Experimento N 10 (dos semanas)

Anlisis de la composicin de la leche

Introduccin
Los lpidos son uno de los mayores constituyentes de los alimentos, y son muy
importantes en nuestra por diversas razones. Son la mayor fuente de energa y proveen
lpidos esenciales. Sin embargo el consumo en exceso puede ir en detrimento de la
salud, como por ejemplo colesterol y grasas saturadas. En muchos alimentos los lpidos
juegan un papel determinante en las caractersticas fsicas del producto, tales como
sabor, textura, apariencia, palatabilidad, etc.
Los lpidos constituyen un conjunto de biomolculas que presentan muy baja
solubilidad en agua y pueden extraerse de los materiales biolgicos por medio de
solventes orgnicos de baja polaridad (ter de petrleo, ter etlico, hexano, cloroformo,
por ejemplo). Aparecen principalmente en las membranas biolgicas (tanto en la
membrana celular como en las de las diferentes organelas); tambin como material de
reserva energtica en las clulas adiposas, de los organismos pluricelulares y
polisistmicos o bajo forma de gotas aceitosas en algunos seres unicelulares aunque sus
funciones son mucho ms variadas. Entre los lpidos estn los cidos grasos libres
(saturados e insaturados), los glicridos (acilglicridos, fosfoglicridos) y otros tipos de
fosfolpidos, ceras, esteroides entre otros.
Debido a la variedad estructural de las sustancias que caen en esta definicin, la
nica prueba para sospechar que una sustancia es un lpido lo es su condicin de
extractable con los solventes orgnicos de escasa polaridad. As, las pruebas que
generalmente se utilizan para dichos compuestos se limitan a subgrupos de los mismos.
Se han descrito varios mtodos para efectuar los extractos lipdicos. Todos se
caracterizan porque deben destruir la estructura celular con soluciones que desarticulan
las membranas a la vez que precipitan las protenas; posteriormente, con los solventes
de poca polaridad, se da la extraccin propiamente dicha. Una prueba muy usada es la
determinacin de la presencia de lpidos insaturados (esteroles, cidos grasos
insaturados, triglicridos o fosfoglicridos enlicos). Esta consiste en la reaccin de la
muestra con vainillina en un medio cido para obtener compuestos de coloracin roja.
Compuestos lipdicos constituidos por cidos grasos saturados, pueden dar esta reaccin
como consecuencia del tratamiento con cido sulfrico concentrado en caliente a que
son sometidos.
Una clase de lpidos de gran importancia es la de los esteroides. Estos poseen
diversas funciones que van desde la hormonal (progesterona y testosterona) hasta la de
participacin en membranas (colesterol), dndole a stas rigidez y baja permeabilidad.
La identificacin de dichos compuestos se lleva a cabo con la prueba de Libermann-
Bouchard, que se basa en la obtencin de compuestos coloreados (variando del verde al
azul oscuro) al agregarle cido sulfrico a una solucin del esterol en anhdrido actico.
Finalmente, otros constituyentes de la membrana de gran importancia son los
fosfolpidos. Dada su anfipaticidad, estos compuestos son ideales para ala
estructuracin de la doble capa de lpidos. Una forma sencilla de determinar la presencia
o ausencia de un fosfolpido en una muestra (aunque no es definitiva) es la
determinacin de fsforo en la misma. Para esto el fosfolpido se mineraliza por
oxidacin con cidos concentrados (perclrico y ntrico). Una vez ocurrida la
mineralizacin, el fosfato orgnico se transforma en fosfato inorgnico y se determina

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por medio de la formacin de complejos derivados del heptamolibdato de amonio en
medio cido y su posterior reduccin y formacin del complejo azul de molibdeno.
En la naturaleza hay una gran variedad de lpidos. Variedad que no se refiere
solamente al nmero de molculas existentes, sino a la diversidad de formas qumicas
en que se presentan. Como consecuencia de ello, a lo largo del tiempo de desarrollo de
la qumica orgnica y de la bioqumica, se han presentado muchos intentos de
clasificacin. Nosotros ofrecemos la que aparece en la prxima pgina porque nos
parece la ms lgica.

