans- munodeprimidos en los que se sospeche enfermedad di-
portarlas lo ms rpido posible al laboratorio y siempre seminada, fundamentalmente en pacientes con sida con
que sea posible conservarlas a 4 C. En caso de pacien- un nmero de CD4 inferior a 50/l. Generalmente su
tes ambulatorios se puede almacenar las 3 muestras en rentabilidad es superior en el diagnstico de otras infec-
una nevera (esputos/orinas) y remitirlas juntas al labo- ciones por micobacterias (especies del complejo M.
ratorio3,4. avium-intracellulare, M. genavense) que para la tuber-
culosis. Los sistemas utilizados con mayor rentabilidad
Muestras respiratorias son los de lisis centrifugacin y el BACTEC 460TB
(viales BACTEC13A). Tambin se han comunicado
El esputo es la muestra ms frecuente y epidemiolgica- buenos resultados con el sistema automatizado ESP
mente la ms importante. Se enviarn al laboratorio Culture II-Myco6.
3 esputos recogidos en 3 das consecutivos por la maa- Todas las muestras recibidas para estudio de tuberculo-
na, en ayunas, y en cantidad de 5-10 ml; volmenes infe- sis se deben manipular como si contuvieran micobacte-
riores pueden disminuir la rentabilidad de la muestra. rias. Los Centers for Disease Control and Prevention
Cuando el enfermo no puede espectorar se podr recurrir (CDC) y los National Institutes of Health recomiendan
a inducir el esputo (aerosol de solucin salina, durante el empleo de prcticas de bioseguridad de nivel 2 para
15-20 min) o a la realizacin de una fibrobroncoscopia, la preparacin de frotis acidorresistentes y el cultivo de
que permite realizar broncoaspirados selectivos, lavados las muestras7.
broncoalveolares y biopsias de las lesiones bronquiales.
Es importante procesar los esputos obtenidos tras la
broncoscopia, ya que tienen una buena rentabilidad. Tcnicas de diagnstico
El estudio del jugo gstrico puede ser til en el diag- Observacin microscpica
nstico de la tuberculosis peditrica; se debe obtener
matinalmente en 3 das consecutivos y procesarse con Las tcnicas utilizadas para la observacin de las mico-
rapidez. Si se va a tardar ms de 2 h se debe neutralizar bacterias se basan en su cido-alcohol resistencia; es
con carbonato sdico. necesario recordar que esta caracterstica es compartida
parcialmente por otras bacterias, como especies de No-
cardia, Legionella micdadei, Rhodococcus sp. y quistes
Orinas
de Cryptosporidium sp., Isospora sp., Cyclospora sp. y
Se debe enviar 3 orinas matinales completas durante Microsporidea, aunque presentan menos estabilidad en
3 das consecutivos, cuya cantidad no debe ser inferior la coloracin. Las 2 tinciones ms utilizadas son la cl-
a 70 ml. sica de Zhiel-Neelsen y la tincin con fluorocromos

