E1T1 Tesis Control de Garrapatas

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS
Escuela Maya de Estudios Agropecuarios
Hongos entomopatgenos para el control de la garrapata

Rhipicephalus (Boophilus) microplus en laboratorio.
TESIS
Presentada como requisito parcial para
Obtener el ttulo de
INGENIERO AGRNOMO
POR
FRANCISCO JAVIER SNCHEZ MENDOZA
Director de tesis
Dra. Arely Bautista Glvez
Catazaj, Chiapas, Mxico. Octubre, 2014.

Agradecimientos
A Dios por darme fuerzas y acompaarme siempre en mis logros profesionales, en

especial a mis padres y hermanos que me estuvieron apoyando en todo momento.
Por el esfuerzo que tuvieron que hacer para que yo estudiara y terminar mi carrera
profesional.
A mis amigos de la generacin que me brindaron su apoyo y amistad (Leydi

Snchez y Oswaldo Vicente).
A mis Maestros de la carrera que me apoyaron a lo largo de mi formacin

profesional.
A la Fundacin Produce Tabasco por el financiamiento del proyecto:

Evaluacin tcnica y econmica de la Utilizacin de hongos
entomopatgenos en el control Biolgico de garrapata.
A la Dra. Arely Bautista Glvez directora de este proyecto por todo el tiempo, apoyo
y paciencia brindado durante la realizacin de este trabajo.
Al M.C. Cesar Orlando Pozo Santiago que me apoyo en asesoras de laboratorio.
A la Escuela Maya de Estudios Agropecuarios de la UNACH por haber permitido la

realizacin de este trabajo en sus laboratorios.
A la Universidad Tecnolgica del Usumacinta por haberme facilitado su laboratorio

de microbiologa para el aislamiento de los hongos entomopatgenos y el apoyo del
Ing. Ciprian Antonio Garca Cabrera durante mi estancia profesional en dicha
Universidad.
Finalmente quiero agradecer profundamente a nuestro fundador de la Escuela Maya

de Estudios Agropecuarios, al Mtro. Roberto Sosa Rincn por su valioso apoyo
durante mi formacin profesional y a sus atinadas recomendaciones en este
proyecto. Gracias por todo maestro
CONTENIDO
Pgina
LISTADO DE CUADROS I
LISTADO DE FIGURAS .. Ii
RESUMEN Iv
ABSTRACT V
1. INTRODUCCIN. 1
2. OBJETIVOS.
2.1 Objetivo general....... 2
2.2 Objetivo especfico.. 2
3. REVISIN DE LITERATURA
3.1. Generalidades de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) 3
microplus.
3.1.1 Clasificacin Taxonmica. 4
3.1.2 Distribucin. 5
3.1.3 Enfermedades transmitidas por la garrapata 6
3.1.4 Importancia econmica. 7
3.1.5 Morfologa... 8
3.1.6 Hospederos de la garrapata. 10
. 3.1.7 Ciclo biolgico de la garrapata 10
3.2 Hongos entomopatgenos.. 12
3.2.1 Generalidades taxonmicas y morfolgicas de
Metarhizium anisopliae 12
3.2.2 Generalidades taxonmicas y morfolgicas de 14
Beauveria bassiana
3.2.3 Proceso de infeccin de Metarhizium anisopliae y 15
Beauveria bassiana
3.3 Pasos para realizar un bioensayo con hongos 19
entomopatgenos
3.3.1 Parmetros biolgicos de un anlisis Probit 21
3.3.2 Criterios metodolgicos para la elaboracin de un 22
bioensayo
3.3.3 Criterios estadsticos para validar un bioensayo. 23
3.3.4 Mtodos para la obtencin de la lnea logaritmo- 23
dosis-mortalidad (L-D-M)..
3.3.5 Pruebas microbiolgicas 24
3.3.6 Concentracin de esporas o unidades infectivas 26
3.3.7 Pureza. 28
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1 Localizacin del rea experimental... 29
4.2 Condiciones climatolgicas del estado de Chiapas y
Tabasco. 29
4.3 Metodologa para la determinacin de la concentracin letal
media de Metarhizium
anisopliae.... 30
4.4 Reactivacin de cepas de Metarhizium anisopliae. 31
4.5 Virulencia 32
4.6 Caracterizacin fisiolgica.. 35
4.7 Caracterizacin morfolgica... 37
5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.1 Reactivacin de Metarhizium anisopliae.. 38
5.2 Seleccin de aislamiento de Metarhizium anisopliae. 39
5.3 Virulencia. 39
5.4 Caracterizacin fisiolgica.. 41
5.5 Caracterizacin morfolgica... 46
6. CONCLUSIONES 48
7. LITERATURA CITADA.. 49
8. ANEXOS 54
LISTADO DE CUADROS
Pgina.
Cuadro 1. Importancia econmica de la produccin de carne y leche 8
en Mxico.
Cuadro 2. Diseo experimental completamente al azar para evaluar 33

la virulencia de Metarhizium anisopliae para el control de
la garrapata en laboratorio para la cepa MM0801 y
CD0804.
Cuadro 3. Datos de mortalidad de la garrapata Rhipicephalus 41

(Boophilus) microplus a los siete das y la evaluacin del
programa probit para el establecimiento de la lnea base
en el clculo de la CL50.
Cuadro 4. Porcentaje de germinacin de conidios de las cepas 41

MM0801 y CD0804 a las 18 horas despus de la
inoculacin.
Cuadro 5. Porcentaje de germinacin de conidios de las cepas

MM0801 y CD0804 a las 24 horas despus de la 42
inoculacin.
i
LISTADO DE FIGURAS
Pginas.
Figura 1. Distribucin de la garrapata en Mxico y su control. 5
Figura 2. Estructura de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) 9

microplus.
Figura 3. Ciclo biolgico de la garrapata Rhipicephalus 11

(Boophilus) microplus.
Figura 4. Proceso de infeccin de los hongos entomopatgenos. 15
Figura 5. Ubicacin de rea donde se realiz el proyecto de control 29

biolgico de la garrapata.
Figura 6. Etapas para el aislamiento y determinacin de la

concentracin letal media de Metarhizium anisopliae. 30
Figura 7. Mortalidad de garrapata inoculadas con Metarhizium

anisopliae a las 24 horas. a) Garrapatas inoculadas con 34
la cepa MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae.
b) garrapatas en cmara hmeda.
Figura 8. Reactivacin del hongo Metarhizium anisopliae de las 38

cepas MM0801 y CD0804
Figura 9. Hongo Metarhizium anisopliae aislados en tubos de 39

ensayo con medio de cultivo PDA.
Figura 10. Garrapatas micosadas con las concentraciones 40

obtenidas 3X104, 3X105, 3X106, 3X107 y 2.6X108 de
Metarhizium anisopliae. a) Garrapata micosada con la
concentracin 3x104 conidios/ml. b) dosis micosada con
la concentracin 3x105 conidios/ml. c) garrapata
micosada con la concentracin 2.6x108.
Figura 11. Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 48 43

horas a partir de la inoculacin.
ii


Figura 15. Metarhizium anisopliae cepa CD0804 en tubos de

ensaye presenta una coloracin rosada de acuerdo a 47
Munsell 1974.
Figura 16. Formato de toma de datos de la mortalidad de la 56

garrapata que se utiliz en este trabajo.
iii
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo consisti en determinar la concentracin letal media

del hongo entomopatgeno Metarhizium anisopliae para el control biolgico de la
garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en laboratorio. Esta plaga es el
ectoparsito de mayor importancia econmica dentro de la explotacin pecuaria
principalmente en zonas tropicales y subtropicales. Su control qumico ha perdido
eficacia y eficiencia debido a la resistencia desarrollada en forma paulatina. Lo
anterior trae consigo riegos para la salud de las personas (intoxicacin), de los
animales (residuos en la piel y carne) y del medio ambiente (residuos de qumicos
en el suelo) lo que abre paso a diferentes mtodos alternativos de control. Se avalu
la virulencia de la garrapata con Metarhizium anisopliae en condiciones de
laboratorio. Este experimento se llev a cabo con garrapatas adultas recolectadas
en ranchos ganaderos de la regin de los ros del estado de Tabasco y cuenca
lechera de Catazaj, Chiapas del periodo Agosto-Diciembre 2013. Se evalu la
virulencia de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus con cinco
concentraciones de conidias puras de Metarhizium anisopliae donde se estim la
concentracin letal media (CL50) mediante anlisis probit. Las garrapatas fueron
susceptibles al hongo entomopatogeno encontrando una mortalidad del 50 % donde
la concentracin letal media obtenida fue de 6.48X106 conidios/ml de Metarhizium
anisopliae con la cepa MM0801, por lo que se concluye que Metarhizium anisopliae
influye en el grado de virulencia de la garrapata.
iv
ABSTRACT
The objective of this study was to determine the median lethal concentration of the
entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae, required for the biological control
of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus under laboratory conditions. This
species causes more economic damage to livestock farming in tropical and
subtropical zones than any other ectoparasite. Chemical control of this species has
become less and less effective due to a gradual development in resistance to such
substances. Furthermore, this method of pest control is associated with risks to
human (intoxication) and animal health (toxic residues in skin and meat) in addition
to environmental contamination (soil chemical residues); therefore instigating the
search for alternative control methods. The virulence of the tick with Metarhizium
anisopliae was evaluated under laboratory conditions. This experiment was
conducted between August and December 2013, using adult ticks collected at cattle
farms in the Rios region of the state of Tabasco and the dairy farming basin of
Catazaj, in the state of Chiapas, both areas located in south-eastern Mexico. The
virulence of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus was measured using five
concentration of pure conidia of Metarhizium anisopliae. The mean lethal
concentration (CL50) was estimated by means of a probit analysis. The ticks
demonstrated susceptibility to the entomopathogenic fungus, suffering 50% mortality
when subject to a mean lethal concentration of 6.48X106 conidia /ml obtained from
the strain MM0801. It can be concluded that Metarhizium anisopliae has an effect
on the degree of virulence of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus.
v
1. INTRODUCCIN
La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es el ectoparsito de mayor

importancia econmica dentro de la explotacin pecuaria, est ampliamente
distribuida por todo el pas (Ojeda-Chi et al., 2011), principalmente en zonas
tropicales y subtropicales (Soberanes et al., 2002). Este parsito artrpodo
hematfago es causante de una enfermedad parasitaria externa que afecta a los
bovino de todas las edades (Fernndez, 2006). Entre los efectos econmicos y
productivos ms importantes que producen las garrapatas al ganado bovino son
daos a la piel, disminucin en la produccin de carne, leche y el costo para su
tratamiento de las enfermedades transmitidas (Baruch, 2012). La perdidas a nivel
mundial por garrapatas estn cerca de 1.6 billones de dlares al ao, Rhipicephalus
(Boophilus) microplus es la garrapata de mayor importancia en Mxico (Navas,
2003). La dinmica poblacional de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en los
estados de Chiapas y Tabasco se presenta durante todo el ao pero en invierno se
estima que puede vivir hasta 51 das a pesar de las condiciones climticas. De
manera general, el control actual de la garrapata est fundamentado en la aplicacin
de acaricidas qumicos dirigidos a la fase de vida parasitaria de la garrapata. Esta
fase representa el 5% de la poblacin y el 95% restante se localiza en los pastos.
El uso de estos productos qumicos provoca residuos en la carne y daos al medio
ambiente. Los consumidores son cada vez ms exigentes de la calidad de los
alimentos, debido a esto existe una gran necesidad de direccionar el sistema
productivo de bovinos hacia tecnologas viables desde el punto de vista tcnico y
econmico que permitan satisfacer las necesidades del consumidor. Como
alternativa existe el control biolgico de la garrapata con el uso hongos
entomopatogeno. Por lo que el presente estudio consisti en determinar la
concentracin letal media del hongo entomopatogeno Metarhizium anisopliae para
el control biolgico de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en
laboratorio.
1
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Determinar la concentracin letal media del hongo entomopatgeno Metarhizium