Materiales, equipo e insumos

Agitador Vortex .
Bao de agua hirviendo.
Baos de temperatura controlable.
Beakers de 250 mL.
Cromatofolios de gel de slice de 5,0 cm de base por 6,5 cm de alto.
Gradillas para tubos de ensayo de 16100 mm.
Estufa a 50C (1), Papel de filtro de 11 cm de dimetro.
Pipetas graduada de 5.0 mL.
Pipetas graduada de 10.0 mL.
Probetas de 5 mL.
Probetas de 10 mL.
Tubos de ensayo de 16100 mm.
Vidrios de reloj de 9 cm de dimetro

Reactivos requeridos (por grupo de laboratorio)

cido actico glacial (50 mL)

cido fosfrico concentrado 85% m/m. (240 mL)
cido sulfrico concentrado (95-98%). (100 mL+ 6 mL+ 250 m + 35 mL )
cido tricloroactico al 9% m/v (150 mL)
cido tricloroactico al 6% m/v (100 mL)
Buffer de fosfato 0.1 M, pH 7.2 (100 mL)
Disuelva 1,200 g de fosfato dicido de sodio en 90 mL de agua destilada, ajuste el
pH a 7.2 con hidrxido de sodio 10% y lleve a 100 mL en un baln aforado. Guarde
en refrigeracin y en una botella oscura.
ter de petrleo 40-60C (500 mL)
Hidrxido de sodio 1.0 M (100 mL)