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(auramina 0). Esta ltima permite una lectura ms rpi- Independientemente del resultado de la observacin mi-
da (2-3 min) y se recomienda cuando el nmero de croscpica, se debe siempre efectuar el cultivo de las
muestras a examinar es superior a diez diarias; tambin muestras clnicas para realizar un diagnstico de certe-
hay que tener en cuenta que los frotis teidos por aura- za de tuberculosis.
mina pueden reteirse por Zhiel-Neelsen, lo que posibi-
lita la diferenciacin de la morfologa bacteriana. Esta
Cultivo e identificacin del complejo M. tuberculosis
tincin permite distinguir ciertas caractersticas morfo-
lgicas, pero no permite diferenciar con certeza las es- La tcnica de cultivo es ms sensible que la microsco-
pecies de micobacterias. M. Kansasii puede sospechar- pia para el diagnstico, ya que permite detectar 10 bac-
se por su mayor tamao y apariencia de bandas terias/ml de muestra concentrada. Asimismo, asegurar
cruzadas. Algunas micobacterias de crecimiento rpido la negativizacin de los cultivos es imprescindible para
(cepas del complejo M. fortuitum) pueden teirse mal el seguimiento de la enfermedad y el control de la
con auramina 0, teniendo que recurrir a la tincin clsi- eficacia del tratamiento. La realizacin del cultivo es
ca4. fundamental para el aislamiento de la bacteria, que
Las recomendaciones internacionales ms utilizadas permitir, si fuera necesario, estudios de resistencia a
para la emisin de resultados se exponen en la tabla 18. frmacos y/o estudios de tipificacin gentica6.
Esta cuantificacin es importante, ya que la reduccin Las muestras remitidas para su estudio al laboratorio de
del nmero de bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR) micobacterias se pueden dividir en dos grupos3,4,10:
orienta sobre la eficacia del tratamiento antitubercu-
loso. 1. Muestras procedentes de lugares estriles, como l-
El hallazgo de BAAR en las muestras clnicas es la pri- quidos cefalorraqudeos, pleurales, peritoneales, peri-
mera evidencia de la presencia de una micobacteria. Es crdicos y biopsias de tejidos. stas pueden sembrarse
el procedimiento ms fcil y rpido que permite un directamente en los medios de cultivo. Si el volumen es
diagnstico presuntivo y el reconocimiento de los pa- grande pueden requerir una concentracin previa.
cientes bacilferos, lo que le confiere un gran valor epi- 2. Muestras procedentes de lugares en los que existe
demiolgico. Una tincin negativa nunca excluye una flora comensal (esputos, orinas etc.) que se multiplica
tuberculosis. Para que una tincin sea positiva es nece- ms rpido que las micobacterias, por lo que puede
sario que el nmero de BAAR en el esputo sea de impedir el crecimiento de las micobacterias. Este tipo
5.000-10.000/ml, lo que hace que la sensibilidad de la de muestras debe ser sometido a un proceso de homo-
tcnica sea limitada, del 22-80% segn las series4, y se geneizacin (descontaminacin y posterior neutraliza-
encuentre influida por diversos factores (tipo de mues- cin-concentracin). Los mtodos ms utilizados
tra, poblacin estudiada, etc.). En tuberculosis prima- son el de Tacquet y Tison (laurilsulfato sdico), el de
rias y extrapulmonares, su sensibilidad es muy baja9. NALC-NaOH y el que utiliza cido oxlico, que elimi-
Dado que la eliminacin de bacilos puede ser disconti- na P. aeruginosa, para enfermos con fibrosis qusti-
nua, se recomienda el procesamiento de varias muestras ca2,10. El concentrado final puede utilizarse para tincio-
para aumentar la sensibilidad de la observacin micros- nes cido alcohol-resistentes, para cultivo o, si fuera
cpica directa6. necesario, para la amplificacin de cidos nucleicos. La
La especificidad de la tincin de BAAR es bastante ele- eleccin de cualquiera de estos sistemas depender so-
vada; la presencia de micobacterias no tuberculosas en bre todo del tipo de medio de cultivo lquido a utilizar
el agua con la que se realiza la tincin puede ser causa y/o de la posible realizacin de tcnicas molecula-
de falsos positivos. Tambin puede existir transferen- res, ya que algunos reactivos pueden retrasar el creci-
cia de micobacterias entre distintos frotis, as como miento de las micobacterias o interferir en las reaccio-
contaminacin en el aceite de inmersin2. nes de amplificacin11.

TABLA 1
Evaluacin e informe de los frotis para bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR)
TINCIN DE FUCSINA: TINCIN CON FLUOROCROMO: INFORME
NO DE BAAR OBSERVADO A 1.000 NO DE BAAR OBSERVADO A 250

0 0 No se observaron BAAR
1-2/300 campos 1-2/30 campos No concluyente, repetir envo por favor
1-9/100 campos 1-9/10 campos 1+
1-9/10 campos 1-9/campo 2+
1-9/campo 10-90/campo 3+
> 9/campo > 90/campo 4+

