Histoqumica de tejidos vegetales

Histochemistry of plant tissues

Pedro Valadez Ramrez, Colegio de Postgraduados, Postgrado en Fitosanidad-Fitopatologa, km

36.5 Carr. Mxico-Texcoco, Montecillo, Texcoco, Edo. Mxico, C.P. 56230, Mxico.
Correspondencia: valadez.pedro@colpos.mx

Resumen. Este estudio se realiz con la finalidad de detectar lpidos, almidn, cido
desoxiribonucleico, calosa y protenas en diferentes tejidos vegetales con pruebas histoqumicas
especficas y observacin por microscopa. Los resultados demostraron que fue posible relacionar
la tincin de algn tejido especfico con su papel en algunos de los mecanismos celulares donde
participan una o ms de las molculas aqu estudiadas, as por ejemplo, la tincin especfica de una
regin del cmbium vascular con azul mercrico de bromofenol indic que este tejido juega un
papel importante en la divisin celular donde las protenas intervienen activamente. Sin embargo,
las pruebas histoqumicas no fueron eficientemente especficas en la distincin de las molculas en
tejido foliar, sugiriendo la necesidad de abordar esta problemtica en estudios posteriores con la
finalidad de evitar malinterpretaciones. En este documento se integran adems algunas de las
aplicaciones de las pruebas histoqumicas en diversas reas cientficas y particularmente en el
campo de la Fitopatologa.

Palabras clave adicionales: tincin, macromolculas, microscopa.

Abstract. The aim of this study was to detect the presence of lipids, starch, deoxyribonucleic acid,
callose, and proteins in different plant tissues through the use of specific histochemical tests and
microscopy. Results showed that it was possible to establish a positive relationship between
staining of a specific plant tissue and its role in some of the cellular mechanisms where probably
more than one of the molecules studied is involved. This last idea could be explained by specific
staining of vascular tissue with mercuric bromophenol blue because of its crucial role in cellular
division where proteins are actively implicated. Conversely, some of the tests dealed in this report
did not function properly in distinguishing the molecules in leaf tissues, suggesting that further
improvement was necessary. Some of the current applications of histochemical tests in different
scientific areas, and particularly in Plant pathology are also included.

Additional keywords: stains, macromolecules, microscopy.

Las pruebas histoqumicas, tambin abordadas en la literatura cientfica como marcadores