anisopliae, para el control biolgico de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)
microplus en laboratorio.
2.2 Objetivos especficos
- Evaluar la virulencia del hongo entomopatgeno Metarhizium anisopliae en la

garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en estado adulto.
- Evaluar la viabilidad de las conidias y el crecimiento radial de Metarhizium

anisopliae.
2
3. REVISIN DE LITERATURA
3.1 Generalidades de la garrapata Rhipicephalus Boophilus microplus
La garrapata de la familia Ixodidae se reporta como parsito obligados de reptiles

desde hace aproximadamente 200 millones de aos, en la era Paleozoica tarda o
en el Mesozoico temprano; donde el gnero Ixodes representa a los miembros ms
primitivos de esta especie. Por su lado, los gneros Aponomma, Amblymmay el
Hyalomma pueden ser miembros del periodo Cretcico, ya que su aparicin durante
el Mesozoico tardo correspondi a cambios del medio ambiente. Con la
consecuente reduccin de reptiles pertenecientes a la lnea Rhynchosauria,
antecesores de los actuales mamferos y pjaros, los gneros Dermacentor y
Boophilus probablemente no aparecieron antes de que los pjaros y los mamferos
reemplazaran a los reptiles, esto durante el periodo terciario, hace
aproximadamente 65 millones a 70 millones de aos (Durden et al., 1996).
Las garrapatas aun siendo reconocidas como importantes parsitos de los animales
(domsticos y silvestres), y de los humanos, tienen ms relevancia por las
numerosas enfermedades que pueden transmitir. Muchos de los agentes
transmitidos por garrapatas tienen una prevalencia, y en otros casos se consideran
como reemergentes, aun cuando los avances de la medicina han permitido reducir
otras enfermedades transmitidas por artrpodos en diferentes lugares del mundo.
Entre las enfermedades transmitidas por las garrapatas a las personas destaca la
enfermedad de Lyme, causada por una espiroqueta (Borrelia burgdorferi), que es,
desde su identificacin en 1982, la principal enfermedad transmitida por garrapatas
(TBE) es una enfermedad vrica grave, distribuida ampliamente por Europa y Asia
que afecta principalmente a personas que estn en contacto con la naturaleza
(granjeros, montaeros, campistas) (Barandika, 2010).
3
3.1.1 Clasificacin taxonmica
El grupo de estos artrpodos, incluyen cerca de 825 especies divididas en tres

familias: la Argasidae (garrapatas blandas), la Ixodidae (garrapata duras) y la
Nuttalliellidae (Fr). La familia Ixodidae contiene alrededor de 650 especies, con
cuatro subfamilias y trece gneros; la familia Argasidae comprende cinco gneros y
alrededor de 170 especies y la Nuttalliellidae, tan solo una especie relativamente
incipientem (Bazn, 2002, Santibez, 2012).
Taxonoma de las garrapatas
Phylum Arhropoda Familias Grupo Subfamilia Genero

Subphylum Chelicerata Ixodidae prostriata Ixodinae Ixodes
Clase Arachnida Metastriata Bothriocrotoninae Bothricroton
Subclase Acari amblymminae Amblymma
Orden Parasitiformes Haemaphysalinae haemaphysalis
Suborden Ixodida Rhipicephalunae anomalohimalaya
Superfamilia Ixodoidea Cosmiamma
Dermacentor
Hyalomma
Margaropus
Nosomma
Rhipicentor
Rhipicephalus
Argasidae Argasinae Argas
Ornithodorinae Ornithodoros
Otobius
Antricola
Nothoaspis
Nuttalliellidae Nuttalliella
4
3.1.2 Distribucin
La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus originaria del continente asitico

y de la isla de java, pudo ser introducida en la mayora de los pases tropicales y
subtropicales a travs de la importacin de ganado. Su presencia ha sido descrita
en varios pases del mundo y en la regin Neotropical. Esta especie est distribuida
desde el norte de Argentina hasta Mxico incluyendo las islas del Caribe y las
Antillas (Cortes, 2010).
En Europa, norte de Asia y China Rhipicephalus appendiculatus es importante

mientras que en Amrica, Asia y frica, reportan Boophilus microplus,
Rhipicephalus appendiculatus y Amblyomma hebream. Por otra parte las 81
especies de garrapatas que se encontraron en Estados Unidos, las ms comunes
en mamferos pequeos fue Dermacentor variabilis. Los animales silvestres han
sido factores intermedios que participan en la distribucin de especies como
Amblyomma variegatum, ya que las infestaciones ocurren por la migracin de
dichas especies (Bazn, 2002). En la figura 1. Se muestra el mapa de la distribucin
de la garrapata en Mxico y su control.
Figura 1. Distribucin de la garrapata en Mxico y su control (SENASICA ,2014).
5
En la figura 1. Se muestra la situacin actual de la campaa contra la garrapata,
donde en el Norte del pas as como reas del centro comprenden el 94.4 millones
de hectreas en la fase libre de la garrapata, la cual el 47.88% equivale al territorio
nacional y dentro de la fase de control alcanza un total de 101.6 millones de hectrea
lo que representa el 51.5% del pas (SENASICA, 2014).
Dentro de la fase de control de la garrapata a partir de ao 2001 se identific la

resistencia a los amidinas (AM) en el Municipio de Emiliano Zapata, Tabasco y en
los estados de Chiapas, Tabasco, Yucatn y Quintana Roo el 88% de los ranchos
son resistente a los piretroides (PS) y organofosforados (OF) (Fuentes, 2011).
3.1.3 Enfermedades transmitidas por la garrapata.
Las garrapatas son vectores en la transmisin de enfermedades zoonticas, por

esto son consideras como un problema de salud pblica en el mundo, dentro las
enfermedades transmitidas son la babesiosis, enfermedad de Lime, fiebre
botonosa, fiebre maculosa de las montaas rocosas. Rhipicephalus (Boophilus)
microplus es vector principal de babesiosis y anaplasmosis, mientras que
Amblyomma cajennse es vector de fiebre manchada y brucelosis (Navas, 2003).
Las infestaciones por Rhipicephalus (Boophilus) microplus pueden causar

enfermedades como babesiosis, anaplasmosis y borreliosis con manifestaciones
clnicas como artritis, laminitis, sinovitis y mastitis que pueden llegar a incapacitar al
animal. Una garrapata puede extraer entre 0.5 y 2.5 ml de sangre, adems de
transmitir hemoparsitos y dependiendo del grado de infestacin puede causar en
el animal anemia y en algunos casos la muerte (Navas, 2003).
Las garrapatas tienen efectos negativos sobre la produccin de la cual se conocen

complejos de ganado engarrapatado, donde intervienen garrapatas de los gneros
Boophilus y Amblyomma asociados con infecciones de hemoparsitos dando como
resultado cuadros clnicos de anemia, retardando el crecimiento y baja fertilidad.
Dentro de las enfermedades de babesiosis, anaplasmosis y tripanosomiasis
6
transmitidas por estos ectoparsitos puede afectar la reproduccin de los animales
causando abortos, reabsorciones embrionarias y mayor tiempo para alcanzar la
madurez sexual. A partir de la irritacin provocada por las garrapatas tiene un efecto
depresivo sobre la produccin de carne y leche (Navas, 2003).
3.1.4 Importancia econmica.
Uno de los principales problemas de la produccin ganadera del trpico son los
parsitos los cuales impiden a los animales expresar su potencial productivo
generando grandes prdidas econmicas. Las garrapatas son ectoparsitos de
distribucin mundial, se estima que el 80% de la poblacin bovina del mundo sufre
los efectos de estos parsitos.
Las prdidas a nivel mundial por garrapatas estn cerca de 1.6 billones de dlares
al ao. Boophilus es la garrapata de mayor importancia econmica en Mxico,
Centroamrica, Sudamrica y Australia. Las prdidas econmicas estn
representadas en el dao a las pieles, que pierden valor para la industria, reduccin
de la produccin de carne y leche, la transmisin de enfermedades y toxinas (Navas,
2003).
Como se puede observar en cuadro 1. En el 2012 la produccin de carne en Chiapas

fue de 225,443 ton/ao a comparacin del 2013 que la produccin fue de 116,078
ton/ao y en cuanto a su produccin de leche en Chiapas en 2012 fue de 404,727
litros/ao y en el 2013 fue de 404,148 litros/ao esta baja de produccin es debido
a la afectaciones de la garrapata en el ganado bovino, de igual forma en los estados
de Tabasco y Veracruz la produccin del 2012 comparada con el 2013 ha venido
disminuyendo paulatinamente (Siap,2014).
7
Cuadro 1. Importancia econmica de la produccin de carne y
leche en Mxico.
Produccion de carne y leche

Ao Estados Produccion/tonelada Precio/pesos/kilo
Chiapas 225,443 16.42
2012 Tabasco 135,166 20.07
Veracruz 481,098 20.89
Chiapas 116,078 36.89

2013 Tabasco 67,452 43.17
Veracruz 248,653 41.35
Produccin/miles de litros Precio/ pesos/litro
Chiapas 404,727 4.44
2012 Tabasco 106,960 4.24
Veracruz 715,190 5.21
Chiapas 404,148 4.80

2013 Tabasco 101,275 5.16
Veracruz 706,981 5.31
Fuente. (SIAP, 2014)
3.1.5 Morfologa
Morfolgicamente las especies de la familia Ixodidae se caracteriza por poseer

capitulo siempre en posicin terminal (visible dorsalmente) y escudo dorsal en todos
los estados biolgicos. El dimorfismo sexual es acentuado (escudo pequeo y corto
en hembras, larvas y ninfas, no sobrepasando la regin media del cuerpo; mientras
que en machos el escudo es largo y se extiende hasta la margen posterior). En las
hembras se observan reas porosas; hipostoma denticulado en la mayora de los
gneros, en muy pocos casos con crenulaciones. El ltimo artculo o segmento del
palpo de la pata IV est en posicin ventral, situado en una cavidad en la extremidad
8
distal del artculo III. Las placas espiriculares estn situadas posteriormente a la
pata IV (Garca, 2011).
Estos caros presentan dos partes diferentes visibles, el tronco globoso y

extremidades articuladas. La parte anterior, no es una cabeza propiamente dicha,
ya que el cuerpo de la garrapata es una sola masa, tiene un conjunto de pies mviles
que forman el gathosoma y una base que mide 4 mm de largo por 0.9 mm de ancho,
por encima de este, se observan dos depresiones llamadas areas porosas de las
cuales sobresalen dos ganchos denominados quelceros que ayudan a romper la
piel del hospedero (Bazn, 2002) Como se muestra en la figura 2.
Figura 2. Estructura de la Garrapata

Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Bazn,
2002).
Por debajo de los quelceros, que aparecen en nmero par en forma de hoz y los
ocelos a los lados, se observa una prolongacin de la base de gathosoma llamado
hipostoma, presenta una formula dentaria de 3/3, 4/4 que facilita la accin de
perforar la piel del hospedero y adems participa como rgano de fijacin, consta
de un par de pedipalpos conformado por cuatro segmentos. Cada pedipalpo
desempea dos funciones: una ayuda a proteger las partes suaves de la boca, la
otra funciona como rgano sensorial (Bazn, 2002).
9
Enseguida aparecen las extremidades con seis artejos: coxa, trocnter, fmur, tibia,
pretarso y tarso. Es necesario sealar que los adultos y las ninfas poseen estigmas
y se sitan en el ltimo para de coxas, mientras que las larvas carecen de ellas,
adems presentan dimorfismo sexual, siendo el macho de menor tamao que la
hembra. Cada extremidad mide en promedio de 10 a 12 mm en las hembras y de 3
a 4 mm en los machos. La parte posterior del acaro se denomina propodosoma
(Bazn, 2002).
El sistema de proteccin o cutcula posee tres capas: epicuticula, mesocuticula y

endocuticula, en ella se aprecian poros, canales o espirculos. La primera capa
contiene; lpidos, sustancias cementantes, cuticulina y polyfenol que cumplen la alta
funcin de proteccin al desecarse. Este sistema de proteccin, tiene la
particularidad de sufrir elongaciones de hasta 20 veces su tamao original cuando
esta replete de sangre (Bazn, 2002).
3.1.6 Hospederos de la garrapata
La mayora de las garrapatas muestran preferencia por una especie de hospederos,

pero no son totalmente especficas mucha parasitan una gran variedad de animales.
Rhipicephalus (Boophilus) microplus muestra preferencia por bovinos, caprinos,
equinos y ovinos, adems se puede encontrar en porcinos, caninos, rumiantes
silvestres y en menor grado humanos (navas, 2003).
3.1.7 Ciclo biolgico de Rhipicephalus (Boophilus) microplus
El ciclo biolgico en la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus ocurre entre

el hospedero, la vegetacin y el suelo de un sitio especfico, que comprende de
cuatro estados biolgicos: como se muestra en la Figura 3. El de huevo (incuba de
17 a 21 das), larva (7 a 10 das), ninfa (5 a 6 das) y adulto (1 a 3 das) de una fase
a otra se lleva a cabo el proceso de ecdisis o desprendimiento del exoesqueleto; la
fase parasita se inicia en el suelo (larva), luego trepa a las plantas ms cercanas y
ms tarde al hospedero animal; tanto en los animales como en el suelo, la garrapata
10
est sujeta a cambios ambientales. El adulto se deja caer del hospedero una vez
que realiza la copula.
1 a 3 das
5 a 6 das
17 a 21 das
7 a 10 das
Figura 3. Ciclo biolgico de la Garrapata

Rhipicephalus microplus (Fernndez, 2006).
El gnero Boophilus oviposita de 2,000 a 5,000 huevos, aunque otros gneros

puede ovipositar hasta 20,000 (Krober y Guerin, 2000). La incubacin de los huevos
ocurre de 17 a 21 das si son favorables las condiciones ambientales, con una
temperatura de 20.6 C y un 80 % de humedad relativa. Si las condiciones le
favorecen, la garrapata puede completar su ciclo de vida en 37 das, pero en la
adversidad puede hacerlo hasta los 281 das, segn el medio en que se encuentren
(Bazn, 2002).
11
3.2 Hongos entomopatgenos
Los entomopatgenos son microorganismos que provocan enfermedades en los

insectos, los agentes causales son virus, bacterias, hongos, protozoos y
nematodos, entre otros. El uso de mtodos biolgicos de control representa ciertas
ventajas como: especificidad sobre las plagas y enfermedades, bajo riesgo para el
ser humano, animales benficos y el ambiente, bajo costo gracias a su potencial de
permanencia por largos periodos de tiempo en los cultivos, la permanencia en los
cultivos es mayor si se compara con los productos qumicos (Arenas, 2009).
La patogenicidad, virulencia y agresividad son conceptos comunes en el lenguaje

tcnico propuesto para los hongos entomopatgenos. La virulencia es el grado de
patogenicidad con que un organismo mata a un hospedero especfico en
condiciones programadas; la patogenicidad se define como la capacidad de un
microorganismo para causar enfermedad y la agresividad se le define como la
habilidad de un patgeno para invadir a su hospedero. La variacin en la virulencia
de las especies de hongos y entre cepas de un mismo hongo, debe caracterizarse
mediante los mtodos de RAPD-PCR la cual es una tcnica confiable, ya que
existen altos niveles de variacin genotpica entre las diversas cepas (Bautista et
al., 2013). Algunas de las propiedades de los hongos entomopatgenos son: que
poseen un alto poder residual, conservan su virulencia en la preparacin y antes de
la dispersin del inoculo en campo, la especificidad, posibilidades de multiplicacin
y conservacin en condiciones econmicas rentables y alto poder patgeno
suficientemente estable.
3.2.1 Generalidades taxonmicas y morfolgicas de Metarhizium anisopliae
Metarhizium anisopliae (metschnikoff) sorokin se ha utilizado para el control

biolgico de insecto plaga, adems de otro dos hongos entomopatgenos
Beauveria bassiana y Beauveria brongiarti. Metarhizium anisopliae es uno de los
hongos ms ampliamente utilizado en micoinsecticida a lo largo del mundo,
12
principalmente como un agente de control. La especie Metarhizium anisopliae fue
descrito originalmente por Metschnikoff (1879) como Entomophthora anisopliae y
posteriormente trasladado al nuevo gnero Metarhizium por Sorokin (1883), se
realiz la primera revisin del gnero Metarhizum por Tulloch (1976). Debido a la
correccin ortogrfica, sugiri escribir el nombre genrico con una sola 'r' en vez de
la ortografa original con dos "erres. Los caracteres taxonmicos dominantes son
las caractersticas morfolgicas de la esporulante estructura. El gnero se define
sobre la base de la disposicin de las filides cadenas de rodamiento y columnas
de color verde seco y, en general, cilndrica o ligeramente ovoides conidios
(Zimmermann, 2007).
La clasificacin taxonmica del gnero Metarhizium anisopliae ha sufrido cambios

de acuerdo a varios autores que clasifican a las especies de este gnero, con base
a sus caractersticas morfolgicas se reconocen dos especies: M. anisopliae y M.
flavovoride. Mediante estudios moleculares se reconocen ambas especies de
hongos, que existen cuatro variedades M. anisopliae var, majus. Recientemente se
propone la existencia de nueve especies: M. anisopliae, M. guizhouense, M.
pingshaense, M. acrium stat. Nov., M. lepidiotae stat. Nov., M. majus stat. Nov., M.
globosum, M. robertsii y M. brunneum. Tambin los estudios filogenticos han
permitido reubicar a las especies de Metarhizium al grupo de los Ascomycetes
(Hypocreales; Clavicipitaceae) parasitos de insectos, al considerar adems el origen
e implicaciones evolutivas como reproduccin, hbitat, el uso de hospederos vivos
y otros invertebrados como fuente de alimento (Ojeda-Chi et al., 2011).
Metarhizium anisopliae presenta la habilidad de crecer en forma saprofita, facilidad

de diseminacin de los conidios, capacidad de sobrevivencia en el suelo y
reproduccin asexual. Requiere temperatura ptima de 25 a 30 C y humedad
relativa del 100%. Los lmites trmicos para la germinacin de los conidios y de las
hinfas de M. anisopliae se encuentran alrededor de 37 a 40 C respectivamente.
Con una humedad por debajo de 53% se reduce la viabilidad de los conidios (Ojeda-
Chi et al., 2011).
13
Metarhizium anisopliae (Deuteromycetes: Moniliales), es un hongo imperfecto
(Hyphomycete) que presenta reproduccin asexual. Fue uno de los primeros
microorganismos que se usaron para el control de los insectos plaga. Primero se
aisl por Metschnikoff en 1879, del escarabajo gallo del trigo; dicho aislado fue
Anisoplia austriaca (Herbst) (Coleptera: Scarabeidae) descrito por Sorokin. Se le
considera un agente de alto potencial en el control biolgico de plagas agrcolas. Es
una especie de hongo cosmopolita que no infecta animales de sangre caliente y
tampoco existen reportes de sensibilidad humana al mismo (Zimmermann, 2007,
Bazn, 2002).
Entre las caractersticas morfolgicas destacan la coloracin de la colonia,

generalmente olivcea, amarillenta o verde obscura, dependiendo del aislamiento.
El conidiforo es irregular y ramificado con dos a tres ramas en cada septa de 4 a
13.5 m de longitud x 1.4 a 2.6 m de dimetro. Fialides cilndricas en forma de
clava, adelgazados en el pice, miden 6.3 a 13.5 m de longitud y 1.8 a 3.6 m de
dimetro. Conidios unicelulares, cilndricos y truncados, formadas en cadenas muy
largas, hialinos a verde olivceo. Miden 3.5 a 9 m de longitud x 1.5 a 3.5 m de
dimetro (Orduo, 2009).
3.2.2 Generalidades taxonmicas y morfolgicas de Beauveria bassiana
El hongo hyphomycete, Beauveria bassiana (blsamo) Vuillemin es un patgeno

que infecta naturalmente numerosos insectos. Es considerado como una de la
especies ms promisorias por su potencial como agente biocontrol de insectos
(Espaa, 2000).
Beauveria bassiana es un hongo imperfecto de la divisin Ascomycota, clase

Sordariomycetes, orden Hypocreales, y familia Clavicipitaceae. Este hongo, tanto
en cultivo puro como en insectos, presenta un micelio algodonoso de color blanco y
tiene una esporulacin abundante de color crema con apariencia polvorienta, lo que
14
le da el nombre con el que se le conoce comnmente muscardina blanca (Pozo,
2012).
Entre las caractersticas morfologa destacan con el micelio hialino y septado que
se ramifica formando conidiforos que crecen en forma de racimos. Cada
conidiforo est compuesto por una clula conidigena cuya base es abultada y
conforme se aleja de la base se produce un adelgazamiento (forma de cuello de
botella) del cual surge otra estructura llamada esterigma en forma de zigzag. En
sta se insertan los conidios (uno por cada quiebre del zigzag), que son globosos a
subglobosos de 2 a 3 x 2 a 2.3 m. (Pozo, 2012).
3.2.3 Proceso de infeccin de Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana
En general los hongos entomopatogeno desarrollan las siguientes fases sobre su

hospedante: germinacin, formacin de apresorio, formacin de estructuras de
penetracin, colonizacin y reproduccin. As como se muestra en la Figura 4.
Figura 4: Proceso de infeccin de los hongos

entomopatgenos (Clarkson et al., 1998).
15
El proceso se inicia cuando la espora o conidias se adhiere a la cutcula del insecto,
luego desarrolla un tubo germinativo y un apresorio, con este se fija en la cutcula y
con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetracin) se da la penetracin al
interior del cuerpo de insecto. La germinacin ocurre aproximadamente a las 12
horas post-inoculacin y la formacin de apresorios se presenta de 12 a 18 horas
post-inoculacin. En la penetracin participa un mecanismo fsico y uno qumico, el
primero consiste en la presin ejercida por estructura de la penetracin, la cual
rompe las reas esclerosadas y membranosas de la cutcula. El mecanismo qumico
consiste en la accin enzimtica, principalmente proteasa, lipasas y quitinasas, las
cuales causan descomposicin del tejido en la zona de penetracin, lo que facilita
el ingreso del hongo. Despus de la penetracin, la hifa se ensancha y ramifica
dentro del tejido del insecto, colonizando completamente la cavidad del cuerpo del
insecto, esto sucede en 3 o 4 das despus de la inoculacin. A partir de la
colonizacin se forman pequeas colonias y estructuras del hongo, lo que
corresponde a la fase final de la enfermedad del insecto, ocurre 4 o 5 das despus
de la inoculacin. (Castillo, 2006).
a) Adhesin de la espora a la cutcula del insecto.
El primer contacto que hace la espora con la superficie del hospedero es por la
cutcula. Las caractersticas fsicas y qumicas de las superficies de la cutcula del
insecto y la espora son las responsables de esta unin. En algunos hongos la
adhesin es un fenmeno no especfico, mientras en estas especies es un proceso
especfico. Algunas glicoprotenas pueden servir como un receptor especfico para
las esporas (Soto, 2008).
b) Germinacin de la espora.
La germinacin es el proceso mediante el cual una espora emite uno o varios