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La gran variedad de medios permite a cada laboratorio una mezcla antibitica selectiva PANTA (polimixina B,
elegir los que mejor se adapten sus necesidades y a la azlocidina, cido nalidxico, trimetroprim y anfotericina
poblacin atendida. Existen 2 grupos de medios de cul- B) y un suplemento de enriquecimiento de estearato de
tivo: slidos y lquidos. En general, se admite que el polioxietileno (POES). El medio contiene cido palmti-
uso combinado de un medio slido y otro lquido es co marcado con 14C radiactivo del que las micobacte-
idneo para la realizacin de aislamientos primarios, rias, al crecer, liberan 14CO2. ste es detectado en el
buscando rapidez y sensibilidad. En condiciones nor- BACTEC 460TB y traducido a un ndice de crecimiento
males, los cultivos deben incubarse a 35-37 C e incu- (escala 0-999), que es proporcional a la cantidad de mi-
barse durante 6-8 semanas. Se acepta como control de cobaterias que se estn multiplicando. Este sistema es
calidad de buen funcionamiento de un laboratorio una ms sensible que los tradicionales6,12,13. Presenta como
contaminacin entre el 3-5% de los cultivos en medio inconveniente la utilizacin de istopos radiactivos y
slido. Un rango menor indicara una descontamina- que se pueden producir falsos positivos por contamina-
cin demasiado severa y un rango superior al 5% sera cin de los frascos a partir de las agujas del aparato de
debido a una descontaminacin suave. No existe con- lectura deficientemente esterilizadas14. En la actualidad,
senso en cuanto a posibles rangos de contaminacin en est comercializado el sistema Mycobacteria Growth In-
los distintos medios lquidos utilizados en la actua- dicator (MGIT), que utiliza el medio de Middlebrook
lidad3. 7H9 y la mezcla antibitica PANTA, con un suplemento
de enriquecimiento OADC (cido oleico, albmina,
Medios de cultivos slidos dextrosa y catalasa); como sustrato utiliza un compuesto
Los ms comnmente usados son los que utilizan como de rutenio. Durante el crecimiento bacteriano se consu-
base huevo coagulado, como el Lwenstein-Jensen y el me oxgeno y el compuesto de rutenio emite fluorescen-
de Coletsos. Este ltimo facilita el crecimiento de M. cia, que se detecta en una lmpara de Wood. Tiene me-
bovis y de cepas disgnicas de M. tuberculosis. Tam- nor sensibilidad que el anterior, pero es una buena
bin se puede utilizar medios con base de agar (Midd- alternativa para laboratorios pequeos15,16.
lebrook 7H10, 7H11). Si se dispone de estufas con at-
msfera de 5-10% de CO2, es conveniente mantener los Medios de lectura automtica (fig. 2). En los ltimos
tubos al menos 5-7 das (esto es importante en los me- aos se han diseado sistemas de cultivo lquido no ra-
dios con agar). Los tubos deben leerse, al menos una diomtricos. Todos ellos son mtodos no invasivos (no
vez por semana, aunque es deseable realizar 2 lecturas utilizan agujas en la deteccin), con escasa manipula-
semanales. Una ventaja de estos medios es que permi- cin de viales (una vez inoculados se almacenan en un
ten apreciar la morfologa colonial, por lo que se puede incubador especfico) y lectura continua totalmente au-
observar caractersticas de la colonia (rugosidad, pig- tomatizada. La principal diferencia est en el sistema
mentacin, etc.) que son ya datos orientativos para su de deteccin. Los ms utilizados son: BACTEC
posterior identificacin10. En el medio de Lwenstein- 9000MB System (la base de la deteccin es la descri-
Jensen las colonias de M. tuberculosis empiezan a ob- ta en el sistema MGIT)7,18, ESPII-Myco (deteccin ba-
servarse a las 2-3 semanas de incubacin. La mayor sada en la disminucin de presin por el consumo de
desventaja de estos medios es la lentitud de crecimiento
de las micobacterias, por lo que en los ltimos aos han
tenido un gran desarrollo los medios lquidos.

Medios de cultivos lquidos


Su mayor ventaja es que acortan en 2-3 semanas la de-
teccin de las micobacterias, y permiten un mayor n-
mero de aislamientos de algunas micobacterias no tu-
berculosas, como las pertenecientes al complejo M.
avium-intracellulare. Actualmente los medios lquidos
se pueden dividir en dos grupos, que exponemos a con-
tinuacin.