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 Hidrxido de sodio 0.33 M (100 mL)
Hidrxido de sodio 0.1 M (100 mL)
Leche para analizar (50 mL por equipo)
Metanol (150 mL)
Patrn de cido oleico de 15 mg/mL (10 mL)
Agregue 150 mg de cido oleico grado reactivo en un baln aforado de 10 mL.
Diluya y afore con etanol absoluto. Es estable por un mes si se guarda en
refrigeracin a 4-7C.
Patrn de cido oleico de 1 mg/mL (10 mL)
Disuelva 10 mg de cido oleico en 10 mL de ter de petrleo (40-60 C).
Patrn colesterol libre de 10 mg/mL (10 mL)
Agregue 100 mg de colesterol en un baln aforado de 10 mL. Diluya y afore con
cido actico glacial. Es estable por un mes si se guarda en botella oscura a
temperatura ambiente.
Patrn colesterol libre de 1 mg/mL (10 mL)
Disuelva 10 mg de colesterol libre en 1,0 mL de etanol 95% y luego agregue 9,0
mL de ter de petrleo (40-60 C).
Patrn de tripalmitina de 1 mg/mL (10 mL)
Disuelva 10 mg de tripalmitina en 10 mL de ter de petrleo (40-60 C). Ayude al
proceso de disolucin calentando entre 40-50 C.
Reactivo de antrona (fresco) (150 mL)
Se coloca en bao de hielo un vaso de precipitados de 150 mL de capacidad con 80
mL de H2SO4 concentrado y se dejan 15 minutos para que se enfre. Se agregan
lentamente, con constante agitacin con varilla de vidrio, 200 mg de antrona. Una
vez disuelta, se aaden 15.0 mL de agua destilada y se mezclan. Por ltimo se
agregan 5,0 mL de etanol 95% y se mezclan.
Reactivo de Biuret (1000 mL)
Disuelva 1,5 g de sulfato de cobre II pentahidrato (CuSO45H2O) en 500 mL de
agua destilada. Sobre esta solucin, disuelva 6,0 g de tartrato de sodio y potasio
tetrahidrato (C4H4O6-Na+K+4H2O). Vierta sobre la mezcla anterior 300 mL de
solucin de hidrxido de sodio (NaOH) al 10%. Afore la disolucin final a 1000
mL con de agua destilada. Coloque la solucin en una botella de plstica oscura y
almacene a temperatura ambiente. Si se agrega 1 g de yoduro de potasio para
inhibir la reduccin del in cobre, la solucin es estable indefinidamente.
Reactivo de fenol al 80% p/p (20 mL)
En una balanza granataria coloque un beaker de 150 mL, agregue al mismo 80 g de
fenol re-destilado. Agregue posteriormente 20 mL de agua destilada. Mezcle bien
y transfiera a una botella de vidrio transparente y guarde al ambiente. La solucin
es estable por meses. Puede aparecer una tonalidad amarilla que no interfiere con la
determinacin.
Reactivo de Fosfovainillina (21 mg/mL) (250 mL)
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 Coloque 10,0 mL de Reactivo de Vainillina de 21 mg/mL y 30 mL de agua en un
erlenmeyer de 100 mL. Agregue 60 mL de cido fosfrico concentrado con
agitacin constante. Es estable por dos meses a temperatura ambiente si se guarda
en botella oscura.
Reactivo de Vainillina (21 mg/mL): Disuelva 210 mg de vainillina en 50 mL de
agua y afore a 100 mL en un baln aforado. Es estable por dos meses a temperatura
ambiente si se guarda en botella oscura.
Reactivo de Liebermann: (120 mL)
En un beaker de 250 mL, mezclar 60 mL de anhdrido actico con 30 mL de cido
actico y 10 mL de cido sulfrico concentrado. Se debe preparar en fro.
Reactivo de Liebermann-Bouchard: (450 mL)
En una botella mbar de 500 mL con tapn plstico agregue 220 mL de anhdrido
actico fro y 200 mL de cido actico glacial a temperatura ambiente. Tape y
mezcle por inversin y agregue 30 mL de cido sulfrico concentrado fro. Tape y
mezcle por inversin. El reactivo es estable por 6 meses si se guarda entre 4 y 7C..
Reactivo de Lugol: (150 mL)
Se disuelven 2 g de KI en 40 mL de agua destilada, a esta disolucin se agregan
0.25 g de I2 agitando para disolverlo. Una vez disuelto, se afora a 100 mL de agua
destilada y se mezclan bien. Se guarda al ambiente en una botella oscura
preferiblemente de vidrio.
Reactivo de Molisch: (20 mL)
Se disuelven 0,5 g de alfa-naftol en 10 mL de etanol al 95%. Se debe guardar en
botella oscura para que est libre de exposicin a la luz. Preferiblemente en un
frasco gotero.
Reactivo de Nelson: (50 mL)
Se disuelven 2,8g de Na2HPO4 en 80,0 mL de agua destilada. A esta solucin se
agrega 4,0 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidrato y se mezclan bien. A la
mezcla anterior se aaden 0,8g de CuSO45H2O y se agitan hasta disolver
completamente. A la mezcla resultante se agregan 10 mL de NaOH 1,0 M.
Finalmente, se agregan 18g de Na2SO4 anhidro; se mezclan y se completa a
volumen a 100 mL con agua destilada.
Reactivo de Orcina: (150 mL)
Se disuelven 0,3 g de orcina en 90,0 mL de HCl concentrado. Se aaden 0,1 mL de
una solucin de 300 mg de FeCl3 /mL en HCl 0.1 M y se mezclan. Se completa el
volumen a 100 mL con HCl concentrado. CUIDADO: No se debe usar aspiracin
bucal o pipeteadores mecnicos en pipetas corrientes con cidos concentrados. Si
no se dispone de pipetas Pasteur se puede usar una pera para pipetear.
PRECAUCIN: Siempre se agrega el cido al agua. PRECAUCIN: Se debe
trabajar en la capilla por los vapores de HCl que libera el reactivo.
Reactivo de Seliwanoff (fresco): (100 mL)
Se disuelven 0,05 g de resorcinol en 100 mL de HCl 3M.
Reactivo de Somogyi: (50 mL)

