UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

Facultad de Ingeniera Ambiental

UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

FACULTAD DE INGENIERA AMBIENTAL

PREPARACIN. DILUCIN DE MUESTRAS AMBIENTALES. NUMERACIN DE

MICROORGANISMOS AERBICOS MESOFILOS VIABLES

TERCER LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGA AMBIENTAL- BO-112

ALEXIS BERROCAL CORONEL 20162733H

KEVIN LEONARDO APOLINARIO 20162528E

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTN MARTNEZ VILA

Lima, Per
Mayo del 2017

1
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental

INDICE

I. RESUMEN
II. INTRODUCCIN
III. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL:
B. OBJETIVOS ESPECFICOS:
IV. MARCO TERICO
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A. MATERIALES
B. METODOLOGA.
VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIONES
VIII. FUENTES DE INFORMACIN
IX. ANEXOS
X. APNDICE
A. DIAGRAMA DE FLUJO

2
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental

RESMEN:
En el presente informe realizaremos recuento en Placa por Siembra de Profundidad y
Recuento en Placa de Siembra por extensin en Superficie o Diseminacin que son el
mtodo 1 y 2,en el cual consiste en triturar primero la muestra para poder echarlo en
agua Peptonada y proceder a echarlo en la cajas petris a diferentes disoluciones para
luego proceder a contar cuantas colonias se han formado durante un rango de
81horas aproximadamente.
INTRODUCCIN:
El suelo es un hbitat favorable para la proliferacin de microorganismos y en las
partculas que lo forman se desarrollan micro colonias. Los microorganismos aislados
del suelo comprenden virus, bacterias, hongos algas y protozoos.
Las bacterias del suelo pueden ser aerobias estrictas, anaerobias facultativas,
microaerfilas o anaerobias estrictas. Determinados suelos pueden favorecer
poblaciones bacterianas con un metabolismo particular.

OBJETIVOS:

GENERAL:
Cuantificar la poblacin de microorganismos aerobios viables en determinada
muestra.

ESPECFICOS:
Conocer el nmero de microorganismos aerobios mesfilos que contiene un
alimento
Determinar cuntos microorganismos presenta la muestra que analizamos.

Familiarizarse con mtodos directos para la obtencin de microorganismos

utilizando el mtodo de recuento de colonias en placa.

MARCO TERICO:

Microorganismos:

Son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de

pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia diversidad de nichos
ecolgicos. Entre los requerimientos ms importantes para su desarrollo estn el
carbono, el oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrogeno, Muchas bacterias,

3
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental
sin embargo, necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos en
forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros.

Cultivo:

Es el producto del crecimiento de organismos o grupos de organismos, establecidos

con fines experimentales e industriales.

Cultivo puro:

Es la presencia de una sola especie de microorganismo libre de todo contaminante, a

esto que tambin se le denomina AXENICO.

Tcnicas de recuento bacteriano

Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire,

alimento, cultivos, entre otros, existen diferentes mtodos o tcnicas: Algunas tcnicas
son directas y permiten un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las
muertas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o
recuento electrnico, el recuento en placa, o el clculo del nmero ms probable
(NMP).

Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las clulas como
son la turbidez, el peso seco, o una actividad metablica.

Recuento de colonias o recuento estndar en placa:

Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan despus de
inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo
determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el
nmero de clulas aisladas o microorganismos unicelulares viables como bacterias,
levaduras, tambin se utiliza para el conteo de esporas fngicas presentes en la
muestra.

La muestra a inocular debe ser homognea y no contener conglomerados de clulas.

Despus de la incubacin cada microorganismo o clula viable formar una masa
visible de organismos, o sea una colonia. De esta manera el nmero de colonias
permitir a su vez determinar el nmero de organismos viables en la muestra
sembrada. Se pueden utilizar sistemas de siembra en superficie, o en profundidad.

Generalmente la muestra original se diluye para que el nmero de colonias

desarrolladas en la placa se encuentren entre 30 y 300 colonias y as permitir un
ptimo crecimiento y facilitar la lectura. Cuando la muestra se diluye el clculo del
resultado se realiza contando las colonias en aquellas placas que tengan entre 30 y
300, se promedia y se multiplica por el factor de dilucin. Los resultados se expresan
en colonias por ml. Los resultados tambin pueden expresarse en unidades
formadoras de colonias (UFC), el valor de UFC es un valor que expresa el nmero
relativo de microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro
cbico de muestra.

4
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental

En el caso de alimentos el resultado se considera como un indicador de las

caractersticas higinicas generales del alimento.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

a) Equipos y materiales:

Licuadora (20 000 RPM)

Vaso Licuadora 1lt.