Medios de lectura semiautomtica. Estos sistemas re-


quieren una gran manipulacin de los viales durante
todo el proceso y la lectura se realiza de forma manual.
El ms ampliamente utilizado es el sistema BACTEC Fig. 2. Anlisis automatizado. Dendograma representativo del es-
tudio mediante RFLP-IS6110 de 13 cepas de M. tuberculosis. Las
460TB, comercializado a finales de los aos setenta, cepas V10 y V20, as como la V1 y V52, presentan patrones idn-
que emplea viales de medio lquido Middlebrook 7H12, ticos.

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oxgeno debido al crecimiento de las bacterias)19 y sis- (5-8 h). Estas tcnicas presentan problemas en su eva-
tema MB-BacT (deteccin mediante colorimetra de la luacin, siendo necesaria, en la actualidad, una estrecha
produccin de CO2 del crecimiento bacteriano). relacin entre el clnico y el microbilogo para concre-
tar las situaciones en las que se debe utilizar estas
Identificacin del complejo M. tuberculosis tcnicas de amplificacin. Es importante conocer con
Tradicionalmente, las micobacterias aisladas en cultivo precisin las ventajas y limitaciones de cada sistema de
se han identificado sobre todo por sus caractersticas amplificacin6.
morfolgicas en el medio de Lwenstein-Jensen (velo- En general, todas la tcnicas de amplificacin de cidos
cidad de crecimiento, rugosidad y pigmentacin) y me- nucleicos comportan 3 pasos fundamentales.
tablicas. Se confirma mediante pruebas bioqumicas,
el test de la niacina, que pone de manifiesto la capaci- Preparacin de la muestra
dad para producir cido nicotnico y es la prueba funda- Este paso est dirigido a eliminar posibles inhibidores
mental para la identificacin de M. tuberculosis, aun- existentes en las muestras clnicas, as como a conse-
que sta no debe basarse nunca exclusivamente en esta guir una extraccin eficiente de los cidos nucleicos de
prueba10. Las pruebas bioqumicas necesarias para la las micobacterias. La lisis puede ser mecnica (sonica-
correcta identificacin del complejo M. tuberculosis se cin), fsica (calor) y qumica (detergentes, proteasas);
exponen en la tabla 2. pueden utilizarse uno o varios procedimientos, ya que
El desarrollo de la biologa molecular ha permitido la pared celular de las micobacterias es difcil de lisar.
identificar secuencias de cido desoxirribonucleico
(ADN) y de cido ribonucleico (ARN) especficas de Amplificacin
las distintas especies de micobacterias. Para hibridar Proceso en el que se producen numerosas copias del
con estas secuencias se han preparado sondas genticas cido nucleico diana. Existen tcnicas que amplifican el
marcadas con sustancias cromgenas, que proporcio- ARN, y otras el ADN, utilizando diversas dianas de
nan resultados en menos de una hora. Actualmente dis- amplificacin (IS 6110, rRNA 16s) y distintas enzimas
ponemos de sondas frente al complejo M. tuberculosis, (transcriptasa inversa/ARN-polimerasa/Taq polimera-
M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae sa/ADN-ligasa/ADN-polimerasa). Segn el protocolo
(Accuprobe.Gen-Probe Inc.) que se pueden utilizar utilizado variarn el nmero de ciclos y las condiciones
tanto sobre colonias crecidas en medios slidos como de temperatura.
sobre cultivos positivos en medios lquidos. El lmite
de deteccin de estas sondas es de, aproximadamente, Deteccin del producto amplificado
106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml20. El Se puede realizar mediante electroforesis en geles de
principal inconveniente de la sonda para el complejo agarosa (generalmente con menor especificidad), tcni-
M. tuberculosis es que no diferencia entre las 3 espe- cas de hibridacin en distintos tipos de soporte (tipo en-
cies del complejo. La sonda tiene una alta especifici- zimoinmunoanlisis), etc.6.
dad, pero se han descrito falsos positivos con M. terrae Los primeros ensayos utilizaban muy diversos protoco-
y M. celatum3. los, con reactivos de muy distinta fabricacin y con va-
riedad de controles de calidad, y obtuvieron resultados
heterogneos segn los distintos laboratorios21,22. Esto
Tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos
hizo imposible la realizacin de anlisis globales sobre
Los problemas inherentes a la lentitud del cultivo de las la utilizacin de estas tcnicas en el diagnstico de la
micobacterias han hecho que las tcnicas de biologa tuberculosis. En la actualidad disponemos en el merca-
molecular que permiten la amplificacin de secuencias do de una gran variedad de tcnicas que permiten traba-
de ADN y de ARN especficas del complejo M. tuber- jar de forma estandarizada. Las ms utilizadas y, por
culosis se desarrollen ampliamente en el diagnstico tanto, de las que existe ms experiencia en el diagnsti-
de la tuberculosis, permitiendo un diagnstico rpido co clnico son las que se citan a continuacin.

