Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La

Plata

Bioqumica III- 2009

Trabajo Prctico No 5
Trabajo Prctico: Regulacin de la expresin gnica en procariotas
Regulacin del opern Lac en E. coli

La regulacin de los procesos celulares permite a los organismos optimizar el aprovechamiento de los recursos
disponibles en cada momento. Como la realizacin de estos procesos celulares depende en gran medida de la
accin de enzimas, el control de su sntesis es crucial (etapa final de la expresin gnica). Si bien la expresin
gnica puede ser regulada en diferentes etapas, el control del inicio de la transcripcin permite el mximo ahorro de
energa evitando toda sntesis de productos no requeridos.
Los primeros organismos en los que se estudiaron estos mecanismos de regulacin o control de la expresin
gnica fueron las bacterias, ya que los mtodos experimentales son relativamente simples y el aislamiento de
mutantes permite evaluar diferentes situaciones. A mediados del siglo pasado, Jacob y Monod realizaron los
primeros experimentos en este campo trabajando con Escherichia coli en el Instituto Pasteur. Estudiaron el sistema
que regula la expresin de genes necesarios para el metabolismo de la lactosa: un disacrido que puede ser
utilizado como fuente de carbono por las bacterias.
El sistema que regula el aprovechamiento de la lactosa como fuente de energa consta de numerosos elementos. El
primero de ellos consiste en un grupo de tres genes relacionados, llamados lacZ, lacY y lacA, que codifican
respectivamente las enzimas -galactosidasa, galactsido-permeasa y tiogalactsido-transacetilasa. La primera de
ellas hidroliza la lactosa (dando glucosa y galactosa), la segunda permite el ingreso de la lactosa a la clula y la
funcin de la tercera se desconoce. Para estos tres genes, llamados estructurales, existe un nico promotor dbil.
El producto de la transcripcin de los genes estructurales es un mRNA policistrnico. Este sistema tambin incluye
un gen de expresin constitutiva (10 copias/clula) llamado lacI, cuyo producto proteico se une a una regin del
DNA solapada con el promotor y el inicio del gen lacZ. La protena LacI unida al DNA reprime la transcripcin de los
genes estructurales al impedir la correcta unin de la RNApol. Jacob y Monod denominaron represor a la protena
LacI y operador a la regin del DNA a la que se une. Cada molcula del represor, que es tetramrico, posee un
sitio de unin para otra molcula denominada inductor (en la naturaleza, el inductor es un ismero de la lactosa). La
unin del inductor al represor produce un cambio alostrico que reduce drsticamente su afinidad por el DNA. Por
lo tanto, el complejo represor-inductor se desprende del operador dejndolo libre para la unin de la RNApol. El tipo
de control ejercido por un represor se
denomina control negativo.
Adems, existe un sistema de
regulacin adicional que incluye a la
protena llamada CRP o CAP. Esta
protena posee un sitio de unin a un
ligando (cAMP) y otro de unin al DNA.
Solamente cuando se forma el
complejo CRP-cAMP, ste se une a
una secuencia especfica aumentando
la afinidad del promotor por la RNApol
y favoreciendo la transcripcin de los
genes estructurales del operon lac.
Esto significa que CRP-cAMP ejerce un
control positivo y se denomina
activador.
Cuando hay transcripcin de los genes
estructurales se dice que existe
induccin del sistema. La induccin
ocurre cuando se presentan las
siguientes situaciones en forma
simultnea: a) el represor no acta
sobre el operador debido a la presencia
del inductor y b) el complejo CRP-
ligando se une a la secuencia
regulatoria especfica.
1
 Objetivo

Estudiar las condiciones de induccin del opern lactosa en Eschericha coli.

Tcnicas Experimentales

PARTE 1
Induccin del opern Lactosa de E.coli en medios de cultivo de distinta composicin

a) Cada grupo recibir un cultivo de una cepa competente de E. coli (cultivo de E.coli salvaje crecido
en Medio Mnimo M9, glicerol 2% por 2 hs)
b) Tomar 7 tubos eppendorf y rotularlos con nmero de tubo y nombre de grupo
c) Preparar los medios que se describen en el siguiente protocolo:

Tubo No 1 2 3 4 5 6 7
Cultivo 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -
Solucin fisiolgica 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,6 1,0
IPTG (40 mM) - 0,2 - - - - -
Lactosa (5%) - - 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Cloranfenicol(30 - - - - 0,02 - -
mg/ml)
Glucosa (10%) - - - - - 0,2 -

Todos los volmenes estn especificados en ml

d) Tapar los tubos, y mezclar por inversin 3 o 4 veces

e) Colocar los tubos en el bao de 37C durante 1 hora, agitando peridicamente
f) Tomar 0,3 ml de cada tubo y pasarlos a nuevos tubos eppendorf. El resto del cultivo reservarlo en
hielo, para posteriormente medir absorbancia a 600 nm
g) Agregar a todos los tubos 0,3 ml de buffer Z pH 7.
h) Agregar a todos los tubos, con excepcin del tubo 4, 25 l de SDS 0,1% y 50 l de Cl3CH
i) Agitar vigorosamente los tubos durante unos 10 segundos

