Universi

dad de Guanajuato

Laboratorio de Ingeniera Gentica

CLAVE: BIO36441
Profesor: Dr. Juan Carlos Torres Guzmn
Alumna: Luz Adriana Prez Lpez

Prctica 6

Purificacin de la protena GFP

Fecha de Entrega: 25/Abril/2017

La purificacin de protenas recombinantes consiste en la obtencin de las

protenas que son sintetizadas por la bacteria, estas protenas son codificadas por
un gen que se insert en ella mediante la metodologa de transformacin gentica.
Ya que muchas de estas protenas no son liberadas al medio externo por las
bacterias, es necesario romper la pared celular de estas para extraerlas y
separarlas de otras protenas, para esto se utilizan enzimas como lisozimas,
mtodos de centrifugacin, sonicacin, y cromatografa.

En esta prctica se emple la tcnica de cromatografa de interaccin hidrofbica

y a continuacin encontrara el procedimiento para la realizacin del proceso de
purificacin de la protena recombinante GFP.

PROTOCOLO DE PURIFICACIN DE LA PROTEINA GFP

Seccin I: identificacin de las bacterias que contienen GFP
1. Escoger una colonia blanca de su placa LB / amp y una colonia verde
De su placa LB / amp / ara para su propagacin en cultivos lquidos
separados.
2. Se le proporcionarn dos tubos de caldo nutriente lquido en el que
colocar clulas Clonadas que se han transformado con el plsmido
pGLO.

Seccin II: Seleccin de colonias

1. Examine sus placas LB / amp y LB / amp / ara del laboratorio de
transformacin.
2. Identifique varias colonias verdes que no estn tocando otras
colonias en el plato LB / amp / ara. Tambin en el plato LB / amp.
3. Obtenga dos tubos de cultivo de 15 mililitros que contengan 2
mililitros de medio de crecimiento nutritivo Y etiquete un tubo "+" y
un tubo "-". Inserte las colonias en cada uno de los tubos.
4. Cubra sus tubos y colquelos en el agitador o en la incubadora. Deje
que los tubos incuban 24 horas a 32 C o durante 2 das a
temperatura ambiente.

Seccin III: Purificacin

1. Usando un marcador, marque un microtubo nuevo con su nombre y
perodo.
2. Retire sus dos cultivos lquidos de la incubadora y observarlos en la
iluminacin normal de la habitacin y luego con la luz UV. Usando una
pipeta limpia, transfiera todo el contenido del cultivo lquido (+) en el
microtubo de 2 mililitros tambin etiquetado (+), luego cbralo.
Deseche su cultivo (-).
3. Gire el microtubo (+) durante 5 minutos en la centrifuga a mxima
velocidad.
4. Despus de centrifugar el cultivo lquido bacteriano, abra el tubo y
vierta el sobrenadante y deje solamente la pastilla bacteriana.
 5. Observe el grnulo bajo luz UV. Tenga en cuenta sus observaciones.
6. Con una pipeta nueva, aada 250 l de solucin TE a cada tubo.
Resuspenda la pastilla.
7. Usando una pipeta enjuagada, aada 1 gota de lisozima al sedimento
bacteriano resuspendido. Cubra y mezcle. Coloque el tubo en el
congelador hasta el prximo perodo de laboratorio. La congelacin
har que la bacteria explote y se rompa completamente.

Seccin IV: Lisis bacteriana

8. Retire su microtubo del congelador y descongelelo con el calor de la
mano. Coloque el tubo en la centrfuga durante 10 minutos a
velocidad mxima. Etiquete un microtubo nuevo con las iniciales de
su equipo.
9. Mientras espera la centrifugadora, prepare la columna de
cromatografa. Antes de realizar la cromatografa, agite
vigorosamente la columna para resuspender las perlas. A
continuacin, agite la columna hacia abajo una ltima vez. Retire la
tapa superior y quite la parte inferior de la pestaa de la columna de
cromatografa. Deje que todo el tampn lquido se vace desde la
columna (esto llevar ~ 3-5 minutos).
10. Prepare la columna aadiendo 2 mililitros de buffer de equilibrio a la
parte superior de la columna, 1 mililitro a la vez utilizando una pipeta
bien enjuagada. Escurra el buffer de la columna hasta que alcance la
marca de 1 mililitro que est justo por encima de la parte superior del
lecho de la columna blanca. Tape la parte superior e inferior de la
columna y guarde la columna a temperatura ambiente hasta el
siguiente perodo de laboratorio.
11. Despus de la centrifugacin de 10 minutos, retire inmediatamente el
microtubo de la centrfuga. Usando una pipeta nueva, transfiera 250 l
del sobrenadante en el nuevo microtubo.
12. Usando la pipeta bien enjuagada, transfiera 250 l de Buffer de Unin
al microtubo que contiene el sobrenadante. Coloque el tubo en el
refrigerador hasta el prximo perodo de laboratorio.