histoqumicos (Sandoval et al., 2005) facilitan la localizacin de varios metabolitos en el sitio de
su accin o sntesis (Dubey y Trivedi, 2012) y se han empleado con xito para el discernimiento
de algunos mecanismos de interaccin planta-patgeno (Lorena et al., 2001; Baarlen et al., 2007;
Toffolatti et al., 2012) y en estudios botnicos (Marin et al., 2010; Sandoval et al., 2005).
De acuerdo con varios reportes, las pruebas histoqumicas empleadas con mayor frecuencia
incluyen el azul mercrico de bromofenol para la deteccin de protenas (Mazia et al., 1953; Sharaf,
2009; Dubey y Trivedi, 2012), lugol para almidn (Brunner, 1975; Magel, 1991), rojo de rutenio
para pectinas (Luft, 1971), DAPI (4,6-diamino-2-fenilindol) para ADN (Coleman y Goff, 1985;
Kapuscinski, 1995; Marcone et al., 1996), azul de anilina para calosa (Currier y Strugger, 1956) y
Sudn IV para la deteccin de lpidos (Marin et al., 2010).
El objetivo de esta prctica consisti en utilizar diferentes pruebas histoqumicas para la
localizacin de molculas especficas en diferentes tejidos vegetales con microscopa de
fluorescencia y ptica.
Se emplearon cortes transversales y longitudinales de tallos de jitomate (Solanum
lycopersicon) y hojas de limn rugoso (Citrus jambhiri) obtenidos con un microtomo de
congelacin (AO Instrument Co., Mod. 880, Buffalo, NY, EE.UU.) previa inmovilizacin con CO2
(INFRA S.A. de C.V., Mxico). Por otro lado, tambin se utilizaron cortes verticales de un
tubrculo de papa (Solanum tuberosum) y de semillas de frijol (Phaseolus vulgaris) embebidas en
agua para la localizacin de almidn y protenas, respectivamente.
Las secciones obtenidas se colocaron en cajas Petri con agua y posteriormente se transfirieron
a portaobjetos de vidrio con una a dos gotas del colorante de cada prueba histoqumica (Cuadro 1)
incubndose a temperatura ambiente (~25C) durante al menos 20 min. Para la prueba con Sudn
IV, luego de la incubacin la preparacin se enjuag con un tren de soluciones de alcohol etlico
50% (v/v), alcohol etlico 30% (v/v) y agua destilada. Para la prueba con azul mercrico de
bromofenol, luego de la incubacin la preparacin se enjuag con agua de grifo.
 Los montajes se realizaron en el mismo colorante de cada prueba histoqumica y se
observaron en un microscopio ptico o de fluorescencia. En cada preparacin se registraron los
tejidos que mostraron la coloracin de reaccin tpica (positiva) para cada molcula (Cuadro 1).
Las pruebas histoqumicas con azul de anilina (Figura 1A) y DAPI (Figura 1B) detectaron la
presencia de calosa en un tubo criboso del floema y ADN en estructuras vasculares y
particularmente en engrosamientos de tipo anular del xilema.
Particularmente con las pruebas de azul mercrico de bromofenol y Sudn IV en hojas de
limn rugoso y jitomate siempre se present el problema de una tincin inespecfica en los tipos
celulares de estos tejidos, situacin que dificult su observacin en el microscopio ptico debido a
que las coloraciones esperadas (azul o naranja) se registraron en prcticamente todo la preparacin
(Figura 2A y 2B, imgenes digitales). La explicacin de este hecho est en proceso de
entendimiento.
La prueba histoqumica de lugol con tejido de tubrculo de papa mostr la coloracin azul
intenso tpica de la presencia de almidones, los cuales se vieron contenidos en forma de gotas
minsculas en clulas con pared delgada, de forma lobada o prismtica altamente compactadas
entre s, que por las caractersticas podra tratarse de parnquima (Figura 3A). La deteccin de
protenas en cortes transversales de semillas de frijol embebidas en agua y prximas a germinar
tambin fue exitosa al evaluarse con la prueba histoqumica con azul mercrico de bromofenol. En
este caso, prcticamente toda la superficie del cotiledn mostr la coloracin azul tpica de la
presencia de esos polmeros, aunque algunas zonas de la testa tambin mostraron semejante
resultado (Figura 3B, imagen digital).
La presencia de protenas en cortes transversales y longitudinales de tallo de jitomate se
registr casi exclusivamente en el cmbium vascular (cv en Figura 3C), donde obviamente juegan
un papel importante en el proceso de divisin celular; sin embargo, tambin fue notoria la
expresin del colorante en las placas cribosas del floema (pcf en Figura 3C), lugar donde se aloja
la protena-P. En el resto de los tipos celulares de este tejido no se evidenci la presencia de estas
macromolculas. Por otro lado, tambin se evidenci la presencia de lpidos con la prueba
histoqumica con Sudn IV, mayoritariamente en la cutcula (dada la presencia de ceras
epicuticulares) (ce en Figura 3D), tejido vascular (floema, cambium vascular y xilema) (f, cv y x
en Figura 3D) y mnimamente en las clulas de la corteza y mdula (c y m en Figura 3D).
 Estos resultados sugieren que existe una relacin entre el tipo celular (y la presencia de la
molcula correspondiente) y su reaccin positiva (o negativa) con la prueba histoqumica
especfica. Por otro lado, tambin es claro que es necesario incluir ms repeticiones (observaciones)
de tal manera que los datos obtenidos se apeguen ms a la realidad y se descarten los errores
cometidos involuntariamente en el transcurso de los protocolos desarrollados.

LITERATURA CITADA
Baarlen P, Woltering EJ, Staats M and Van KJ. 2007. Histochemical and genetic analysis of host
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 Cuadro 1. Pruebas histoqumicas.
Prueba histoqumica Coloracin de la reaccin Microscopa
DAPI Blanco azuloso Fluorescencia
Azul de anilina Verde fluorescente Fluorescencia
Sudn IV Naranja ptica
Azul mercrico de bromofenol Azul ptica
Lugol Azul oscuro ptica
 Figura 1. Pruebas histoqumicas con azul de anilina (A) y DAPI (B) en cortes longitudinales
de tallo de jitomate. Los asteriscos presentes en ambas figuras sealan los sitios de localizacin de
las molculas blanco (en A: calosa en tubo criboso del floema y en B: ADN en engrosamientos de
tipo anular del xilema).

Figura 2. Pruebas histoqumicas con azul mercrico de bromofenol (A) y Sudn IV (B) en cortes
transversales de foliolos de limn rugoso (A) y jitomate (B). Ntese la tincin inespecfica
(generalizada).
Figura 3. Pruebas histoqumicas para la deteccin de almidn en corte transversal de tubrculo
de papa (A), de protenas en semilla de frijol (B) y en tallo de jitomate (C), adems de lpidos en
tallo de jitomate (D). *: testa, **: cotiledn; pcf: plac cribosa del floema; cv: cmbium vascular;
ce: ceras epicuticulares; f: floema; cv: cmbium vascular; x: xilema, c: corteza, m: mdula.