Medida de la actividad -galactosidasa en los distintos cultivos

j) Agregar a todos los tubos 0.125 ml de ONPG (4 mg/ml en buffer Z) y agitar. TOMAR el tiempo. El
ONPG (orto-nitrofenilgalactosa) es hidrolizado por la enzima -galactosidasa, y uno de los
productos de hidrlisis, el orto-nitrofenol, es de color amarillo (ver reacciones en el anexo)
k) Incubar a temperatura ambiente hasta aparicin de una suave coloracin amarillenta. Registrar el
tiempo de reaccin (entre 20 a 30 minutos)
l) Detener la reaccin mediante el agregado de 0.25 ml de Na 2CO3 5%
m) Centrifugar durante 1 minuto.
n) Retirar 0.3 ml del sobrenadante con ayuda de una pipeta P1000 y transferirlo a un pocillo de una
policubeta
o) Leer la absorbancia a 420 nm.

Composicin del buffer Z

0.06 M Na2HPO4
0.04 M NaH2PO4
0.01 N KCI
0.001 M MgSO4
0.05 M -mercaptoetanol
2
PARTE 2
Produccin de -galactosidasa en E.coli a diferentes tiempos de induccin con lactosa

a) Cada grupo recibir un cultivo de una cepa competente de E. coli (cultivo de E.coli salvaje crecido
en Medio Mnimo M9, glicerol 2% por 2 hs)
b) Inocular con 2ml de cultivo 10 ml de Medio Mnimo M9, lactosa 2%. Tomar el tiempo desde este
agregado.
c) Coloca el cultivo en el bao de 37C, con agitacin
d) Cada 30 minutos tomar 1,2 ml de cultivo hasta completar las 2 hs de induccin (tome
exactamente el tiempo entre muestra y muestra!!!). Reservar los cultivos en hielo!.
e) Tomar 0.3 ml de cada tubo y pasarlos a nuevos tubos eppendorf. Con resto del cultivo medir
absorbancia a 600nm.
f) Agregar a todos los tubos 0,3 ml de buffer Z pH 7
g) Agregar a todos los tubos 25l de SDS 0.1 % y 50l de Cl 3CH
h) Agitar vigorosamente los tubos durante unos 10 segundos

Ensayo de actividad de -gal

i) Agregar a todos los tubos 0.125 ml de ONPG (4 mg/ml en buffer Z) y agitar. TOMAR el tiempo. El
ONPG (orto-nitrofenilgalactosa) es hidrolizado por la enzima -galactosidasa, y uno de los
productos de hidrlisis, el orto-nitrofenol, es de color amarillo.
j) Incubar a temperatura ambiente hasta aparicin de una suave coloracin amarillenta. Registrar el
tiempo de reaccin (entre 20 a 30 minutos)
k) Detener la reaccin mediante el agregado de 0.25 ml de Na 2CO3 5%
l) Centrifugar durente 1 minuto.
m) Retirar 0.3 ml del sobrenadante con ayuda de una pipeta P1000 y transferirlo a un pocillo de una
policubeta.
n) Leer la absorbancia a 420 nm.

Anlisis de resultados
En base a los resultados obtenidos calcular las Unidades Miller (UM) para cada condicin.
Para la parte 1 proponer una hiptesis para el funcionamiento del opern lactosa.
Para la parte 2 realizar una curva de UM vs. tiempo de induccin (minutos).

Unidades Miller
1000 OD 420
UM
t vol OD 600
t=tiempo de reaccin en minutos
v=volumen del cultivo usado en el ensayo en ml

Preguntas
1. Cules son las funciones del IPTG y del ONPG utilizados en la prctica?
2. Explique por qu los pre-cultivos se realizaron en un medio conteniendo glicerol y no glucosa.
3. En la medida de actividad -galactosidasa Ud. toma el tiempo hasta la aparicin de color y ah para la
reaccin Qu controles debera efectuar para asegurar que esta medida de actividad es vlida?
4. Para qu determina la absorbancia a 600nm de los cultivos inducidos en distintas condiciones?
5. Explique por qu hay un perodo lag antes del incremento en la actividad -galactosidasa en los
cultivos inducidos con lactosa.

3
6. Un cultivo de E. coli est creciendo en un medio de cultivo conteniendo glucosa y lactosa como
nicas fuentes de carbono. Cada cierto intervalo de tiempo se saca una alcuota del cultivo y se mide
actividad -galactosidasa. Cmo sera la curva de actividad vs tiempo?
7. Haga un esquema que represente TODOS los elementos importantes para el funcionamiento del
opern lac.
8. En el TP se estudi la regulacin del opern lac por medidas de actividad enzimtica. Los resultados
obtenidos son suficientes para demostrar un control transcripcional? Qu otras hiptesis podra
formular y cmo las evaluara?
9. Defina una unidad arbitraria diferente de la Miller de medida de actividad y exprese los resultados del
TP en esas unidades. Qu datos necesitara para expresar el resultado en unidades
internacionales?