pequeos tubos germinales los cuales por el crecimiento y alargamiento dan origen
a las hifas. Las esporas en gran parte depende de la humedad ambiental y
16
temperatura pero en menor grado de las condiciones de luz y nutricionales. El nivel
de agua es determinante en el crecimiento de los hongos y pequeas diferencias
en los niveles de humedad relativa despus de la aplicacin de conidias, pueden
determinar de un modo u otro el xito del hongo en el control de insectos de plagas.
El resultado de la germinacin y la penetracin no depende necesariamente del

porcentaje total de germinacin sino del tiempo de duracin de la germinacin,
modo de germinacin, agresividad del hongo, el tipo de espora y la susceptibilidad
del hospedero (Soto, 2008).
c) Penetracin del integumento.
La penetracin de la cutcula del insecto por conidias geminadas, ocurre como

resultado de una combinacin entre la degradacin enzimtica de la cutcula y la
presin mecnica por el tubo germinal. El modo de penetracin principalmente
depende de las propiedades de la cutcula, grosor, esclerotizacin y la presencia de
sustancia anti fngicas y nutricionales. La fuerza mecnica es notable en el extremo
de una hifa invasiva donde la capa cuticular es deformada por presin. Se produce
un tubo germinativo y un apresorio, con este se fija en la cutcula y con el tubo
germinativo o haustorio (hifa de penetracin) se da la penetracin al interior del
cuerpo del insecto. En la penetracin participa un mecanismo fsico y un qumico, el
primero consiste en la presin ejercida por la estructura de penetracin, la cual
rompe las reas esclerosadas y membranosas de la cutcula. El mecanismo qumico
consiste en la accin enzimtica, principalmente proteasas y quitinasas, las cuales
causan degradacin del tejido en la zona de penetracin, lo que facilita la
penetracin fsica (Soto, 2008).
Las enzimas descubiertas en el tubo germinativo son proteasas, aminopeptidasas,

lipasas, esterasas, y N-acetil-glucosamidasa (quitinasas). Estudios in vitro indican
que en la digestin del integumento sigue una secuencia de lipasa proteasa
quitinasa. La produccin de proteasa y quitinasa sobre la cutcula del insecto, se ha
17
demostrado con M. anisopliae la enzima principal es una endoproteasa que disuelve
la protena matriz que cubre la quitina cuticular. Por lo tanto, la produccin de
quitinasa ocurre despus del proceso de infeccin y una vez que el hongo atraviesa
la cutcula debe vencer el sistema inmunolgico del hospedero antes de entrar a la
hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto (Soto, 2008).
d) Replicacin en el hemocele.
Despus de llegar al hemocele, la mayora de los hongos convierten el crecimiento

micelial en una fase de levadura o sea crecimiento por germinacin. Se producen
toxinas y enzimas. Aunque algunos hongos aparentemente no poseen toxinas,
matan el insecto al consumidor todos los nutrientes o por fsica destruccin. Los
hongos pueden evitar la defensa inmune de un insecto por el desarrollo de
protoplastos que no son reconocidos por la poblacin de hemocitos del insecto
formando cuerpos hifales multiplicndose y dispersndose rpidamente y
produciendo micotoxinas. Las toxinas causan la muerte del insecto debido a la
degeneracin de los tejidos, producto de la perdida de la integridad estructural de
las membranas seguido de la deshidratacin de las clulas por perdida de fluido.
Posterior al crecimiento del hongo en el hemocele, la micosis induce sntomas
fisiolgicos anormales en el insecto tales como convulsiones, carencia de
coordinacin y comportamientos alterados al igual de una competencia entre el
hongo y la flora intestinal. En la mayora de los casos los hongos producen sustancia
antibacteriales y cambio de color del cadver. Despus de muerto el insecto, si la
disponibilidad de agua es alta los hongos emergen al exterior a travs de la cutcula
y esporulan sobre el cadver produciendo inculo para infectar a otros insectos si
las condiciones no son favorables, queda dentro del cadver del insecto, donde
pueden sobrevivir por algunos meses y eventualmente producir esporas cuando
lleguen las condiciones favorables. La esporulacin ocurre generalmente en
cadveres pero pueden tambin ocurrir en insectos vivos (Soto, 2008).
3.3 Pasos para realizar un bioensayo con hongos entomopatgenos
18
a) Bioensayo con entomopatgenos
Es cualquier mtodo que permita medir la respuesta biolgica que produce un

material o substancia con base al estmulo generado. En toxicologa y ms
especficamente en patologa de insectos, constituyen una herramienta de vital
importancia para la evaluacin de los niveles de resistencia o susceptibilidad de las
plagas. El anlisis de Probit (nacido del anlisis toxicolgico), ha sido una
herramienta muy valiosa para analizar datos de dosis-respuesta de
microorganismos patognicos de insectos. Salvo algunas consideraciones de
criterios de evaluacin, el anlisis de Probit no tiene modificaciones para su
aplicacin en organismos entomopatgenos. Es bueno mencionar que antes de
llevar a cabo un bioensayo se debe investigar cual es el mtodo internacionalmente
recomendado para la especie en cuestin. En caso de que no exista, se sugiere
utilizar aquel mtodo recomendado para otra especie emparentado
taxonmicamente. El hecho de no apegarse a las normas establecidas trae
problemas tales como la imposibilidad de que los resultados puedan ser
comparables con otros estudios similares y por lo tanto no se podra afirmar que la
poblacin estudiada sea susceptibles o resistente (Goettel e Inglis, 1997).
b) Tipos de bioensayo
De acuerdo a Goettel e Inglis, (1997), en los bioensayos con hongos

entomopatgenos existen 2 tipos como son: burdos y finos:
Los Burdos se utiliza para aquellos casos en los cuales se tiene un gran nmero de
cepas de algn entomopatogeno en particular, (varias cepas de Bacilus thuringesis).
Con este tipo de bioensayo solo se busca determinar aquellas cepas que tiene un
potencial toxico alto: de un total de 100 cepas evaluadas, 10 presentaron alta
actividad toxica. Hay que mencionar que alta es referida en trminos relativos, es
decir seleccionando aquellas cepas que a dosis bajas genera una mortalidad del
100%.
19
Los finos se realizan como segunda etapa y donde se determina la ventana de
respuesta biolgica y dosis intermedias, la actividad registrada es expresada como
la Concentracin Letal Media (CL50) y esta es comparada con alguna cepa estndar.
Para que sea considerada con potencial toxico debe tener una CL 50 menor o igual
a la cepa estndar.
c) Ventana de respuesta biolgica (VRB)
Para encontrar la CL50 a cualquier entomopatogeno en una especie dada, el primer

paso consiste en determinar la concentracin mxima cuyo efecto se refleja en una
mortalidad de 0% o un valor cercano a este y la dosis ms baja capaz de matar al
100% de los especmenes bajo prueba. A dicho intervalo de respuesta se le conoce
como venta de respuestas biolgicas. Se sugiere experimentar con las siguientes
concentraciones 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. De no contener estas concentraciones
el 0 y 100%, se aadirn dosis superiores o inferiores, segn sea el caso. Los datos
se grafican como logaritmo de dosis en contra del porcentaje de mortalidad
convertido a su valor probit.
d) Preparacin de diluciones intermedias
Una vez determinada la ventana de respuestas biolgicas, el siguiente paso

consiste en preparar diluciones intermedias para determinar la lnea de respuestas
dosis-mortalidad.
La metodologa para preparar cada una de las concentraciones se necesitan en un

bioensayo es til hacer uso del siguiente sistema de ecuaciones:
(A)x(B)= C
+ +
(G)x(E)= F
(G)x(H)= I
Donde:
20
A. Es la cantidad en ml o gr. De la solucin porcentual que se va utilizar como base para preparar
la disolucin que se desea.
B. Concentracin de la solucin parental.
C. Es el producto de A x B.
D. Es la cantidad en ml del solvente. En forma general ser agua destilada.
E. Concentracin toxica del solvente. Dicho valor tendr siempre un valor de 0 ya que carece de
actividad insecticida.
F. Es el producto de la multiplicacin de D x E (siempre ser o).
G. Es la suma de A + D y representa la cantidad total en ml de la solucin que se desea preparar.
H. Es la concentracin final de la solucin que se quiere preparar.
I. Es la suma de C + F.
e) Preparacin de dosis intermedias.
Una vez determinada VRB se procede a la preparacin de dosis intermedias entre

0 y el 100% de mortalidad. Utilizando la formula anterior.
3.3.1 Parmetros biolgicos de un anlisis Probit
El anlisis probit es un anlisis de regresin que usa variables binominal que sirve
para determinar dosis y nos permite obtener los siguientes parmetros biolgicos.
(Lara, 2013 en prep.)
a) Dosis Letal Media (DL50): Dosis a la cual se produce la muerte en la mitad de

los individuos evaluados.
b) Dosis Efectiva Media (DE50): Dosis a la cual se produce una respuesta en la

mitad de los individuos evaluados. Una caracterstica de esta dosis es que esta es
una media indirecta de la tolerancia media de un lote de individuos. La DL 50 es un
caso especial en el cual la muerte es la respuesta.
c) Tiempo de Supervivencia Medio (TS50): Tiempo en el cual se produce la muerte

en la mitad de los individuos evaluados.
21
d) Tiempo Efectivo Medio (TE50): Es el tiempo en el cual una respuesta ocurre en
la mitad de los individuos probados despus de exponer a un patgeno. La
supervivencia media (TS50) es un caso especial en el cual la muerte es la respuesta.
e) Tiempo Letal Media (TL50): Periodo de tiempo en el cual un grupo de individuos

son expuestos a un patgeno antes de producir una respuesta. No confundir con
TS50.
3.3.2 Criterios metodolgicos para la elaboracin de un bioensayo.
Para que los resultados de un bioensayo sean confiables deben reunir una serie de
requisitos indispensables como son:
a) La respuesta debe ser lineal. Es decir que se observa una relacin lineal entre
el logaritmo de la dosis y las unidades Probit.
b) Las dosis que se aplique o pruebe, debe ser precisa.
c) La respuesta debe ser determinante: vivo o muerto. No pueden considerarse
los puntos intermedios. Dependiendo del patgeno, el criterio para tomar un
organismo vivo o muerto depende del modo de accin del mismo.
d) Cuando en el testigo exista mortalidad, esta se debe corregir con la ecuacin
de Abbott*, pues de otro modo no se podra inferir si la mortalidad en los
tratamientos se debe al efecto del patgeno, o a otros factores tales como:
contaminacin o mala nutricin.
e) La temperatura debe ser constante y adecuada con la finalidad de evitar riesgos
en la mortalidad.
f) El mtodo debe ser sensible para poder captar las diferencias en mortalidad
como una respuesta al cambio de dosis.
g) El mtodo debe ser reproducible.
h) La nutricin de los insectos debe ser uniforme.
i) El lugar de aplicacin debe ser constante.
22
j) Las repeticiones del experimento se debern hacer a la misma hora pero en
diferentes das.
3.3.3 Criterios estadsticos para validar un bioensayo