Seccin V: Cromatografa
13. Obtenga 3 tubos de recoleccin y etiquetelos 1, 2 y 3. Coloque los
tubos en un estante. Retire la tapa de la parte superior e inferior de la
columna y deje que drene completamente en un tubo de ensayo
adicional. Cuando el ltimo de los buffers haya alcanzado la
superficie del lecho de la columna HIC, coloque suavemente la
columna en el tubo de recoleccin 1.
14. Con una pipeta nueva, cargue cuidadosamente 250 l del
 sobrenadante (buffer de lavado) en la parte superior de la columna,
dejando que el sobrenadante gotee por el lado de la pared de la
columna. Deje que el volumen entero del sobrenadante fluya en el
tubo 1.
15. Transfiera la columna al tubo 3. Con la pipeta enjuagada, aada 750 l
del Buffer de elucin y deje que todo el volumen fluya hacia la
columna.
16. Examine todos los tubos de recoleccin usando la lmpara UV y
observe cualquier diferencia de color entre los tubos. Envuelva los
tubos y colquelos en el refrigerador hasta el prximo perodo de
laboratorio.

MODIFICACIONES DEL PROTOCOLO DE PURIFICACIN DE LA PROTEINA

GFP

1. En lugar de tener solo GFP se nos proporcion otra protena la cul fue
Tangerine. Escogiendo a esta ltima para continuar con el proceso de
purificacin, debido a que esta se lis mejor.

RESULTADOS

Una vez que se obtuvieron las clulas previamente transformadas con el plsmido
p GLO en la prctica de transformacin bacteriana. Estas colonias se resembraron
en un medio LB/amp/arabinosa para analizar si haban sido completamente
transformadas. Ya que el gen GFP se expresa solo en presencia de arabinosa.
Dicho esto lo sometimos a luz UV para ver si se observaba fluorescencia gracias a
este gen y as ya tener las clulas de donde se obtendra la protena GFP y
purificarla por medio de la cromatografa de interaccin hidrofbica. Lo que se
obtuvo fue lo siguiente:
 Fig 1. Medio LB/amp/ara con
clulas transformadas que no
mostraron fluorescencia

Por esa razn se nos proporcionaron dos tubos uno que contena p GLO y otro
con tangerine para continuar con la purificacin. Estos se extrajeron de un medio
que contena a las clulas tranformadas y que presentaban distintas protenas que
les confera fluorescencia.

Fig. 2 Placa de clulas

tranformadas, que
expresan diferentes
protenas.

Se seleccion a Tangerine para extraer la protena debido a que en el proceso de

lisis bacteriana durante el procedimiento, este se lis mejor y esto se pudo
observar al colocar los tubos en la cmara de luz UV, siendo Tangerine el que
mostraba mayor fluorescencia.
 p GLO Tangerin
e

Una vez que concluy la recoleccin de las fracciones en la cromatografa se

llevaron los tres tubos que las contenan al laboratorio, para observarlas bajo la luz
UV. Sin embargo como la intensidad de la fluorescencia era muy baja, los tubos se
dejaron en refrigeracin.

Numero de Tubo Prediccin Observacin debajo de

la luz UV
TUBO 1 Se observara mayor Apenas se notaba la
Buffer de Unin cantidad de fluorescencia fluorescencia.
por ser el primer buffer.
TUBO 2 Poca fluorescencia Mayor fluorescencia
Buffer de Lavado
TUBO 3 Poca fluorescencia Poca fluorescencia
Buffer de elucin

ANALISIS DE RESULTADOS

El contenido de los tubos en donde se recolectaron las fracciones de la protena

mediante la cromatografa que fluorecen en el transiluminador de luz UV
corresponden a muestras donde la protena Tangerine se encuentra presente, ya
sea en la bacteria, junto a otras protenas o pura. Esta protena fue purificada
(separada del resto de contenido de la bacteria) mediante la tcnica de
Cromatografa de interaccin hidrofbica.
Cuestionario I

1. Protenas.
a. Qu es una protena?

Son biomolculas formadas por cadenas lineales de aminocidos.

b. Enumere tres ejemplos de protenas que se encuentran en su cuerpo.

Glucoprotenas
Histonas
Inmunoglobulinas
Enzimas digestivas

Explicar la relacin entre genes y protenas.

Los genes no participan directamente en la sntesis de protenas, se requiere de

un proceso de transcripcin por medio del cual a partir de ADN (molde) se
sintetizan molculas de mRNA que contienen secuencias de bases (codones) que
sern traducidas en protenas.