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 Se disuelven 5,33g de (NH4)6Mo7O24.4H2O en 4,4 mL de cido sulfrico
concentrado. Entonces se agregan 96 mL de agua destilada y se mezclan bien.
Finalmente; se aaden 0,6g de Na2HAsO4.7H2O y se mezclan, se agregan 18g de
Na2SO4 anhidro; se mezclan y se completa a volumen a 100 mL con agua destilada.
Reactivo de vainillina: (50 mL)
Preparar vainillina al 1% m/v en agua destilada.
Reactivo eluyente: (300 mL)
Se mezclan 90 mL de ter de petrleo (40-60 C), con 10 mL de ter dietlico y 1
mL de cido actico glacial 100% m/m.
Revelador de diclorofluorescena: (100 mL)
Disuelva 200 mg de 2-7diclorofluorescena en 100 mL de etanol 95%.
Solucin de cloruro de sodio 0,15 M: (1000 mL)
Disuelva 8,27 g de cloruro de sodio (NaCl) en 900 mL de agua destilada y afore a
1000 mL con agua destilada. Coloque la solucin en una botella de vidrio clara y
almacene a temperatura ambiente. La solucin es estable indefinidamente.
Solucin de hidrxido de sodio al 10%: (300 mL)
Disuelva 30g de hidrxido de sodio (NaOH) en 200 mL de agua destilada y afore a
300 mL con agua destilada. Coloque la solucin en una botella plstica clara y
almacene a temperatura ambiente. La solucin es estable indefinidamente.
Solucin patrn de albmina de suero bovino (10 mg/mL):
En una balanza analtica, pese 1.000g de albmina de suero bovino seca y
transfiralos cuantitativamente a un baln aforado de 100 mL con cerca de 75 mL
de solucin de cloruro de sodio (NaCl) 0,15 M. Agite la mezcla dentro del baln
hasta que se disuelva completamente, calentando si fuese necesario. Afore a la
marca y coloque la solucin en una botella plstica oscura. Almacene en un
congelador.
Solucin patrn de almidn (150 g/mL):
Pese 150.0 mg de almidn soluble seco y disulvalos en 800 mL de buffer de
fosfatos 0.1 M, pH 7.2 caliente, al que se han agregado 8.63 g de cloruro de sodio.
Agregue 5.0 mL de solucin de formalina (formaldehdo al 37%) como
preservante. Afore a 1000 mL a temperatura ambiente y guarde en una botella
plstica oscura, en un congelador.

Solucin patrn de glucosa (100 g/mL):

Transfiera una alcuota de 10.00 mL de la solucin madre de glucosa a un baln
aforado de 100 mL. Afore a la marca con agua destilada y guarde en una botella
plstica oscura, en un congelador.
Solucin madre de glucosa (1 mg/mL): En una balanza analtica, pese 0.1000g de
glucosa seca y transfiralos cuantitativamente a un baln aforado de 100 mL con
cerca de 75 mL de agua destilada. Agite la mezcla dentro del baln hasta que se

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 disuelva completamente. Afore a la marca y guarde en una botella plstica oscura,
en un congelador.
Yodo en cristales

Nota: El estudiante para esta prctica puede traer diferentes tipos de leche, dentro de la
cuales puede incluir la materna, la de bfala etc.

Procedimiento:

1. Extraccin y separacin de componentes

Extraccin Acuosa
1. En cada uno de dos tubos de 16100 mm, ponga 2,5 mL de leche.
2. Agregue a cada tubo, 5 mL de cido tricloroactico 9,0% m/v; con una varilla de
vidrio mezcle suavemente y deje en reposo.
3. Repita la agitacin cada minuto por 3 minutos.
4. Luego de este tiempo, se debe notar la aparicin de grumos que tienden a
sedimentar; de no ocurrir esto, mezcle nuevamente y deje en reposo.
5. Si luego de este segundo perodo no se percibe la presencia de grumos inicie el
proceso nuevamente.
6. Tape el tubo con tapn de hule y centrifugue a mxima velocidad en centrfuga
clnica por 5 minutos.
7. Separe los sobrenadantes y transfiralos a una probeta de 25 mL.
8. Agregue a cada tubo 2,5 mL de cido tricloroactico 6% m/v al centrifugado
obtenido, mezcle muy bien con la varilla de vidrio (deje el lquido adherido a la
varilla escurrir por las paredes del tubo).
9. Repita los pasos 3 a 7.
10. Con agua destilada lleve a 25 mL el volumen de lquido contenido en la probeta.
11. Mezcle y transfiera la solucin resultante a un recipiente rotulado extracto
acuoso.

Extraccin Etrea-Metanlica
1. Transfiere los sedimentos del paso anterior a un solo tubo de ensayo de 16100 mm.
2. Agregue a los sedimentos en el tubo, 2 mL de metanol 99% m/m.
3. Agite enrgicamente durante 3 minutos y deje reposar por 2 minutos.
4. Agregue otros 2 mL y repita el proceso de mezclado.
5. Agregue 2 mL de ter de petrleo (40-60C); coloque el tapn de hule, agite
enrgicamente por 3 minutos y deje en reposo por 2 minutos.
6. Repita este proceso agregando otros 2 ml de ter de petrleo (40-60C).
7. Deben aparecer tres fases ntidamente separadas.
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8. Centrifugue por 5 minutos en centrfuga clnica a mxima velocidad.
9. Traslade la fase lquida superior a una probeta de 25 mL rotulada extracto etreo.
10. Traslade la fase lquida inferior a una probeta de 25 mL rotulada extracto
metanlico".
11. Repita los pasos del 2 al 10 una vez ms.
12. Afore a 25 mL, con ter de petrleo el extracto etreo y guarde dicho extracto en
un recipiente apropiado.
13. Afore a 25 mL, con agua destilada el extracto acuoso y guarde dicho extracto en
un recipiente apropiado.

Extraccin Alcalina
1. Al sedimento centrifugado de la extraccin etrea-metanlica en cada tubo,
agrguele 6 mL de NaOH 1.0 M; suspndalo por agitacin y colquelo en bao
mara por 10 minutos. Enfrelo en bao de agua.
2. Si hay un precipitado fino en el fondo o suspendido, tape el tubo con tapn de hule y
centrifugue a mxima velocidad en centrfuga clnica por 5 minutos.
a. Separe el sobrenadante y transfiralo a una probeta de 25 mL.
b. Agregue al sedimento centrifugado 6 mL de NaOH 0,1 M; suspndalo por
agitacin y colquelo en bao mara por 10 minutos. Enfrelo en bao de agua.
c. Si hay un precipitado fino en el fondo o suspendido, tape el tubo con tapn de
hule y centrifugue a mxima velocidad en centrfuga clnica por 5 minutos.
i. Tape el tubo con tapn de hule y centrifugue a mxima velocidad en
centrfuga clnica por 5 minutos.
ii. Separe el sobrenadante y transfiralo a la probeta de 25 mL con el
sobrenadante de la extraccin con NaOH 1,0 M.
iii. Agregue al sedimento centrifugado 6 mL de agua destilada; suspndalo
por agitacin y colquelo en bao mara por 10 minutos. Enfrelo en bao
de agua.
iv. Tape el tubo con tapn de hule y centrifugar a mxima velocidad en
centrfuga clnica por 5 minutos.
3. Separe el sobrenadante y transfiralo a la probeta de 25 mL con los sobrenadantes
de las extracciones alcalinas anteriores.
4. Complete el volumen a 25,0 mL con NaOH 0,33 M, mezcle y transfiera a recipiente
rotulado extracto alcalino.
5. Identifique cada recipiente y gurdelos en refrigeracin.