1. La mortalidad natural en los individuos testigo debe ser igual o menor al 10%.
2. El valor de ji-cuadrada, en un bioensayo de seis dosis, debe ser menor o igual
a 5.
3. En una serie de 6 dosis probadas, por lo menos 2 deben ser mayores o
menores a la CL50 estimada.
4. Por lo menos 4 de una serie de 6 dosis probadas deben causar una mortalidad
entre 10 y 90%.
5. El valor de la pendiente de la lnea de regresin debe estar entre 1.5 y 6.0.
6. El cociente entre el limite fiducial mayor (p=0.95) y el menor debe ser menor o
igual a 2.
7. Deben hacerse por lo menos 3 repeticiones validas, por separado.
8. El coeficiente de variacin de la CL50 media (de las repeticiones) debe ser igual
o menor a 20%. (Bautista y Gonzlez, 2008).
3.3.4 Mtodos para la obtencin de la lnea Logaritmo-Dosis-Mortalidad (L-D-

M).
Existen por lo menos cuatro mtodos para obtener la lnea de respuesta logaritmo
dosis-mortalidad. La relacin entre las dosis y la mortalidad est representada por
una lnea sigmoide, la cual es difcil de comparar e interpretar, por lo que es
deseable transformarla para poder ajustar un modelo de lnea recta. Para realizar
esto es necesario usar el logaritmo de la dosis y cambiar el porcentaje de mortalidad
a unidades Probit.
23
a) Transformacin de la dosis a su logaritmo.
Cada dosis utilizada debe transformarse a su correspondiente logaritmo. Pueden

utilizarse indistintamente los logaritmos naturales o neperianos siempre y cuando
se mantenga constante el elegido.
b) Obtencin de la ecuacin de regresin.
Como se trata de una regresin lineal simple su ecuacin es la siguiente:
Y = bo + b1X
Donde
Y = valor de probit.
bo= ordenada al origen.
b1= pendiente de la lnea.
X= logaritmo de la dosis.
3.3.5 Pruebas microbiolgicas
Los micoinsecticidas son productos biolgicos que se utilizan en forma comercial

para el control de plagas y con un alto potencial como controladores de insectos
plagas en cultivos agrcolas, forestales as como de insectos vectores de
importancia para la salud pblica. Cabe mencionar que los productos formulados a
base de hongos entomopatgenos han tenido una mayor demanda a nivel mundial;
en Mxico se observ un incremento de 22 laboratorios de produccin masiva
existen en 1999 a 60 laboratorios para el 2003 (CNRF, 2004). Los principales
hongos entomopatgenos propagados masivamente en estos laboratorios son:
Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus y
Lecanicillium (Verticillium) lecanii. Por otra parte, los micos insecticidas son
productos que pueden integrarse a las estrategias de manejo integrado de plagas
debido a que son seguros para proteccin ambiental y por lo tanto son usados en
la agricultura extensiva, invernaderos, ambientes protegidos, jardines, etc. Estos
deben de cumplir las siguientes caractersticas: ser productos formulados,
24
estandarizados, tener alta persistencia en almacn, alta eficacia, bajos costos y
fciles de usar, caractersticas que los ponen en desventaja con los insecticidas
rgano sintticos. Las principales diferencias entre los mico insecticidas y los
insecticidas qumicos es que los primeros estn formulados con organismos vivos,
por lo que deben extremarse las precauciones en su produccin, formulacin y
almacenaje, adems como agentes de control biolgico su efecto no es inmediato
ya que requieren de condiciones ambientales favorables, como es: alta humedad
para iniciar el proceso infectivo y expresar su efectividad biolgica en campo
(Alatorre, 2009)
Unos de los aspectos importantes en la produccin de mico insecticidas lo

constituye el control de calidad dentro del proceso de produccin. El cual debe ser
un proceso estandarizado que incluya desde la seleccin y conservacin del
asilamiento, el proceso de produccin, formulacin hasta la determinacin de su
efectividad en campo. La estabilidad patognica de la raza despus de varios pasos
debe ser revisada. El medio de cultivo durante las transferencias y el proceso de
produccin y escalamiento deben ser seleccionados ya que esto puede influir en la
viabilidad y produccin de los conidios o sea en la calidad de estas unidades
infectivas. El control de calidad en la produccin es esencial para cubrir estndares
predeterminados de seguridad. El registro de la informacin de todos los procesos
de produccin y formulacin es crucial por lo que se deber contar con una manual
de procedimiento (Burges, 1981). As mismo es bsico, la identificacin del
patgeno, el mantenimiento del aislamiento y el reconocimiento de contaminantes.
La estandarizacin puede ser definida como la adopcin de tcnicas y procesos que
permitan la obtencin de las unidades ms apropiadas para determinar la capacidad
patognica (virulencia) del producto es deseable producir un patgeno con la
efectividad biolgica constante y que esta pueda ser comparada con la capacidad
de otros biopreparados. En relacin a la estandarizacin de hongos
entomopatgenos existen pocos problemas ya que la unidad de referencia para
determinar la virulencia es e conidio o espora. Para ello en el control de calidad de
25
los hongos entomopatgenos se llevan a cabo las siguientes pruebas
microbiolgicas: concentraciones de conidios, viabilidad de conidios, pureza y
virulencia. En otros casos se considera necesario llevar a cabo pruebas
fisicoqumicas: pH, % de humedad, humectabilidad, suspensibilidad y tamao de
las partculas del formulario (Alatorre, 2009).
Es fundamental en un proceso de produccin contar con un control de calidad que

garantice los estndares preestablecidos; por lo que se realizan una serie de
evaluaciones las cuales garantizarn que el producto salga al mercado con las
caractersticas y efectividad establecida por el fabricante, dentro de los procesos de
calidad existen parmetros para el producto comercializable que son los siguientes:
concentracin de esporas/gr, viabilidad de esporas, contenido de humedad, pureza
(Alatorre, 2009).
3.3.6 Concentracin de esporas o unidades infectivas
La concentracin de esporas o unidades infectivas (UI), es una prueba que se

realiza para conocer la cantidad de esporas que contiene un producto, el mtodo
convencional para conteo de unidades infectivas es mediante la cmara de
Neubauer o hematocmetro. El conteo se realiza tomando un lote al azar, se pesa 1
gr del producto y se disuelve en 9 ml de tween (80 0 20) al 0.03 %, se agita. Se
realiza varias diluciones 1/10 hasta que las esporas puedan observarse que estn
separadas. Posteriormente se realiza el conteo en la cmara de Neubauer, bajo el
microscopio ptico (40 X), se deben realizar diez conteos, se promedian los conteos
resultantes, es importante que los conteos sean ms o menos similares para
obtener datos ms confiables. La concentracin se calcula mediante la siguiente
frmula propuesta por Lipa y Sliznski (1973).
26
No. De UI/ml = X (4 x 106) (FD) /80
Donde:
x = sumatoria del promedio de todos los conteos

(4x106) / 80 = Es una constante que es = 50 000
(FD) = Factor dilucin y puede ser 10, 100, 1000 dependiendo del nmero de dilucin que se hayan
realizado.
Mtodo del conteo de esporas
1 ml = 9. 195 x 105 -------------------- 0.01

Ejemplo: para el clculo de la
10 ml = 9.195 x 107 -------------------- 0.1 g
concentracin en 100 g de producto:
100 ml = 9.195 x 108 ------------------ 1 g
1000 ml = 9.195 x 109 ---------------- 10 g
100 g = 9.195 x 1010
Ejemplo 2. (438.3) (50,000) (10) = 2.19 x 108 esporas/ml en 100 g = 2.19 x 1012 se
requiere tan solo 45.66 o 46 g de producto para una dosis (Alatorre, 2009).
3.3.7 Pureza
La prueba de pureza se realiza para establecer la proporcin de microorganismos

contaminantes con relacin al agente biolgico en la formulacin. Los niveles de
contaminacin aceptables son < 0.002 % (Jenkins 1998). Por otra parte dentro del
proceso de produccin es necesario llevar a cabo un control de calidad y evitar la
27
contaminacin del producto final es importante cuidar que no haya contaminacin
durante todo el proceso de produccin, la cosecha y la formulacin. Los
contaminantes durante el periodo activo de la produccin pueden crecer ms rpido
que el hongo en produccin. La presencia de microorganismos diferentes al
organismo en produccin se cuantifica utilizando la tcnica de unidades formadoras
de colonias (UFC) o por diluciones de conidios (Alatorre, 2009).
28
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1. Localizacin del rea experimental.
Este proyecto se llev a cabo en el Laboratorio de Biotecnologa de la Escuela Maya

de Estudios Agropecuarios de la Universidad Autnoma de Chiapas, localizado en
el kilmetro 4 carretera Catazaj Palenque, Chiapas, con coordenadas de
174039.77 N 920134.18 O. altitud y latitud.
Figura 5. Ubicacin de rea donde se realiz el proyecto de

control biolgico de la garrapata.
4.2 Condiciones climatolgicas del estado de Chiapas y Tabasco.
Estas regiones se caracterizan por presentar clima clido-hmedo casi todo el ao

con lluvias peridicas (de mayo a diciembre), en invierno la temperatura alcanza
hasta los 10 C. Presenta una temperatura que flucta entre los 22 C a 36 C,
siendo 25 C la temperatura media anual. Tiene una temperatura media anual de
26.4 C y una precipitacin pluvial de 2,322 milmetros al ao.
29
4.3 Metodologa para la determinacin de la concentracin letal media de
Metarhizium anisopliae.
Primero se trabaj con la reactivacin de las cepas Metarhizium anisopliae,

posteriormente se trabaj con el aislamiento, virulencia, caracterizacin fisiolgica
y morfolgica. A continuacin en la figura 5 de acuerdo a la metodologa Gonzlez
(1993) y Bautista et al., (2012). Se muestra las etapas para el aislamiento y
determinacin de la concentracin letal media de Metarhizium anisopliae
Conservacin en glicerol al 10%
Reactivacin 1
Seleccin de aislamientos
2
de Metarhizium anisopliae
Virulencia 3
Caracterizacin 4
4.1 Caracterizacin fisiolgica Caracterizacin morfolgica 4.2
4.1. a Crecimiento
Germinacin Color Aspecto
radial 4.1. b
4.2. a 4.2. b
Figura 6. Etapas para el aislamiento y determinacin de concentracin

letal media de Metarhizium anisopliae
30
4.4. Reactivacin de las cepas de Metarhizium anisopliae (etapa 1).
Se reactiv la cepa de Metarhizium anisopliae sobre Hypothenemus hampei
I.- Se limpi el rea de trabaj con hipoclorito de sodio (NaClO), posteriormente se

sec con alcohol antisptico (90), inmediatamente se prendieron los mecheros que
se utiliz.
II.- Para la inoculacin del hongo se seleccion broca de caf (Hypothenemus