TABLA 2
Identificacin de las especies del complejo M. tuberculosis
TEST M. TUBERCULOSIS M. AFRICANUM M. BOVIS

Niacina + - -
Reduccin de nitratos + V -
Catalasa a 68 C - - -
Resistencia a TCH R S S
Resistencia a pirazinamida - - +

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Amplificacin mediada por transcripcin (TMA). tentan justificarse con valoraciones clnicas. Sin embar-
(AMTD-2. GenProbe Inc). Utiliza un proceso isotr- go, aparece en casi todos los estudios un 1-5% que
mico y autocataltico, diseado para amplificar el ARN debe ser asumido como falsos positivos6.
ribosomal 23S micobacteriano (utiliza ARN-polimera- En la actualidad, las tcnicas de amplificacin de ci-
sa/transcriptasa inversa). La deteccin especfica se re- dos nucleicos son un apoyo en el diagnstico de la tu-
aliza mediante una sonda ADN marcada con un ester berculosis, pero no desplazan a las tcnicas clsicas.
de acridina quimioluminiscente. A travs de un proceso Las limitaciones y el elevado coste de esta tecnologa
qumico (que protege la hibridacin) se eliminan las est siendo un obstculo para su introduccin en la ruti-
sondas no hibridadas. Los hbridos ARNr-ADN, espe- na de los laboratorios de micobacterias.
cficos de complejo M. tuberculosis, son detectados en
un luminmetro. Es un sistema manual de fcil aplica-
Tcnicas serolgicas
cin en cualquier laboratorio clnico23,24.
Los principales tipos de antgenos de micobacterias uti-
Reaccin en cadena de la ligasa (LCR) (LCx.Abbot lizados para el diagnstico serolgico mediante tcni-
Lab). La LCR utiliza 4 iniciadores diseados para aco- cas de enzimoinmunoanlisis son de naturaleza proteica
tar la regin a amplificar; as, las sondas pueden unirse (PPD, antgeno 5) o de naturaleza lipdica (PGL-tb 1,
enzimticamente (mediante la ADN-ligasa) previa ac- SL I, SL IV)3. Existe comercializado un equipo que uti-
tuacin de la ADN-polimerasa, para formar el producto liza el denominado antgeno 60, que es un complejo
amplificado. Se utiliza como diana el gen que codifica protenico-lipopolisacrido procedente del citoplasma y
para la protena antignica b, especfica del complejo de la membrana celular de M. bovis BCG y es comn a
M. tuberculosis. La deteccin de los amplicones tiene M. tuberculosis, M. bovis y otras micobacterias3. Estas
lugar mediante un enzimoinmunoanlisis de micropar- tcnicas serolgicas, que parecan prometedoras en los
tculas (MEIA), tras generar el producto amplificado estudios preliminares, resultaron ser finalmente decep-
una molcula fluorescente. Es un sistema semiautoma- cionantes en la prctica clnica. En la actualidad no se
tizado23,25,26. reconoce utilidad diagnstica clara a ninguna determi-
nacin serolgica.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) Amplicor
(Roche Systems). La diana de amplificacin es un seg-
mento de 584 pares de bases (pb) ubicado en el gen que
Estudios de sensibilidad a frmacos
codifica para el ARNr 16s, comn a todo el gnero antituberculosos
Mycobacterium. La deteccin se lleva a cabo con sondas
Es bien sabido que en el genoma de M. tuberculosis se
especficas para el complejo M. tuberculosis que, una
producen mutaciones espontneas con relativa frecuen-
vez unidas al producto amplificado, darn lugar a una
cia. La incidencia natural de mutantes dentro de una
reaccin colorimtrica. Esta tcnica incluye controles in-
poblacin bacteriana vara para los diferentes quimiote-
ternos para detectar inhibidores de la amplificacin27,28.
rpicos: para rifampicina aparece una mutante resisten-
te entre 108 bacilos, para isoniacida sera entre105-106
Las evaluaciones de todas estas tcnicas sobre muestras
bacilos. Para evitar la seleccin de cepas resistentes el
clnicas con tincin de auramina positiva ofrecen muy
tratamiento de la tuberculosis se realiza con al menos
buenos resultados en cuanto a la sensibilidad (> 98%) y
3 quimioterpicos4,5. Los frmacos de primera lnea
la especifidad (> 98%). En las muestras de origen respi-
utilizados en el tratamiento de la tuberculosis son: iso-
ratorio, cuando la tincin de auramina es negativa exis-
niacida (H), rifampicina (R), etambutol (E), pirazina-
te una mayor variabilidad en los estudios; en general
mida (Z) y estreptomicina (S). Los de segunda lnea
presentan mayor sensibilidad las tcnicas que ampli-
son: cido p-amino-saliclico, etionamida, cicloserina,
fican ARN (80-85%) que las que amplifican ADN (53-
capreomicina, kanamicina, amikacina, ofloxacino y ri-
72%)23-27.
fabutina4.
En las series que estudian muestras extrapulmonares
La deteccin de cepas resistentes es otra de las funcio-
an es mayor la dispersin de resultados, obtenindose
nes importantes de los laboratorios de micobacterias.
sensibilidades entre el 71-78% con las tcnicas que am-
Las pruebas de sensibilidad se realizan con dos finali-
plifican ADN y entre el 65-77% con las que amplifican
dades distintas:
ARN23,24,26,28,29.
Estos datos indican que una amplificacin negativa en 1. Estudios con fines epidemiolgicos, cuyo objetivo es
una muestra con tincin de auramina negativa no des- el conocimiento de las resistencias primarias; se rea-
carta el diagnstico de tuberculosis. lizan peridicamente y se coordinan desde los progra-
Existe una dificultad aadida en la interpretacin de las mas de control de tuberculosis correspondientes a cada
amplificaciones positivas con cultivo negativo, que in- zona.