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2. Anlisis cualitativo

Realice las siguientes pruebas cualitativas.

Extracto acuoso y metanlico
1. Prueba de Molisch.
2. Prueba de Lugol.
3. Prueba de Nelson-Somogyi.
4. Prueba de Antrona.
5. Prueba de Bial-Orcinol.
6. Prueba de Selliwanoff
7. Prueba del Biuret
8. Prueba de Liebermann
9. Prueba de Vainillina.

Extracto etreo
1. Prueba de Liebermann
2. Prueba de Vainillina.
3. Cromatografa de lpidos

Extracto Alcalino
1. Prueba de Molisch.
2. Prueba de Lugol.
3. Prueba de Nelson-Somogyi.
4. Prueba de Antrona.
5. Prueba de Bial-Orcinol.
6. Prueba de Selliwanoff.
7. Prueba del Biuret

1. Prueba de Molisch
En un tubo de ensayo de 13100 mm se coloca 1,0 mL de analito y 2 gotas del
Reactivo de Molisch y se mezclan. Se agrega 1,0 mL de cido sulfrico
concentrado de manera que forme una capa debajo de la mezcla. Para ello se
inclina el tubo a 45, se apoya la punta de una pipeta Pasteur con el cido en la
pared y se deja fluir el cido por la misma, lentamente, para no romper la
separacin de capas.
CUIDADO: No se debe usar aspiracin bucal o pipeteadores mecnicos en
pipetas corrientes con cidos concentrados. Si no se dispone de pipetas Pasteur

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 se puede usar una pera para pipetear. PRECAUCIN: Siempre se agrega el
cido al agua.
Se observa la interfase formada por el cido sulfrico concentrado y la mezcla
del analito ms el reactivo de Molish y se anotan los resultados.

2. Prueba de Lugol
En un tubo de ensayo de 16100 mm se coloca 1,0 mL de analito (conteniendo
10 mg/mL de carbohidrato) se le agregan, gota a gota, 1,0 mL del reactivo de
Lugol y se agita bien.
Se observa la coloracin de la mezcla y se anotan los resultados.

3. Prueba de Nelson-Somogyi
En un tubo de ensayo de 16100 mm se colocan 0,1 mL de analito (conteniendo
1 mg/mL del azcar), se le aaden 0,5 mL de reactivo de Somogyi; se tapa el
tubo con una bola de vidrio y se coloca en una gradilla colocada en un bao de
agua hirviendo por 10 minutos.
A los 10 minutos se retira el tubo del bao de agua hirviendo, se deja enfriar a
temperatura ambiente y le agrega 0,5 mL de reactivo de Nelson y se mezcla
bien.
Se observa la coloracin de la mezcla y se anotan los resultados.

4. Prueba de Antrona
En un tubo de ensayo de 16100 mm se colocan 0,1 mL de analito y se colocan
en un bao de agua con hielo. Entonces, se le agregan, lentamente y por la pared
del tubo ligeramente inclinado (no es necesario que est a 45) y con constante
agitacin, 1,5 mL del reactivo de antrona que se haba enfriado en el mismo
bao de agua con hielo.
Se tapa la boca del tubo con una bola de vidrio y se coloca en una gradilla en un
bao de agua hirviendo por 10 minutos.
Se observa la coloracin de la mezcla y se anotan los resultados.

5. Prueba de Bial-Orcinol
En un tubo de ensayo de 16100 mm se coloca 1,0 mL de analito (conteniendo 1
mg/mL de carbohidrato) y se le agregan 1,5 mL del reactivo de orcina (se debe
trabajar en la capilla por los vapores de HCl que libera el reactivo).
Se tapa la boca del tubo con una bola de vidrio y se coloca en una gradilla en un
bao de agua hirviendo por 2 minutos.
Se observa la coloracin de la mezcla y se anotan los resultados.