hampei) de cafetales de la regin de Tulija del estado de Chiapas estas se
transportaron en cajas plsticas al laboratorio.
III.-Los materiales que se utilizaron tales como: los vasos, cajas Petri, el ADE (agua
destilada estril), papel se esterilizaron en un autoclave a 121 C a 15 libras de
presin durante 15 minutos. El medio utilizado fue PDA (papa dextrosa agar) este
se prepar usando 39g en 1L de agua y disolvindolo en calor. Posteriormente se
realiz el vaciado de medio de cultivo en cajas Petri estril, adicionando a cada caja
petri 15 ml del medio.
IV.- Las brocas del caf (Hypothenemus hampei) se desinfectaron con hipoclorito
de sodio al 0.5 %, que se prepar tomando 10 ml del producto comercial de una
concentracin del 4 % y se diluyo con ADE (Agua Destilada Estril) hasta alcanzar
un volumen de 100 ml.
V.- Las brocas del caf (Hypothenemus hampei) se sumergieron durante 1 minuto
en la solucin de hipoclorito de sodio, se pas a una gasa estril, se lav tres veces
con abundante agua ADE, luego se coloc en papel o toalla estril, para eliminar el
exceso de agua, con la ayuda de un pincel se escogieron las Hypothenemus hampei
y se pasaron a cajas Petri estril.
VI.- Posteriormente, las brocas del caf (Hypothenemus hampei) se inocularon por
inmersin durante 1 minutos en 10 ml con la suspensin del hongo Metarhizium
anisopliae a una concentracin de 1x108 conidios/ml. Posteriormente las
31
Hypothenemus hampei se pasaron a cajas Petri, con papel filtro esterilizado la cual
permaneci hmedo para facilitar el desarrollo del hongo sobre el insecto.
VII.- Despus de 6 a 10 das de haber inoculado, el hongo se desarroll

completamente en el cuerpo de Hypothenemus hampei, se tom individualmente
cada broca con un pincel desinfectado con alcohol antisptico y posteriormente se
realiz una nueva desinfeccin superficial con hipoclorito de sodio comercial al 5.25
% por 1 minuto y sin lavar se coloc inmediatamente en papel filtro o toalla
previamente estril para retirar el exceso de hipoclorito de sodio.
VIII.- Posteriormente las Hypothenemus hampei se colocaron en cajas Petri con

medio de cultivo para el aislamiento del hongo y poder iniciar el experimento
probado en este estudio.
4.5 Virulencia (etapa 3)
Para la determinacin de la concentracin letal media se prepararon cinco

concentraciones a partir de conidias puras de Metarhizium anisopliae
proporcionadas por Bautista et al., (2012) de las cepas MM0801 y CD0804 ms un
testigo absoluto que consisti de agua destilada estril ms Tween 80 20 al 0.03%,
al igual un testigo relativo que fue evaluar un producto qumico (Amitraz),
comnmente utilizado por los productores ganaderos (Balladares et al., 2014). Las
dosis evaluadas fueron: 3.0x104, 3.0x105, 3.0x106, 3.0x107, 2.6x108 conidios/ml para
cada cepa como se observa en el Cuadro 2.
32
Cuadro 2. Diseo experimental completamente al azar para evaluar la virulencia
de Metarhizium anisopliae para el control de la garrapata en laboratorio para la
cepa MM0801 y CD0804
Dosis No. Repeticiones No. Garrapatas vivas

3X104 6 120
3X105 6 120
3X106 6 120
3X107 6 120
2.6X108 6 120
Testigo relativo (amitraz) 6 120
Testigo absoluto (Agua Destilada
Estril + Tween 20 al 0.03%) 6 120
Total 840
a) Colecta de garrapatas
Las garrapatas fueron colectadas en ranchos ganaderos del estado de Tabasco y

la cuenca Lechera de Catazaj, Chiapas. Se utilizaron 60 garrapatas Rhipicephalus
(Boophilus) microplus en estado adulto por tratamiento con 6 repeticiones cada una,
obteniendo as 420 garrapatas evaluadas por cepa, dando un total de 840
garrapatas expuestas en este estudio.
b) Inoculacin
Se realiz por inmersin las garrapatas durante 1 minuto en solucin de esporas.

Se colocaron 10 garrapatas en un vaso de precipitado de 100ml, se le adicion una
cantidad de la solucin de esporas. Al cabo de 1 minuto se vaci el inoculo junto
con las garrapatas en un vaso vaco con una gasa estril de modo que escurriera
el agua, seguidamente las garrapatas se colocaron en papel estril para absorber
la humedad y posteriormente puestas en frascos de vidrio, en cada frasco fueron
colocadas 10 garrapatas, con seis repeticiones cada uno de las dosis ms los
testigos por cepa.
33
c) Toma de datos
Se realiz la toma de datos donde se evalu la mortalidad de garrapatas cada 24

horas despus de la inoculacin. Se contaron las garrapatas muertas y fueron
expuestas en cmara hmeda, posteriormente se tomaron datos de virulencia. (Se
anexa formato de toma de datos). La cmara hmeda consisti en preparar cajas
Petri de plstico desechable con medidas con un trocito de algodn hmedo y
sellado con parafilm previamente esterilizado.
a)
a) b)
b)
Figura 7. Mortalidad de garrapata inoculadas con Metarhizium anisopliae a las
24 horas. a) Garrapatas inoculadas con la cepa MM0801 y CD0804 de
Metarhizium anisopliae. b) garrapatas en cmara hmeda.
d) Establecimiento de lnea base
De las cepas aisladas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae se realizaron

cinco concentraciones de esporas para evaluar la virulencia de la garrapata, para
ello se realiz una solucin de esporas, se pas al conteo de conidios en la cmara
de Neubauer (Goetell, 1997), donde se obtuvo una concentracin de 2.6X108
conidios/ml a partir de esta concentracin obtenida, se realiz las diluciones de
esporas en ADE + Tween 20 al 0.03 %, donde se obtuvo las concentraciones de:
3X104, 3X105, 3X106, y 3X107.
34
Se prepararon cinco concentraciones diferentes de cada cepa de Metarhizium
anisopliae en escala logartmica, de 2685 ppm (ppm=mg/L) hasta 3050 ppm y dos
testigos que consistieron en agua destilada estril ms Tween 20 al 0.03% y un
testigo que consisti en evaluar el qumico (amitraz). Las conidias/ml, que se
evaluaron por cepa de acuerdo al conteo realizado a las soluciones fueron: 3.0X104,
3.0X105, 3.0X106, 3.0X107, 2.6X108. Para la obtencin de las concentraciones
anteriormente mencionadas se prepararon 300 ml de la solucin madre; se tomaron
33 ml de la solucin de hongo que se mesclaron con 300 ml de agua estril para
obtener 350 ml de solucin con una concentracin de 2685 ppm y se procedi de la
misma manera hasta obtener la solucin de 3050 ppm. Con cada una de las
concentraciones se procedi a inocular las garrapatas.
4.6 Caracterizacin fisiolgica (etapa 4.1)
a) Germinacin
Se evalu la capacidad germinativa de las cepas MM0801 y CD0804, cabe

mencionar que estas cepas fueron aislados de Aeneolamia postica y Gallera
melonella (Bautista et al., 2012), simultneamente a la prueba de virulencia
utilizando suspensiones de esporas con concentraciones de 3.5X104, 3.5X105,
3.5X106, 3.5X107, 2.6X108 esporas/ml. El procedimiento consisti en inocular
alcuotas de 5 l en cajas Petri con 10 ml de medio de cultivo PDA. Se marc la
cara posterior externa de las cajas Petri con 7 puntos correspondientes a los lugares
donde se depositaron las alcuotas; posteriormente, se incubaron durante 24 horas
a temperatura ambiente (30), tiempo despus del cual se adicion una gota de
azul de lacto fenol con el fin de suspender el proceso de germinacin y teir las
esporas. Los puntos de inoculacin se contaron en cuadrados, se transfirieron a
laminas portaobjetos y se cubri con un laminilla para proceder al recuento. La
observacin microscpica se realiz con un aumento de 40X, determinando la
germinacin en cinco campos microscpicos/alcuota, totalizando las esporas
germinadas y no germinadas; los resultados se expresaron en porcentaje de
35
esporas germinadas/repeticin. Para cada cepa se utilizaron cinco cajas Petri por
repeticin.
Viabilidad de las esporas
La viabilidad de un producto es la medida de la cantidad de unidades infectivas

conidios o esporas que tiene la capacidad de germinar y se expresa en porcentajes
y el estndar recomendado para la utilizacin de hongos entomopatgenos como
agentes de control microbiano es una viabilidad > 90%. Las esporas o conidios de
los hongos entomopatgenos son entidades vivas, por lo que su viabilidad o
proporcin de conidios vivos disminuye con el tiempo, dependiendo de las
condiciones en las cuales son almacenados lo cual se recomienda sea a 4 C, esta
prueba debe realizarse a diferentes intervalos de tiempo durante el periodo de
almacenamiento (Alatorre, 2009).
Para evaluar la viabilidad de las esporas o el porcentaje de germinacin se sigui

Los siguientes pasos:
I. Se prepararon cajas Petri de 60 mm de dimetro con medio de cultivo Agar

Dextrosa Sabouraud (ADS), se agreg 12 a 15 ml del medio de cultivo.
II. Se prepar una suspensin de esporas de 2.6X108 conidios/ml se agito hasta

obtener una suspensin homognea. Se realizaron diluciones, tomando 1 ml de la
solucin de esporas y fue colocado en un frasco con 9 ml Tween 20 al 0.03 %.
III. Se colocaron 50 l de la solucin de esporas en cinco puntos de la caja de Petri

con ADS, evitar que queden cerca de los bordes.
IV. Se Incubo la caja petri previamente inoculada con el hongo a 27 1 C por 12 a

24 h. Posteriormente se observ con el microscopio ptico en el objetivo 40X. Se
agreg una gota de lactofenol azul con un algodn para parar el desarrollo de las
conidias y contar 300 conidias y registrar las esporas germinadas y no germinadas;
el criterio a considerar un conidio como germinado es que su tubo germinativo sea
36
igual o mayor que el tamao del conidio (Alatorre, 2009). Se cont un total de 8
cajas por aislamiento dando un total 16 cajas evaluadas. Posteriormente se realiz
un promedio y se calcul el porcentaje de germinacin con la siguiente formula. Se
realiz esta prueba a los 6, 12, 18 y 24 horas.
Formula:
a/ (a+b) x 100 = %germinacin
Dnde: a = conidios germinados

b = conidios no germinados
b) Crecimiento radial.
Se tomaron fragmentos del hongo Metarhizium anisopliae crecidos 8 das en medio

de cultivo PDA. El tamao del fragmento fue de 0.5 X 0.5 cm y estos aislamientos
fueron colocados en el centro de la caja petri con medidas de 15 x 60 mm. El
material se incubo a temperatura ambiente (30) y se midi el crecimiento radial con
un nanmetro cada 24 horas a partir de la inoculacin. El dimetro de la colonia se
expres en milmetros. Para la evaluacin de esta variable, se us un diseo
completamente aleatorio con cinco repeticiones para cada cepa, dando un total de
10 cajas Petri.
4.7 Caracterizacin morfolgica (etapa 4.2).
La determinacin de las caractersticas morfolgicas como color, aspecto de la

colonia, formacin de cinemas, produccin y difusin de pigmento de las cepas
seleccionadas se bas en la observacin macroscpica de las colonias. El
procedimiento consisti en inocular alcuotas de 5 l en el centro de 10 cajas Petri
con 10ml de PDA sin acidificar, incubando a temperatura ambiente por 30 das.
37
5. RESULTADOS Y DISCUSION
5.1 Reactivacin de Metarhizium anisopliae
En la reactivacin de Metarhizium anisopliae de la cepa MM0801 y CD0804 sobre

la broca de caf hypothenemus hampei a los cinco das despus de la inoculacin
se obtuvo resultados de esporulacin del hongo en el cuerpo del insecto, con un
80% de germinacin.
a) b)
b)
c) d)
c) d)
Figura 8. Reactivacin del hongo M. anisopliae MM0801 Y