2. Usando sus propias palabras, describa la clonacin

Es la utilizacin de tcnicas moleculares para la creacin de copias idnticas de

un organismo.

3. Describa cmo las clulas bacterianas clonadas en su placa LB / amp

difieren de las clulas en su placa LB / amp / ara. Se puede disear un
experimento para demostrar que ambas placas de clonado las clulas se
comportan de manera similar y contienen el mismo ADN?

Son las mismas clulas, ya que si crecieron en ampicilina, pueden crecer en

ampicilina con arabinosa gracias a que tienen en su genoma el plsmido que
contiene los genes necesarios para que estas clulas tengan resistencia al
antibitico o que tengan la capacidad de fluorescencia en presencia de la
arabinosa. Si, contienen el mismo ADN

4. Describa cmo podra recuperar la protena que cura el cncer de las

clulas bacterianas.

Mediante una cromatografa de interaccin hidrofbica.

Cuestionario II

1. Qu es una colonia bacteriana?

Es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una Unidad

Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido.

2. Por qu eligi una colonia verde y una colonia blanca de su (s) placa (s)
de agar? Por qu Crees que elegiste uno de cada color? Qu podra
probar esto?

Se eligieron ambas, para comprobar que una estaba tranformada y la otra no. Ya
que naturalmente las colonias de E.coli no presentan un color verde.

3. Cmo son tiles estos elementos en este experimento de clonacin?

a. Luz ultravioleta (UV): Se hace visible debido al fenmeno denominado

fluorescencia.

b. Incubadora: Para favorecer el crecimiento de las bacterias, ya sea acelerndolo

o disminuyndolo.

c. Agitacin de la incubadora: Una incubadora de agitacin proporciona una

temperatura caliente y proporciona una aireacin que oxigena los cultivos
bacterianos. Aumento de oxigeno acelera la tasa de crecimiento de bacterias.

4. Explique cmo la colocacin de clulas clonadas en caldo nutritivo para

multiplicarse se relaciona con su objetivo general de purificacin de la protena
fluorescente.

Gracias a que al colocar las clulas clonadas en un caldo nutritivo, estamos

favoreciendo su crecimiento, y de esta manera que las bacterias se reproduzcan
rpidamente, lograremos que las clulas nuevas tambin contengan esta
informacin, y as que exista una mayor cantidad de clulas con el gen que
produzca la protena.

Cuestionario III

1. Ha utilizado una bacteria para propagar un gen que produce una protena
fluorescente verde. Identifique la funcin de estos elementos que necesit en la
seccin 3.
A. Centrfuga: Tiene el objetivo de separar los componentes que constituyen una
sustancia. Funciones para sedimentar las bacterias y separar las bacterias de el
medio de crecimiento.

B. Lisozima: La lisozima es una enzima que rompe las paredes celulares de las
bacterias, lo hace hidrolizando enlaces glucosdicos (14) de cido N-
acetilmurnico (NAM) a N-acetilglucosamina (NAG) en un polisacrido alternante
de NAM-NAG.

C. Congelador: Su funcin consiste en mantener, en un ambiente controlado

(espacio refrigerado) diversos fluidos y sustancias, para que los mismos se
conserven en buenas condiciones (mientras ms baja sea la temperatura, menor
actividad qumica y biolgica). Funciona para congelar las bacterias que hacen
que el citoplasma se expanda, lo cual rompe completamente la pared celular
debilitada.

2. Puede explicar por qu los cultivos lquidos fluorescen en verde?

Esto es debido a que los microorganismos se encuentran vivos, en constante

reproduccin y por esto siguen produciendo la protena GFP.

3. Por qu descart el sobrenadante en esta parte del procedimiento de

purificacin de protenas?

El sobrenadante contiene el medio de crecimiento bacteriano y no contiene el GFP

deseado.

4. Puede explicar por qu la membrana externa de las clulas bacterianas se

rompe cuando las clulas se congelan. Qu sucede con un refresco sin abrir
cuando se congela?

La presin interna del protoplasto est determinada osmticamente. Se debe tener

en cuenta que la membrana citoplasmtica es la verdadera barrera osmtica (es
semipermeable y controla la entrada y salida de sustancias a la clula). Sin
embargo al tener una presin mayo la clula tratara de regular esto a tal grado de
no poder equilibrarla por lo que explotara.