6. Prueba de Selliwanoff
En un tubo de ensayo de 16100 mm se coloca 0,1 mL de analito (conteniendo
10 mg/mL de carbohidrato) y se le agrega 1,0 mL del reactivo de Seliwanoff
recin preparado.
Se tapa el tubo con una bola de vidrio y se pone en bao Mara por 10 minutos.

63
 Se observa la coloracin de la mezcla y se anotan los resultados.
7. Prueba del Biuret
A 1,0 ml de la solucin proteica se le agregan 2,0 mL del reactivo para Biuret.
Se espera 15 minutos y si aparece un color azul-violceo a morado se considera
positivo.

8. Prueba de Liebermann
A 50,0 L de la incgnita se le agregan 2,0 mL de reactivo de Liebermann.
Coloque el tubo en un sitio oscuro (dentro de una alacena, por ejemplo) y espere
15 minutos. La aparicin de un color que puede ir desde el azul al verde, se toma
como positivo.
9. Prueba de Vainillina
A 100,0 L de la solucin problema en un tubo de 13100 mm, se le agregan
100,0 L de cido sulfrico concentrado. Se mezclan, se tapa el tubo con una
bola de vidrio y se pone en bao Mara por 10 minutos. Se saca el tubo del bao,
se deja enfriar a temperatura. Se le aaden 4,0 mL de cido fosfrico
concentrado y se mezcla; luego se le agrega 1,0 mL del reactivo de vainillina.
Se mezcla muy bien y se pone en bao de agua a 35-40C por 15 minutos. La
generacin de un color rojo se toma como positivo.
10. Cromatografa de lpidos
Se emplearn cromatofolios de gel de slice de 5,0 cm de base por 6,5 cm de
alto.
Trace una raya a 1,0 cm de la base del cromatofolio y marque cuatro puntos de
siembra y siembre en cada punto 10 L de los siguientes materiales, de
izquierda a derecha.
a. patrn de tripalmitina de 1 mg/mL,
b. patrn de colesterol libre de 1 mg/mL,
c. patrn de cido oleico de 1 mg/mL,
d. extracto etreo.
Deje que el cromatofolio sembrado se seque.
Mientras se seca el cromatofolio prepare una cmara de cromatografa
colocando en un beaker de 250 mL un cuadrado de papel de filtro de 8,5 cm de
lado, agregando 20 mL del eluyente al vaso y tapndolo con un vidrio reloj de
9,0 cm de dimetro.
Deje la cmara de cromatografa reposar por 15 minutos para que se sature de
vapores.
Una vez transcurrido ese tiempo, coloque el cromatofolio sembrado en la
cmara y permita el ascenso del eluyente por el cromatofolio hasta que el frente
del eluyente llegue a 0,5 cm del borde superior.
Retire el cromatofolio y marque con lpiz la altura que alcanz el eluyente.

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 Deje 15 minutos a temperatura ambiente para que se seque.
Mientras se seca el cromatofolio prepare una cmara de revelado colocando en
un vaso de precipitados de 250 mL unos cristales de yodo y tapndolo con un
vidrio reloj de 9 cm de dimetro.
Transfiera la cmara de revelado a una estufa a una temperatura entre los 37 y
50 C para que se sature con vapores de yodo.
Una vez seco el cromatofolio colquelo en la cmara de revelado de manera que
el yodo no entre en contacto con el cromatofolio.
Djelo por 5 a 10 minutos; para que los vapores de yodo interaccionen con los
materiales en el cromatofolio.
Remueva el cromatofolio de la cmara de revelado y marque con lpiz las zonas
en las que aparecen las manchas de color caf sobre el fondo amarillento.
Determine el Rf de cada patrn y de las manchas que dio la incgnita.
Si las manchas no son bien perceptibles con el revelador de yodo, puede
utilizarse la aspersin con solucin de 1,2-diclorofluorescena una vez
evaporado el yodo, observando luego bajo luz ultravioleta de onda corta.