CD0804 a). Broca del caf previamente inoculadas con el hongo
colocadas en caja Petri con papel filtro hmedo b) Esporulacin
del hongo en el cuerpo de la broca de caf a los 4 das de la
inoculacin. c) Broca del caf a los 6 das cubierto un 50 % del
hongo M. anisopliae. d) la broca de caf cubierto el 80% del
hongo en 8 das.
38
5.2 Seleccin de aislamiento de Metarhizium anisopliae.
Las dos cepas de Metarhizium anisopliae MM0801 y CD0804 de la Regin, fueron

reactivadas en broca de caf (Hypothenemus hampei), las cepas presentaron
crecimiento a los 8 das de haber inoculado en medios de cultivo PDA (Agar
Dextrosa Papa).
Figura 9. Hongo Metarhizium anisopliae aislados en tubos de ensaye

con medio de cultivo PDA.
5.3 Virulencia.
Los resultados que se obtuvieron en la toma de datos del experimento de la

determinacin de CL50 para conocer la virulencia del hongo Metarhizium anisopliae
sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus fueron analizados con
Probit. La determinacin de la CL50 fue calculada con una solucin de 2.6X108 de la
cepa MM0801 y de la CD0804 con una solucin de 5.28X10 8, y en la figura 10 se
observa garrapatas micosadas con las dosis obtenidas del hongo Metarhizium
anisopliae.
39
a) b) c)
Figura 10. Garrapatas micosadas con las concentraciones obtenidas 3X10 4, 3X105,
3X106, 3X107 y 2.6X108 de Metarhizium anisopliae. a) Garrapata micosada con la
concentracin 3x104 conidios/ml. b) dosis micosada con la concentracin 3x10 5
conidios/ml. c) garrapata micosada con la concentracin 2.6x108.
En el cuadro 3 se observa los datos de mortalidad encontrada, corregida y esperada

de las cepas MM0801 y CD0804 sobre Rhipicephalus (Boophilus) microplus, estos
indican que la segunda cepa mencionada fue la que obtuvo mejores resultados. Por
otro lado, la Concentracin Letal Media (CL50) para la cepa MM0801 de Metarhizium
anisopliae fue de 6.58X106 conidios/ml mientras que para la cepa CD0804 fue de
8.87X105 conidios/ml, en ambos casos se evaluaron los datos a los siete das post-
inoculacin, con intervalos de confianza del 95%.
Como se observa el cuadro 3. La cepa CD0804 su CL50 fue de 8.87X105 en

comparacin con la cepa mm0801 que su CL50 aun as utilizando concentracin
ms baja de la cepa 0804 se logra alcanzar su CL50 posiblemente esto se deba a
su caracterizacin gentica que presente cada cepa como lo menciono bautista et
al., 2012
40
Cuadro 3. Datos de mortalidad de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus a los
siete das post-inoculacin y Concentracin Letal Media (CL50).
Aislamiento % Mortalidad % Mortalidad % Mortalidad X2 CL50

encontrada Corregida Esperada Calculada
MM0801 50.66 19.99 30.45 .928 6.58X106
CD0804 57.33 20 34.45 5.030 8.87X105
Bazn (2012), evalu el hongo Beauveria bassiana y encontr un porcentaje de

mortalidad a los siete das de 82.5 % con una concentracin de 3200 ppm,
posiblemente se deba que los porcentajes de este estudio fueron superiores a
nuestro estudio por las condiciones del hongo y concentraciones. Por lo que se
recomienda evaluar a Beauveria bassiana en la regin de los ros del estado de
Tabasco.
La diferencia de los resultados obtenidos en la Concentracin Letal Media puede

deberse al tipo de insecto hospedero donde fue aislado, por la distribucin
geogrfica de las cepas o por las variaciones genticas (Alves, 1998; Coates et al.,
2002).
5.4 Caracterizacin fisiolgica
Germinacin
Las cepas MM0801 y CD0804 presentaron un porcentaje arriba del 80% a las 18 y
las 24 horas tuvo un porcentaje arriba de 90%, como se muestra en los cuadros 4 y
5.
41
Cuadro 4. Porcentaje de germinacin de conidios de las cepas MM0801 y CD0804 a
las 18 horas despus de la inoculacin.
Cepas Porcentaje de germinacin de conidios de Metarhizium anisopliae a

las 18 horas
MM0801 87.84 %
CD0804 74.56 %
Cuadro 5. Porcentaje de germinacin de conidios de las cepas MM0801 y CD0804 a

las 24 horas despus de la inoculacin.
Cepas Porcentaje de germinacin de conidios de Metarhizium anisopliae a

las 24 horas
MM0801 100 %
CD0804 80.54 %
En los cuadros 4 y 5 se observa el porcentaje de germinacin de conidios de las

cepas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae. En el cuadro 4, se observa
que la cepa MM0801 presenta una germinacin 87.84% a las 18 horas en
comparacin a la cepa CD0801 que tuvo una germinacin del 74.56% a las 24 horas
se observa en el cuadro 5, que la cepa MM0801 presenta un 100% de germinacin
en comparacin con la cepa CD0804 que presento un 80.54%. En otros estudios
por Bautista et al., (2012), obtuvieron un porcentaje de germinacin de conidias del
92% de la cepa MM0801 a las 24 horas en comparacin con este trabajo que se
obtuvo un 100% de germinacin, posiblemente se deba a que esta cepa fue
reactivada.
42
Crecimiento radial
Se evalu el crecimiento radial de las cepas MM0801 y CD0804 en cajas petri con
medidas de 60 x 15 mm con medio de cultivo PDA (Agar Dextrosa y Papa), el
crecimiento radial se midi con el apoyo de un nanmetro cada 24 horas a partir de
la inoculacin hasta las 120 horas (momento donde la caja queda totalmente
cubierta del hongo). El crecimiento radial se expres en milmetros y fue graficada
por cada 24 horas.
48 Horas
0.9
0.8
0.7
0.6
CRECIMIENTO (CM)
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
MM0801 CD0804
CEPAS
Figura 11. Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 48 horas a

partir de la inoculacin.
En la figura 11. Se observa que el crecimiento radial para la cepa MM0801 fue de
0.6 cm a las 48 horas en comparacin a la cepa CD0804 que tuvo un crecimiento
de 0.7 cm. Por lo que la diferencia entre cepa fue de 0.1 cm. Elsegui et al., (2003),
evaluaron crecimiento radial de cepas de Metarhizium anisopliae en medio de
cultivo ADS lo cual encontraron diferencias significativas fluctuando entre 31 y 37
mm en comparacin a este trabajo que vario muy poco.
43
de 1.3 cm.
72 Horas
1.36
1.34
1.32
1.3
CRECIMIENTO (CM)
1.28
1.26
1.24
1.22
1.2
1.18
MM0801 CD0804
CEPAS
Figura 12. Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 72

En la figura 12. Se muestra que la diferencia fue de 0.1 cm. En comparacin al

trabajo realizado por Elsegui et al., (2003), donde estos autores evaluaron
crecimiento radial de hongos entomopatgenos y no mostraron diferencia
significativa entre las cepas con el medio ADS, cabe mencionar que en este trabajo
de investigacin solo se evalu con PDA.
44
de 1.9 cm.
96 Horas
2
1.95
1.9
CRECIMIENTO (CM)
1.85
1.8
1.75
1.7
MM0801 CD0804
CEPAS

En la figura 13 se muestra que la diferencia entre cepa fue de 0.2 cm. En

comparacin al trabajo de Ruiz-Snchez et al., (2011) que evaluaron crecimiento
radial obteniendo resultados que variaron de 0.31 a 0.37 cm.
45
En la figura 14. Se observa que el crecimiento radial fue de 2.1 cm en 120 horas
para ambas cepa MM0801 y CD0804.
120 Horas
2.5
2
CRECIMIENTO (CM)
1.5
0.5
0
MM0801 CD0804
CEPAS

Sin embargo la cepa MM0801 en las primeras 96 horas mostro un crecimiento lento
con un promedio de crecimiento por da de 1.4 cm, esta diferencia numrica no
impacto en la pruebas de virulencia ya que la cepa MM0801 fue la ms agresiva.
5.5 Caracterizacin morfolgica
Color
El medio de cultivo ADS (Agar Dextrosa Saboraud) a los tres das de haber
inoculado las cepas de Metarhizium anisopliae, presentaron una coloracin rosada
de acuerdo a Garca Gutirrez et al, (2006) esto posiblemente se deba al contenido
46
de metabolitos extracelulares y actividad enzimtica que se lleva a cabo durante el
desarrollo del micelio. Sin embargo, estas cepas al momento de inocular,
presentaron una coloracin para la cepa MM0801 verde oscuro y para la cepa
CD0804 presento una coloracin oliva-amarillo, esto coincide a Bautista et al.,
(2012).
Figura 15. Hongo Metarhizium anisopliae en tubos de ensaye

presenta una coloracin rosada de acuerdo a Munsell (1974).
47
6. CONCLUSIONES
Metarhizium anisopliae infecta las poblaciones de garrapatas Rhipicephalus

(Boophilus) microplus con las cepas MM0801 con una CL50 de 6.48X106
conidios/ml. y CD0804 con una CL50 de 8.87X105 conidios/ml.
El crecimiento radial de las cepas MM0801 y CD0804 de Metarhizium anisopliae

con el medio de cultivo PDA (Agar Destroza y Papa). Presentaron un crecimiento
similar para ambas cepas.
La viabilidad de conidias con la cepa MM0801 influyo en el grado de virulencia de

un 30.45% y con la cepa CD0804 un 34.45% en la garrapata Rhipicephalus
(Boophilus) microplus.
48
7. LITERATURA CITADA
Alatorre, R. R. 2009. XXXI Congreso Nacional de Control Biolgico, Villahermosa.

Tabasco. Manual de control de calidad de microorganismos patgenos.
Arenas, Y. B. 2009. Utilizacin de hongos entomopatgenos para el control del

salivazo Aeneolamia varia (Hemiptera: Cercopidae). Programa de variedades
entomologa, Cenicaa. 29 Pg.
Balladares, P., Bautista-Galvez, A., Pozo-Santiago, C.O y Pimentel-Segura R.

(2014). Control Biologico de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)
microplus con Metarhizium anisopliae. IX Congreso de Biotecnologa.
Palenque, Chiapas. p56.
Barandika, I. J. F. 2010. Las garrapatas exofilas como vectores de agentes

zoonticos: estudio sobre las abundancia y actividad de las garrapatas en la
vegetacin, e investigacin de la presencia de agentes patgenos en
garrapatas y micro mamferos. Universidad de Nuevo Len. Pag. 31.
Baruch, Z. M. J. 2012. Prevalencia de ranchos y factores asociados con poblaciones

de Rhipicephalus (Boophilus) microplus resistentes a cipermetrina en
municipios de la zona centro del estado de Veracruz. Veracruz. Pag.10.
Bautista-Glvez, A., Barrera, J.F., Payr de la Cruz, E., Salgado-Garca, S., Gmez-
Ruiz, J., Gmez-Leyva, J.F. 2012. Genetic characterization of Metarhizium
anisopliae (Metchnikoff) sorokin isolates from sugarcane field and their
pathogenicity against Aeneolamia postica (Walker) (Hemiptera: Cercopidae)
(28) (3):217-229.
Bautista, G. A., Gonzalez, C. N. 2008. Manual aplicacin del hongo Metarhizium

anisopliae (Mecht) Sor. En la regin de los ros del estado de Tabasco. Pag
10.
49
Bazn, T. M. 2002. Efecto de Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina:
Hyphomycetes) en el control biolgico de Boophilus microplus Canestrini
(Acari: Ixodidae) en ganado bovino estabulado. Tecomn, Colima. Pag. 9.
Castillo, Z. S. 2006. Uso de Metarhizium anisopliae para el control biolgico del

salivazo (Aeneolamia ssp. y Prosapia ssp.) en pastizales de Brachiariade
cumbrens en el Petn, Guatemala. Pag. 17 y 18.
Cortes, V. J. A., Betancourt, E. J. A., Arguelles,C. J., Pulido, H. L. A. 2010.