Balanza Analtica

Pinzas, Tijeras, Esptula, Cuchillo

Pipetas Bacteriolgicas 10ml y 1ml

Refrigeradora 25C

Diluyente-Agua peptonada para diluciones

5
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental

b) Metodologa

b.1. Recuento Estndar en Placa o Pour Plate o Recuento en Placa por Siembra de
Profundidad
MTODO 1
Dilucin:
Procedimientos:
1. Pesar 10gr. de muestra en condiciones de asepsia.
2. Homogenizar con 90ml. de solucin diluyente (AP) en licuadora.
3. Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml. de solucin
diluyente.
4. Depositar 1.0ml.de cada disolucin en cajas de Petri estriles.
Siembra:
Procedimientos:
1. Adicionar de 15 a 20 ml de agar (APC) triptona extracto de levadura fundido y
enfriado a 45C en placas de Petri estriles conteniendo inculo de 1ml por
dilucin.
2. Incubar las cajas en posicin invertida a 35C por 48 horas.
3. Homogenizar la muestra y el agar mediante rotacin y vaivn.
4. Adicionar control de esterilidad:
- Ms 1ml de AP estril y APC (15-20ml)
- Ms APC (15-20ml)
5. Contar aquellas placas que tengan entre 30 a 300 colonias y reportar con
ufc/gr.
b.2.Recuento en Placa de Siembra por extensin en Superficie o Diseminacin
MTODO 2
Dilucin:
Procedimientos:
1. Pesar 10gr de muestra en condiciones de asepsia.
2. Homogenizar con 90ml de solucin diluyente (AP) en licuadora.
3. Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0ml de solucin
diluyente.

6
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental
4. Adicionar previamente de 15 a 20ml de agar (APC) triptona extracto de
levadura fundido y enfriado a 45C en placas Petri estriles y dejar solidificar el
APC.
5. Depositar 1.0ml de cada disolucin en cajas Petri estriles.
Siembra:
Procedimientos:
1. Para la siembra por diseminacin emplear la esptula de Drigalsky.
2. Dejar secar superficie de placa por 10min.
3. Incubar las cajas en posicin invertida a 35 C por 72h.
4. Adicionar control de esterilidad:
- Ms 1ml de AP estril y APC (15-20ml)
- Ms APC (15-20ml)
5. Contar aquellas placas que tengan entre 30 a 300 colonias y reportar con
ufc/gr.

C) diagrama de flujo

90 ml de
Agua
Muestra Peptonada
(carne
molida) 10 9 ml de
diluyente

1ml 1ml 1ml

Homogenizar
CONCLUCIONES:10- 10- 10- 10-
2 3 4 5
Dilucin
El recuento de colonias 10
se -1
realiza despus de la inoculacin del medio de cultivo y de
una incubar a temperatura adecuada.

RECOMENDACIONES:

7
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental
Utilizar los guantes de asbesto para tomar las muestras calentadas y evitar
quemaduras.

Esterilizar las pipetas para tomar las muestras y as evitar contaminacin por
otros microorganismos que no se quieren analizar.

FUENTES DE INFORMACIN:

http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12-
metodos%20de%20recuento.htm

http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201504/contLinea/leccin_30_tcnicas_d
e_recuento_bacteriano.html

Biologa de los Microorganismos. Autor: Michael T. Madigan

Romero Martines , M., Esquivel Len , J. I., Alvarado Cruz, F. G.,

Montes de Oca, R. C., & Rangel Valdez, M. L. (6 de junio de 2012).
Microbiologia. Obtenido de Microbiologia:
http://realisaciondeanalisis.blogspot.pe/

ANEXOS:

METODO 1

8
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental

METODO 2

APENDICE:
MTODO 1: Recuento Estndar en Placa o Recuento en Placa por Siembra en
profundidad o incorporacin (Difusin)

Materiales y Equipos:

Placas Petri

Pipetas Bacteriolgicas 1ml y 10ml

Bao Agua (Bao Mara) regulado 14C-46c

Incubadora: 28-31C

Contador de colonias

9
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental
Agar Plate Count

Incorporar 15-18ml de APC licuado a 46C y mezclar:

10- 10-2 10-3 10- 10-

1 4 5

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Control de Esterilidad (C.E.)

Con APC Con APC + 1ml de

(sin AP
muestra)

Incubar: 31C x 2 das (placas invertidas)

MTODO 2: Recuento en Placa de Siembra por extensin en Superficie o

Diseminacin (se aplica a conteo>3000gr)

Materiales y Equipos:

Los indicados en el Mtodo 1

Estufa: 50C

Esptula Drigalsky

Pipetas de 1ml

10
 UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
Facultad de Ingeniera Ambiental
Placas Petri con APC solidificado.

10-1 10- 10-3 10- 10-

2 4 5

0.1m 0.1m 0.1m 0.1m 0.1m

l l l l l

Sembramos por extensin, diseminacin con esptula Drigalsky

Con APC Con APC + 0.1ml de

(sin AP
muestra)

Dejar secar la superficie de placa por 15 minutos. Incubar placas invertidas por 72
horas (3 das).

11