5. Cul fue el propsito de romper o lisar las bacterias?

Su objetivo es separar y purificar GFP de estas otras protenas bacterianas

contaminantes. Las protenas son largas cadenas de aminocidos, algunos de los
cuales son muy hidrfobos o "odian el agua". La GFP tiene muchos parches de
aminocidos hidrfobos, que colectivamente hacen que la protena entera sea
hidrfoba. Adems, la GFP es mucho ms hidrfoba que la mayora de las otras
protenas bacterianas. Podemos aprovechar las propiedades hidrfobas de la GFP
para purificarla de otras protenas bacterianas menos hidrfobas

Cuestionario IV

1. De qu color era el grnulo en este paso del experimento? De qu color

era el sobrenadante? Qu te dice esto?

El granulo era de color blanco amarillentoso. Esto nos dice que adems de
protenas solubles en el sobrenadante se encontraban otro tipo de componentes
celulares. El color verde fluorescente del sobrenadante indica que la protena
verde se liber de la bacteria y se mantuvo en el sobrenadante el color mucho
ms claro de la pastilla bacteriana sugiere que la GFP fue liberado de la bacteria
despus de la lisis.

2. Por qu descart el grnulo en esta parte del procedimiento de

purificacin de protenas?

El grnulo contiene partculas bacterianas no deseadas, paredes de clulas

bacterianas, membranas, y ADN cromosmico. El grnulo contiene poca, si es que
existe, GFP y puede ser descartado.

3. Describa brevemente la cromatografa de interaccin hidrofbica e

identifique su propsito en este laboratorio.

Separa las protenas en base a su hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por

la adsorcin de las biomolculas a la superficie dbilmente hidrofbica de la resina
en una solucin fuertemente salina y su posterior elucin mediante un gradiente
salino negativo.

Cuestionario V

1. Enumere sus predicciones y observaciones para la muestra y lo que sucede

con la muestra cuando se agregan los siguientes buffers a la columna HIC.
Numero de Tubo Prediccin Observacin debajo de
la luz UV
TUBO 1 Se observara mayor Apenas se notaba la
Buffer de Unin cantidad de fluorescencia fluorescencia.
por ser el primer buffer.
TUBO 2 Poca fluorescencia Mayor fluorescencia
Buffer de Lavado
TUBO 3 Poca fluorescencia Poca fluorescencia
Buffer de elucin

2. Usando la tabla de datos anterior, compare cmo sus predicciones coincidieron

con sus observaciones para cada bfer.

A. Buffer de unin: No coincidieron

B. Buffer de lavado: No Coincidieron

C. Buffer de elucin: Coincidieron

3. Sobre la base de sus resultados, explique los roles o funciones de estos

bferes. Sugerencia: cmo se relaciona el nombre del bfer con su funcin?

A. Buffer de equilibrio: Este buffer prepara la columna para la aplicacin de GFP.

El tampn de equilibrio eleva la concentracin de sal de la columna y coincide con
el del lisado bacteriano GFP.

B. Buffer de Unin: Este buffer eleva la concentracin de sal de GFP que produce
un cambio conformacional en las buenas prcticas agrarias, exponiendo las
regiones hidrofbicas.

C. Buffer de lavado: Las funciones del buffer de lavado para lavar menos protenas
hidrfobos de la columna.

D. TE (Buffer de elucin): Este buffer funciona para quitar GFP de la columna.

4. Cules buffers tienen el mayor contenido de sal y cules menos? Cmo

puedes saberlo?

Buffer de unin >> Buffer de equilibrio >> Buffer de lavado >> Buffer de elucin

El Buffer de unin tiene la mayor concentracin de sal porque es necesaria la

concentracin de sal del lisado de GFP. Los parches hidrfobos de protenas son
expuestos en el buffer de alta sal. El buffer de elucin de TE tiene la
concentracin de sal ms baja ya que hace que GFP eluya desde la columna. Los
parches hidrfobos de las protenas se vuelven a orientar hacia el interior y las
regiones hidroflicas se exponen al Buffer de sal.

5. Tuvo xito en aislar y purificar GFP de las clulas bacterianas clonadas?

Identifique las pruebas que tiene para apoyar su respuesta.

Si, sin embargo como no se observaba gran fluorescencia en los tubos en donde
se recolectaron las fracciones de la columna y por esta razn se dejaron
congeladas.

CONCLUSIN

Gracias a la Cromatografa de interaccin hidrofbica es que se pudieron

recuperar la protena que la bacteria no pudo liberar al medio externo. Tangerine
tiene muchos parches de aminocidos hidrfobos, que en conjunto hacen que la
protena entera sea hidrfoba. Por lo que se pudieron aprovechar las propiedades
hidrfobas de esta protena para purificarla de otras protenas bacterianas menos
hidrfobas. Este mtodo poderoso para separar protenas y otras molculas en
mezclas complejas y que se usa comnmente en biotecnologa para purificar
protenas genticamente modificadas nos permiti obtener tangerine, sin embargo
la fluorescencia no fue tan intensa.