Distribucin de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus en bovinos y
fincas del altiplano cundiboyacense (Colombia). Pag. 74
Durden, L.A., Keirans, J. E., Oliver, J. H. 1996. The U.S National Tick Collection. A
vital resource for systematic and human an animal welfare. Pag. 239-242.
Elsegui, O., Nieves, C., Daz, R., Bel, P.N., Carr, A. 2003. Comportamiento del
hongo entomopatogeno Beauveria bassiana (Bals.) vuill. Cepa Lbb-1 en Agar
Sabouraud Dextrosa producido en Cuba. Fitosanidad, Instituto de
Investigacin de Sanidad Vegetal. Cuba. Vol. 7(2). Pag. 49-53
Espaa, L. M. P. 2000. Caracterizacin enzimtica de aislados de Beauveria

bassiana (Deuteromycotina: Hyphomycetes), y su virulencia sobre
Epilachnavarivesti (Coleptera: coccinellidae). Universidad de Colima,
Tecomn, Colima. Pag. 25.
Fernndez, J.A. 2006. Evaluacin de la Eficiencia del Control de Garrapatas

(Boophilus microplus) con Tres Frecuencias de Aplicacin de Bazn
(Beauveria bassiana). Zamorano. Honduras. 6-8 Pg.
Fuentes, M.Y. 2011. Resistencia de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a

ixodicidas (cipermetrina y amitraz) en bovinos de Actopan y Veracruz,
Veracruz, ver. Pag. 14.
50
Garca Gutirrez, C., Hernndez Velzquez, V. M., Gonzlez Maldonado, M.
B. 2006. Hongos entomopatogeno. Biotecnologa Financiera Aplicada a
Bioplaguicidas. Mxico D. F. pg. 100.
Garca, P. J. L. 2011. Evaluacin de las propiedades acaricidas de

Pipercrassinervium Kunth. Piperaequale Vahl. (piperaceae) sobre larvas de
Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (acari:ixodidae).
Universidad Nacional de Colombia. Pag. 17.
Garca, O. N. 2012. Produccin de Conidios de Metarhizium anisopliae var

lepidiotum en Atmosferas Oxidantes. Tesis de Maestra. Mxico D.F. Pag. 4.
Goettel, S.M., Inglis, D.G. 1997. Fungi: Hyphomycetes. Manual of Techniques in

Insect Pathology. Edic by: Lacey. A. L. Yakima Agricultural Research
Laboratory. USDA. Pag. 213-244.
Gonzlez, G. M.T., Posada. F.F.J., Bustillo, P.A.E. 1993. Desarrollo de bioensayo

para evaluar la patogenicidad de Beauveria bassiana sobre Hypothenemus
hampei. Revista Cenicafe (Colombia) 44 (3):93-102.
INEGI, 2005. Marco Geo estadstico Municipal, versin 3.1. Conjunto de datos
vectoriales de uso de suelo y vegetacin. Informacin topogrfica digital.
Navas, P. A. 2003. Influencia de la cobertura arbrea de sistemas silvopastoriles en

la distribucin de garrapatas en fincas ganaderas en el bosque seco tropical.
Turrialba, Costa Rica. Pag. 5.
Ojeda-Chi, M.M., Rodrguez-Vivas, R.I., Galindo-Velasco, E., Lezama-Gutirrez, R.,

Cruz-Vzquez, C. 2011. Control de Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae)
mediante el uso del hongo entomopatogeno Metarhizium anisopliae
(Hypocreales: Clavicipitaceae). Revisin. Pag. 178, 182,183.
51
Orduo, C.N. 2009. Virulencia de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae
sobre el picudo del nopal Metamasius spinolae. Montecillo, Texcoco, Estado
de Mxico. Pag. 7,8.
Pozo, S. C. O. 2012. Efectividad de un microencapsulado de Beauveria bassiana

sobre Metamasius spinolae. Instituto Politcnico Nacional. Centro de
Desarrollo de Productos Biticos. Yautepec, Morelos. Pag.5.
Ruiz-Snchez, E., Chan-Cupul, W., Prez, G.A., Cristbal-Alejo, J., Uch-Vzquez,

B., Tun-Surez, J. M., Mungua-Rosales, R. 2011. Crecimiento, esporulacin
y germinacin in vitro de cinco cepas de Metarhizium y su virulencia en
huevos y ninfas de Bemisia tabaco. Revista Mexicana de Micologa 33: 9-15.
Pag. 12-13.
Samish, M. y J. Rehacek, 1999. Pathogenes and predators of ticks and their

potential in biological control review. Annual review of Entomology, 44:159-
182.
Santibez, S. S. 2012. Rendimiento de diferentes mtodos de PCR en el

diagnstico molecular de las rickettsiosis humanas transmitidas por
garrapata. Pag. 6.
Siap, 2014. (En lnea) Recuperado el 28 de agosto del 2014. www.siap.gob.mx
Senasica, 2014. (En lnea) Recuperado el 28 de agosto del 2014.

www.senasica.gob.mx
Soberanes, C. N., Santamara, V. M., Frangoso, S.H., Garca, V. Z. 2002. Primer

caso de resistencia al amitraz en la garrapata del ganado Boophilus
microplus en Mxico. Tcnica Pecuaria en Mxico. Instituto Nacional de
Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. Pag. 82.
52
Soto, A. J. 2008. Caracterizacin molecular de aislamiento de Beauveria bassiana
y Metarhizium anisopliae y evaluacin de su toxicidad sobre gusano cogollero
del maz Spodoptera frugiperda (J.E. Smith).Guasave, Sinaloa. Pag. 18-20.
Tomas, M., y Read, A. (2007). Can fungal biopesticides control malaria nature
reviews microbiology, 5(5), 337-382
Zimmermann, G. 2007 Revisin de seguridad del hongo entomopatogeno

Metarhizium anisopliae; Biocontrol Ciencia Y Tecnologa, 17:9, 879 920.
53
8. ANEXOS
DOSIS-------- 1X105 Nombre:
Metarhizium anisopliae Fecha: Hora:
T2 CEPA 1
Horas/Garrapatas Muertas
fechas
Repeticiones 24 48 72 96 120 132 144 168 192 216 240
R1
R2
R3
R4
R5
R6
Total
Observaciones:
T2 1 X 105
Hora/Garrapatas Muertas
54
Fechas
Repeticiones 264 288 312 336 360 384 408 432 456 480 504
R1
R2
R3
R4
R5
R6
Total
Observaciones
Dosis 1 x105
T2 CEPA 1
Horas/Garrapatas Muertas
Repeticiones 528 552 576 600 624 648 672 696 720 744 768
R1
R2
55
R3
R4
R5
R6
Total
Observaciones:
Figura 16. Formato de toma de datos de la mortalidad de la garrapata que se utiliz en

este trabajo.
56

E1T1 Tesis Control de Garrapatas

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIAPAS

Escuela Maya de Estudios Agropecuarios

Hongos entomopatgenos para el control de la garrapata

Presentada como requisito parcial para

FRANCISCO JAVIER SNCHEZ MENDOZA

Dra. Arely Bautista Glvez

Catazaj, Chiapas, Mxico. Octubre, 2014.

A Dios por darme fuerzas y acompaarme siempre en mis logros profesionales, en

A mis amigos de la generacin que me brindaron su apoyo y amistad (Leydi

A mis Maestros de la carrera que me apoyaron a lo largo de mi formacin

A la Fundacin Produce Tabasco por el financiamiento del proyecto:

Al M.C. Cesar Orlando Pozo Santiago que me apoyo en asesoras de laboratorio.

A la Escuela Maya de Estudios Agropecuarios de la UNACH por haber permitido la

A la Universidad Tecnolgica del Usumacinta por haberme facilitado su laboratorio

Finalmente quiero agradecer profundamente a nuestro fundador de la Escuela Maya

Cuadro 2. Diseo experimental completamente al azar para evaluar 33

Cuadro 3. Datos de mortalidad de la garrapata Rhipicephalus 41

Cuadro 4. Porcentaje de germinacin de conidios de las cepas 41

Cuadro 5. Porcentaje de germinacin de conidios de las cepas

Figura 2. Estructura de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) 9

Figura 3. Ciclo biolgico de la garrapata Rhipicephalus 11

Figura 4. Proceso de infeccin de los hongos entomopatgenos. 15

Figura 5. Ubicacin de rea donde se realiz el proyecto de control 29

Figura 6. Etapas para el aislamiento y determinacin de la

Figura 7. Mortalidad de garrapata inoculadas con Metarhizium

Figura 8. Reactivacin del hongo Metarhizium anisopliae de las 38

Figura 9. Hongo Metarhizium anisopliae aislados en tubos de 39

Figura 10. Garrapatas micosadas con las concentraciones 40

Figura 11. Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 48 43

Figura 13. Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 96 45

Figura 14. Crecimiento radial de Metarhizium anisopliae en 120 46

Figura 15. Metarhizium anisopliae cepa CD0804 en tubos de

Figura 16. Formato de toma de datos de la mortalidad de la 56

El objetivo del presente trabajo consisti en determinar la concentracin letal media

La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es el ectoparsito de mayor

2.1 Objetivo general

Determinar la concentracin letal media del hongo entomopatgeno Metarhizium

2.2 Objetivos especficos

- Evaluar la virulencia del hongo entomopatgeno Metarhizium anisopliae en la

- Evaluar la viabilidad de las conidias y el crecimiento radial de Metarhizium

3.1 Generalidades de la garrapata Rhipicephalus Boophilus microplus

La garrapata de la familia Ixodidae se reporta como parsito obligados de reptiles

El grupo de estos artrpodos, incluyen cerca de 825 especies divididas en tres

Taxonoma de las garrapatas

Phylum Arhropoda Familias Grupo Subfamilia Genero

La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus originaria del continente asitico

En Europa, norte de Asia y China Rhipicephalus appendiculatus es importante

Figura 1. Distribucin de la garrapata en Mxico y su control (SENASICA ,2014).

Dentro de la fase de control de la garrapata a partir de ao 2001 se identific la

3.1.3 Enfermedades transmitidas por la garrapata.

Las garrapatas son vectores en la transmisin de enfermedades zoonticas, por

Las infestaciones por Rhipicephalus (Boophilus) microplus pueden causar

Las garrapatas tienen efectos negativos sobre la produccin de la cual se conocen

3.1.4 Importancia econmica.

Como se puede observar en cuadro 1. En el 2012 la produccin de carne en Chiapas

Produccion de carne y leche

Chiapas 116,078 36.89

Chiapas 404,148 4.80

Fuente. (SIAP, 2014)

Morfolgicamente las especies de la familia Ixodidae se caracteriza por poseer

Estos caros presentan dos partes diferentes visibles, el tronco globoso y

Figura 2. Estructura de la Garrapata

El sistema de proteccin o cutcula posee tres capas: epicuticula, mesocuticula y

3.1.6 Hospederos de la garrapata