3. Anlisis Cuantitativo (Segunda Semana)

Determine cuantitativamente los azcares totales por fenol-sulfrico, el almidn por

Lugol y las protenas por Biuret en aquellos extractos en que haya tenido resultados
cualitativos positivos.

Anlisis de Azcares Totales por Fenol-Sulfrico

Utilice tubos de ensayo de 16100 mm. Agregue a cada tubo 2,00 mL de muestra o su
dilucin. Agregue a cada tubo 50 L de reactivo de fenol al 80% p/p y mezcle bien en el
Vortex. Rpidamente agregue a cada tubo 5,00 mL de cido sulfrico concentrado y
mezcle rpido y bien en el Vortex. Deje los tubos en reposo por 30 minutos. El color es
estable por varias horas. Lea la absorbancia a 480-490 nm contra el blanco y anote.
Construya una curva patrn conteniendo 0, 20, 40, 60, 80 y 100 g/mL de glucosa.

Anlisis de Almidones por Lugol

Utilice tubos de ensayo de 16100 mm. Agregue a cada tubo 4,00 mL de muestra o su
dilucin. Agregue a cada tubo 0,50 mL de buffer de fosfatos 0,1M; pH 7,2 y mezcle
bien en el Vortex. Agregue a cada tubo 0,50 mL de reactivo de Lugol y mezcle bien en
el Vortex. Deje los tubos en reposo por 30 minutos. Lea la absorbancia a 570 nm contra
blanco de reactivo y anote. Construya una curva patrn conteniendo 0, 30, 60, 90, 120 y
150 g/mL de almidn.

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Anlisis de Protenas por Biuret
Utilice tubos de ensayo de 16100 mm. Agregue a cada tubo de ensayo 1,00 mL de la
muestra o su dilucin. Agregue a cada tubo de ensayo 5,00 mL de reactivo de Biuret.
Agite bien la mezcla en un agitador Vortex y deje en reposo por 30 minutos. Lea la
absorbancia a 550 nm contra el blanco y anote. Construya una curva patrn conteniendo
0, 2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL de albmina de suero bovino.

Anlisis de Lpidos Insaturados por Sulfo-fosfo-vainillina

Agregue 10 L de agua (blanco), patrn o muestra a un tubo de ensayo de 16x100 mm.
Agregue 100 L de cido sulfrico concentrado a cada tubo y mezcle bien en un
agitador vortex. Coloque los tubos en bao mara por 10 minutos y enfrelos por 5
minutos. Agregue 5 mL de reactivo de fosfovainillina y mezcle en un agitador vortex.
Incube en un bao de agua a 37C por 15 minutos. Enfre los tubos por 5 minutos y lea
a 540 nm en un lapso no mayor a 30 minutos. Construya una curva patrn conteniendo
3, 6, 9, 12 y 15 mg/mL de cido oleico.

Anlisis de Esteroles por Liebermann-Bouchard

Coloque 6 mL de reactivo de Liebermann-Bouchard en un tubo de ensayo de 16X100
mm. Agregue 100 L de cido actico glacial, estndar o muestra y mezcle bien con un
agitador vortex. Coloque los tubos en bao a 37C por 18 minutos. Lea a 650 nm en un
lapso no mayor a 10 minutos. Construya una curva parn conteniendo 2, 4, 6, 8 y 10
mg/mL de colesterol.

Referencias recomendadas

1- http://iesgarciamorato.org/Bio%20y%20Geo/Pract_bioquimica.htm.

2-WingChing-Jones R. y Mora-Chaves E.. 2013. Composicin de la leche entera cruda

de bovinos antes y despus del filtrado. Agronoma mesoamericana, 24(1):203-207.

3- http://www.usc.es/caa/MetAnalisisStgo1/leche.pdf

4-Artica Mallqui Luis. 2014. Mtodos para el anlisis fisicoqumico de la leche y

derivados lcteos, 2a edicin, editorial TEIA, Per.
(https://luisartica.files.wordpress.com/2011/11/metodos-de-analisis-de-leche-20)

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