ELEKTROFOREZA

Osnovna naela

Elektroforeza je proces u kojemu otopljena tvar ili estica efektivnog naboja Q

putuje u viskoznom puferu pod djelovanjem elektrinog polja prema jednoj od
elektroda ovisno o prirodi njenog naboja. Sila putovanja koja djeluje na esticu koja
putuje stalnom brzinom jednaka je otporu trenja, f, koji estica mora svladati u
viskoznom puferu.
X.Q=f
gdje je X jakost elektrinog polja koja je jednaka omjeru izmeu napona E (V) i
udaljenosti izmeu elektroda d (cm), a Q je naboj estice. U gelovima je otpor trenja
sloena funkcija gustoe gela i veliine estice.
Elektroforetska pokretljivost ovisna je o brojnim initeljima kao to su:
velina, oblik, koncentracija, elektrini naboj, stupanj hidracije i disocijacije
estice
viskoznost, pH, temperatura i ionska jakost pufera
jakost elektrine struje i
vrijeme putovanja
Odnos izmeu elektroforetske pokretljivosti, brzine pokretljivosti, jakosti elektrinog
polja, pH i ionske jakosti pufera jednako se odnosi i na slobodnu elektroforezu u
viskoznom puferu i na zonsku elektroforezu.

Zonska elektroforeza
Zonska elektroforeza oznaava putovanje nabijenih estica unutar granica vrstog
elektroforetskog nosaa, a naziv je dobila po tome to je svaka nabijena estica nakon
odvajanja izolirana u pojedinanu zonu na elektroforetskom nosau. Na
elektroforetsku pokretljivost estice i otrinu odvajanja djeluju razliiti initelji,
ovisno i o vrsti elektroforetskog nosaa. To su: adsorpcija, nehomogenost i kapacitet
elektroforetskog nosaa, elektroendoosmoza, protok pufera mostiima i dr.
Zonska se elektroforeza provodi u elektroforetskoj kadi koja sadri dva puferska
odjeljka spojena anodom i katodom. Kao izvor elektrine struje slui ispravlja niskog
ili visokog napona. Dodatni dio, kod visokonaponskih elektroforeza, je ploa koju je
mogue hladiti.
U zonskoj elektroforezi koriste se razni nosai kao to su filtar papir, acetat celuloza,
agar, agaroza, krob i akrilamid. Filtar papir u elektroforezi slui jedino kao potporni
elektroforetski nosa koji ne prenosi toplinu i ima mali uinak na sam proces
odvajanja nabijenih estica. Stoga se nabijene estice u takvom elektroforetskom
nosau odvajaju uglavnom prema gustoi naboja. Nasuprot tomu, agar, agaroza, krob
i akrilamid se odlikuju velikom viskoznou i velikim otporom trenja. Oni, osim to
sprijeavaju prijenos topline i smanjuju difuziju, aktivno sudjeluju u postupku
odvajanja djelujui na elektroforetsku pokretljivost nabijenih estica, to je ovisno o
njihovoj veliini. Rezultat ovog djelovanja je da se estice u agaru, agarozi, krobu i
akrilamidu odvajaju i prema gustoi naboja i prema veliini. Svojstvo
elektroforetskog nosaa da razlikuje molekule prema njihovoj veliini pripisuje se
njegovom kapacitetu prosijavanja zbog ega je ovaj uinak dobio naziv uinak
molekularnog prosijavanja. On nije jednako izraen u svim vrstama elektrofretskih
nosaa. Dok je neznatno izraen u agaru, u krobu i akrilamidu ima glavnu ulogu.
Elektroforeza na acetat-celulozi
Odvajanje nabijenih estica na acetat-celulozi takoer se osniva na razlici u gustoi
naboja. Acetat-celuloza je elektroforetski nosa glatke povrine i jedinstvene
veliine pora pa adsorpcija, elektroendoosmoza i protok pufera mostiima
djeluju na odvajanje nabijenih estica u znatno manjoj mjeri nego kod nosaa
poput filter papira, pa je i razdvajanje bolje.
Acetat-celuloza nastaje obradom hidroksilnih skupina celuloze anhidridom octene
kiseline. Svojstva elektroforetskog nosaa od acetat-celuloze ovisna su o
stupnju acetilacije, postupku predpranja prigodom same izrade, vrsti aditiva,
veliini pora i debljini nosaa.
Acetat-celuloza kao nosa koristi se za elektroforetsko razdvajanje proteina u serumu,
mokrai, likvoru kao i za razdvajanje razliitih varijanti hemoglobina.
Elektroforeza proteina u serumu ja dobar test pretraivanja, prvenstveno za otkrivanje
monokonskih proteina. Takoer je dobar pokazatelj funkcije jetre, bubrega i
imunolokog sustava.
Po zavretku elektroforeze razdvojene proteinske frakcije se oboje, suviak boje
ispere, trake uine prozinima i denzitometrijski odredi relativni brojani udio
pojedinih proteinskih frakcija (slika 1.).