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2. Estudios de sensibilidad individualizados. Se reali- alert/BACTEC-MGIT 960) estn en avanzada fase de


zan en cepas procedentes de pacientes pertenecientes a aprobacin6.
grupos concretos previamente definidos en los progra- La aparicin de cepas multirresistentes ha aumentado la
mas de control. Aunque la eleccin de estos grupos de- necesidad de disponer de mtodos ms rpidos para de-
pende de cada pas y de su problemtica respecto a la tectar la resistencia a los frmacos de primera lnea31.
tuberculosis, en general se admite la realizacin del an- Se estn estudiando tcnicas que detecten genes de re-
tibiograma en los siguientes casos: sistencia, por tanto independientes del crecimiento bac-
Pacientes previamente tratados. teriano. Los estudios ms avanzados estn realizados
Pacientes en los que el esputo con baciloscopia positi- sobre la deteccin de resistencia a rifampicina, ya que
va tras una inicial negativizacin vuelve a positivizarse. las mutaciones se encuentran principalmente en un
Cuando el examen microscpico no se negativiza tras solo gen (rpoB). Existe un sistema ya comercializado
los 2-3 primeros meses de tratamiento. (INNO-lipa) que utiliza una PCR y posterior hibrida-
Cuando el cultivo de esputo no se negativiza a los cin en tiras de nitrocelulosa que llevan incorporadas
6 meses de tratamiento. sondas que cubren la totalidad del gen rpoB, informan-
Pacientes infectados por cepas resistentes a algn fr- do hasta del 86% del total de las mutaciones responsa-
maco. bles de la resistencia a rifampicina, en caso de existir.
Todos los pacientes infectados con el VIH en zonas de Es una tcnica rpida, que se correlaciona bien con los
alta incidencia de infeccin por el VIH3. mtodos tradicionales y que permite sospechar que la
Todos los pacientes menores de 15 aos. cepa es multirresistente, ya que el 90% de las cepas re-
sistentes a rifampicina lo son tambin a isoniacida30. En
El programa de control de la tuberculosis de la Comu-
los ltimos aos se han descrito y reconocido gentica-
nidad Autnoma Gallega incluye tambin a los pacien-
mente mutaciones de resistencia a otros frmacos (H,
tes ingresados en penitenciarias, inmigrantes, contactos
E, Z, S), por lo que es posible que surjan nuevas tcni-
con infectados por cepas resistentes, usuarios de drogas
cas rpidas6.
por va parenteral y todos los infectados por el VIH5,6.

