ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD: CIENCIAS PECUARIAS

CARRERA: INGENIERA EN INDUSTRIAS PECUARIAS INDUSTRIAL
TEMA: CRECIMIENTO MICROBIANO DENSIDAD PTICA

1. INTRODUCCION

La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las investigaciones

biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin
absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de
soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud de ondas que pertenecen al espectro
visible; el agua absorbe fuertemente en la regin del infrarrojo.
La absorcin de las radiaciones ultravioleta, visibles e infrarrojas depende de la estructura
de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica.
Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa
radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la
luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de
onda no absorbida.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo general

Establecer la curva de crecimiento microbiano usando las mediciones de densidad ptica.

2.2. Objetivo especifico

Conocer la velocidad de crecimiento en la fase exponecial.

3. METODOLOGA

Preparar medio extracto de levadura (YE)

Medir la densidad ptica del medio en un tubo de ensayo
Inocular 1 colonia del organismo o 0,1 ml de una suspensin microbiana en el tubo con
8ml de YE.
Usar para ello el asa de platino esterilizada a la llama del mechero o una pipeta estril.
Agitar en el vrtex.
Marcar el tubo con el nmero de grupo de trabajo.
Incubar el tubo con el cultivo a 37 C en la cmara de incubacin correspondiente.
Realizar la medicin de la absorbancia en el espectrofotmetro. Repetir la medicin cada
24 horas.
Desarrollar las grficas de crecimiento microbiano

4. EQUIPOS Y MATERIALES:
Tubos de ensayo estriles
Tampones estriles
Gradillas
Pipetas Pasteur estriles
Medio extracto de levadura

5. MARCO TEORICO:
La medicin de la densidad ptica en el espectrofotmetro es el mtodo ms habitual
para el seguimiento del crecimiento de un cultivo bacteriano.
La medicin de alcuotas o muestras del cultivo a lo largo del tiempo, permite desarrollar
curvas de crecimiento de la poblacin bacteriana. Ello permitir, a su vez, la comparacin
de tasas de crecimiento en diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones
ptimas, etc.
El incremento en el nmero de clulas es lento al principio y despus llega a ser de forma
exponencial.

En la curva se distinguen:
Fase de latencia. Fase de adaptacin de las clulas a las nuevas condiciones del medio de
incubacin al que han sido transferidas
Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las clulas se estn dividiendo
regularmente a ritmo constante.
Fase estacionaria. El n de clulas no se incrementa ms porque los nutrientes del medio
se van agotando y posibles sustancias txicas pueden ir acumulndose.
 6. PROCEDIMIENTO:

Preparar medio extracto de levadura (YE)

Inoculamos 1 colonia del organismo en el tubo con 8ml de YE y para ello usamos el asa
de platino una vez que este esterilizada a la llama del mechero.

Despues el tubo de ensayo lo ponemos agitar en el vortex para luego marcarlo con el
nmero de grupo de trabajo que corresponda.

Procedemos a realizar la respectiva incubacion, el tubo con el cultivo a 37 C en la

cmara de incubacin correspondiente.
Biomasa despus de de 24 horas despues de haber realizado el cultivo

Biomasa despus de de 96 horas despues de haber realizado el cultivo

Biomasa despus de de 120 horas despues de haber realizado el cultivo

Biomasa despus de de 144 horas despues de haber realizado el cultivo

Curva de crecimiento
 Chart Title
6

0
00 horas 24 horas 72 hora s 96 horas 120 hora s

7. Conlusiones

8. Recomendaciones

9. BIBLIOGRAFA:
Madigan, M.; Martinko, J. y Parker, J. 2004. Biologa de los Microorganismos. Dcima
edicin.

ANEXOS CUESTIONARIO

Describir 3 tcnicas distintas para cuantificar la concentracin de biomasa [X] en una

suspensin celular.

Medida de la Biomasa

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es

utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad
metablica, o de un constituyente metablico o qumico.

Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y

confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud.
Microscopio de Epifluorescencia

El microscopio de epifluorescencia es un microscopio ptico. En un microscopio

ptico convencional la luz atraviesa la muestra estudiada, mientras que en un
microscopio de epifluorescencia la luz que incide sobre la muestra estudiada no
la atraviesa sino que el mismo lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra.
Su funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas
molculas denominadas fluorocromos.

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotn de

una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotn incidente
de una longitud de onda caracterstica. La parte de la molcula que emite la
fluorescencia se denomina fluorforo. Las molculas de fluorocromo se utilizan
para marcar ciertas estructuras celulares destacndolas del resto de los
elementos que componen la clula. Esto permite identificar distintas molculas o
conjuntos de molculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos
elementos celulares o puede ser acoplado qumicamente a otras molculas como
anticuerpos que reconocen especficamente cierto componente celular.

Figura 4 - Fluorforo "Stokes shift"

En el pasaje de los electrones del estado excitado al estado estable se pierde

energa. Como resultado el espectro de emisin de un fluorforo excitado se
corre hacia una longitud de onda mayor en relacin al espectro de excitacin. Es
lo que se denomina "Stokes shift".

Figura 5 - Esquema de funcionamiento

Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que

es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o
centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el

espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad
de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de
clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio
intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma
y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la
cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego
de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no
inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio
intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas

bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el
secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta
tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que
diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran
nmero de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la

clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna
degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad
relativa alta.

Qu aplicaciones considera se puede dar al conocimiento de la cintica de crecimiento

microbiano.