Slika 1.: Elektroforeza proteina u serumu na acetat-celulozi :

1. slika monoklonske gamapatije
2. i 4. slike poliklonske hipergamaglobulinemije
3. slika normogamaglobulinemije

Elektroforeza na akrilamidnom gelu (PAG, SDS-PAG)

Akrilamidni gel je slian agaroznom gelu ali sadri pore koje zbog svoje veliine
usporavaju elektroforetsku pokretljivost veih molekula. Zbog toga na odvajanje,
osim gustoe naboja, djeluje i uinak molekularnog prosijavanja. Obrada proteina s
natrij-dodecilsulfatom (SDS) uklanja uinak elektrinog naboja na elektroforetsku
pokretljivost. Kako se molekule bjelanevina i SDS veu u stalnom teinskom
odnosu, naboj po jedinici mase je stalan i elektroforetska pokretljivost postaje
funkcija molekulske mase proteina.
Tehnika SDS-PAGE u kombinaciji s vrlo osjetljivom metodom bojenja proteina
srebrom omoguuje identifikaciju proteinskih frakcija u biolokim tekuinama s
niskim koncentracijama proteina (likvor, urin, suze), ali se isto tako moe
koristiti u istraivake svrhe (istraivanja proteinskog sastava homogenata tkiva
i stanica, medija staninih kultura i td. (slika 2.).
Slika 2.: SDS elektroforeza proteina u mokrai uz bojenje srebrom

Izoelektrino fokusiranje
Izoelektrino fokusiranje (IEF) je elektroforetska tehnika u kojoj se odvajanje
proteina provodi na osnovi razlike u njihovim elektroforetskim tokama. Izoelektrina
toka proteina jednaka je pH vrijednosti otopine kod koje su proteini elektriki
neutralni. Ona je ovisna o sastavu proteina i prema tome je fizikalno-kemijska
konstanta za svaki protein. Kako je odnos aminokiselina i njihov broj razliit za svaki
protein, raspon izoelektrinih toaka je vrlo irok.
Elektroforeza se provodi u gelu poliakrilamida u kojem je prethodno uspostavljen
postojan pH gradijent izmeu dviju elektroda. Gradijent se uspostavlja pomou
smjese noseih amfolita (organske baze i kiseline) koji se rasporede u gelu prema
njihovim izoelektrinim tokama kad se gel podvrgne djelovanju elektrine struje
(prefokusiranje).
U fazi fokusiranja ispitivani proteini putuju prema anodi ili katodi, ovisno o njihovom
naboju odnosno prema zoni koja ima pH vrijednost jednaku njihovoj izoelektrinoj
toki. Kako su u toj toki proteini elektriki neutralni, oni gube elektroforetsku
pokretljivost i fokusiraju se u uskoj zoni. Izoelektrino fokusiranje je prema tome
ravnotena tehnika u kojoj ne postoji uinak difuzije i stoga je izuzetno osjetljiva
tehnika.
Tehnika izoelektrinog fokusiranja koristi se u laboratorijskoj dijagnostici za
razdvajanje raznih varijanti hemoglobina, odreivanje fenotipova -1antitripsina,
razdvajanje oligoklonskih IgG i td.
Izoelektrino fokusiranje izvodi se na gotovim, komercijalnim PAG ploama
razliitog pH raspona koji se postie dodatkom raznih amfolina. Gel privren na
GelBond film pomou par kapi vode prilijepi se na plou s hlaenjem u kadi za
elektroforezu. Mostie od debelog filtar papira uronjene u anodnu i katodnu otopinu
postavi se na rubove gela i spoje elektrode. Nakon prefokusiranja, nanesu se uzorci u
eljeno podruje pH. Po zavretku izoelektrinog fokusiranja na gelu, fiksiranja
razdvojenih proteina izvodi se bojenje bilo srebrom bilo bojom kao to je Coomassie-
Blue (slika 3.)

Slika 3.: Izoelektrino fokusiranje seruma i likvora uz bojenje s Coomassie-Blue