Tipificacin molecular. Tcnicas de


Mtodos de antibiograma de M. tuberculosis
restriccin-hibridacin (RFLP)
Se pueden realizar a partir de la muestra recibida en el
laboratorio, cuando en ella se observen abundantes ba- En el estudio de la epidemiologa de la tuberculosis
cilos acidorresistentes en el examen microscpico (m- puede ser importante comparar cepas de M. tuberculo-
todo directo), o a partir de la cepa aislada en el cultivo sis aisladas de los enfermos (y en su caso del ambien-
(mtodo indirecto). Los resultados del mtodo directo te). Histricamente, los nicos sistemas para subtipifi-
son ms rpidos, pero slo son orientativos, debindose car aislamientos de M. tuberculosis eran marcadores
confirmar por el mtodo indirecto5,9. fenotpicos, como la resistencia a antimicrobianos y la
El mtodo de referencia clsico es el de las proporcio- fagotipificacin, ambos sistemas de bajo poder discri-
nes4,10, realizado sobre medios slidos como el Lwens- minativo32. Actualmente disponemos de marcadores ge-
tein-Jensen o en el medio de base de agar 7H10, a los notpicos ms eficaces que estudian directamente el ge-
que se incorporan los antibiticos en concentraciones noma bacteriano. Se considera que un marcador tiene
crticas previamente definidas. Para la lectura es nece- un buen poder discriminativo cuando la probabilidad de
saria la visualizacin de colonias, por lo que, dado el que 2 cepas no relacionadas sean consideradas como
metabolismo lento de M. tuberculosis, los resultados idnticas sea menor del 5%. Adems, un marcador debe
tardan de 21 a 28 das. Esta lentitud es un gran inconve- ser rpido, simple, estable, reproducible y debe ser
niente para su aplicacin en casos clnicos concretos. capaz de tipificar la prctica totalidad de las cepas estu-
La dificultad al trasladar este mtodo a medios lqui- diadas. El marcador gentico de referencia en la actua-
dos, ms rpidos, es la necesidad de redefinir todos los lidad es la tcnica RFLP-IS611033.
parmetros del mtodo: inculo bacilar, concentracin Las tcnicas de restriccin-hibridacin consisten en una
crtica del frmaco y tiempo de lectura3,6. extraccin y la restriccin del ADN de las cepas con
En la actualidad, de los medios lquidos semiautomati- una enzima de alta frecuencia de corte, separacin por
zados, slo el sistema radiomtrico BACTEC 460 per- electroforesis de los fragmentos en funcin de su peso
mite obtener resultados concordantes con los sistemas molecular, transferencia a una membrana e hibridacin
de referencia, para los frmacos de primera lnea, en un con una sonda complementaria de uno de los elementos
tiempo muy inferior (5-10 das) y es el nico aprobado repetidos. De este modo se obtienen patrones con un
por la FDA4,30. Otros sistemas lquidos ms automati- nmero discreto de bandas, que son fcilmente compa-
zados y de ms sencillo manejo (ESP II/ MBBact- rables entre s34,35. Para comparar un nmero elevado de

Med Integral 2002;39(5):207-15 213


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Prez del Molino ML, et al. Diagnstico microbiolgico de la tuberculosis

aislamientos se han desarrollado sistemas automatiza- genesis, protection and control. Washington, DC: ASM, 1994;
p. 85-110.
dos (fig. 1). 10. Gernoch PL, Enns RK, Sanbolle MA, Wallace RJ. Laboratory
El genoma de M. tuberculosis contiene, en general, un diagnosis of the mycobacterioses. Cumitech 16 AAS. In: Weiss-
nmero elevado y variable (5-20) de copias de la se- feld CO, editor. Washington, DC: ASM, 1994.
11. Pfluffer GE, Welscher HM, Kissling P, Cieslak C, Casal M, Gu-
cuencia de insercin IS6110, las cuales se encuentran tierrez J, et al. Comparison of the Mycobacteria growth indicator
en posiciones variables, lo que proporciona a este mar- tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery of
acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1997;35:364-8.
cador un poder discriminativo elevado. Existe un proto- 12. Middleton AM, Chadwick MV, Gaya H. Evaluation of a comer-
colo estandarizado, y aceptado internacionalmente, que cial radiometric system for primary isolatin of mycobacteria
permite comparar los resultados obtenidos en diferentes over a fifteen-year period. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997;
16:166-70 .
laboratorios, por lo que las bases de datos a gran escala 13. Casal M. Pruebas de resistencias a las drogas. En: Microbiologa
permiten seguir la diseminacin de todo el mundo36. En de las enfermedades por micobacterias (tuberculosis, lepra y
cepas con menos de 6 copias de IS6110 el poder es me- micobacteriosis). Crdoba: Ed. Universidad de Crdoba. 1991;
p. 133-50.
nor. Este marcador gentico tiene como inconveniente 14. Vannier AM, Tarrand JJ, Murray PR. Mycobacterial cross conta-
la complejidad de la tcnica y la necesidad de una can- mination during radiometric culturing. J Clin Microbiol 1988;26:
1867-8 .
tidad apreciable de ADN, por lo que se realiza sobre 15. Pfyffer GE, Welscher HM, Kissling P, Cieslak C, Casal MJ, Gu-
cultivos de micobacterias32. tierrez J, et al. Comparison of the Mycobacteria Growth Indica-
Las principales aplicaciones de la genotipificacin de tor Tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery
of acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1997;35:364-8 .
cepas de M. tuberculosis34-36 son: a) estudios epidemio- 16. Palaci M, Mizuka SY, Sato DN, Da Silva MA, Curcio M, Mat-
lgicos poblacionales; b) diferenciacin entre recidiva heus EA. Evaluation of Mycobacteria Growth Indicator Tube for
recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuber-
y reinfeccin exgena; c) control de la diseminacin de culosis isolated from respiratory specimens. J Clin Microbiol
cepas multirresistentes, y d) deteccin de contamina- 1996;34:762-4 .
ciones cruzadas y otros errores del laboratorio. 17. Pfyffer GE, Cieslak C, Welscher HM, Kissling P, Rsch-Gerdes
S. Rapid detection of mycobacteria in clinical specimens by
En la actualidad se estn estudiando tcnicas comple- using the automated BACTEC 9000 MB system and comparison
mentarias y alternativas, estudios de polimorfismo de la with radiometric and solid-culture systems. J Clin Microbiol
regin DR mediante el anlisis de los oligonucletidos 1997;352:229-34 .
18. Zanetti S, Ardito F, Sanguinetti M, Molicotti P, Delogu G, Pinna
espaciadores (spoligotyping) y las tcnicas de PCR ba- MP, et al. Evaluation of a nonradiometric (BACTEC 9000 MB)
sadas en iniciadores complementarios de secuencias re- for detection of mycobacteria in human clinical samples. J Clin
Microbiol 1997;35:2072-5 .
petidas, con el fin de encontrar tcnicas ms simples y 19. Tortoli E, Cichero P, Chirillo MG, Gismondo MR, Bono L, Gesu
que se puedan aplicar directamente sobre muestras cl- G, et al. Multicenter comparison of ESP Culture System II with
nicas38. BACTEC 460TB and with Lwenstein-Jensen medium for reco-
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