Exopolisacridos de bacterias lcticas, me quieren o no me quieren?

Rosa Aznar1, M. Teresa Dueas2, Rufino Jimnez3, Paloma Lpez4 y Patricia Ruas-Madiedo5

1
, Departamento de Biotecnologa de los Alimentos, Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA)
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC). Avda. Agustn Escardino 7, 46980 Paterna, Valencia
/Departamento de Microbiologa, Universidad de Valencia, Avda. Dr. Moliner 50, 46100 Burjassot, Valencia
(rosa.aznar@uv.es)
2
, Departamento de Qumica Aplicada, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad del Pas Vasco (UPV/EHU).
Paseo Manuel de Lardizabal 3, 20018 San Sebastin (mariateresa.duenas@ehu.es)
3
, Departamento de Biotecnologa de Alimentos, Instituto de la Grasa (IG)-CSIC. Avda. Padre Garca Tejero 4,
41012 Sevilla (rjimenez@cica.es)
4
, Departamento de Estructura y Funcin de Protenas, Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB)-CSIC. Ramiro
de Maeztu 9, 28040 Madrid (plg@cib.csic.es)
5
, Departamento de Microbiologa y Bioqumica de Productos Lcteos, Instituto de Productos Lcteos de Asturias
(IPLA)-CSIC. Carretera de Infiesto s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias (ruas-madiedo@ipla.csic.es)

Qu son los exopolisacridos de bacterias lcticas?

Las bacterias lcticas y las bifidobacterias se incluyen dentro de las bacterias Gram-
positivas las cuales, tras aplicar el mtodo de tincin diferencial desarrollado a finales del
XIX por Christian Gram, mantienen el colorante primario (azul) y se distinguen de las Gram-
negativas que pierden el color primario y se tien con el colorante secundario (rojo) debido a
la diferente composicin y organizacin estructural de su superficie (Figura 1).

BacteriaGrampositiva BacteriaGramnegativa

EPS
EPS
ME
PC PC

MC MC

Figura 1: Representacin esquemtica de la superficie de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

MC: membrana celular, PC: pared celular, ME: membrana externa, EPS: exopolisacridos.

Fotografas de microscopio electrnico de trasmisin muestran que externamente a la

membrana celular, las bacterias Gram-positivas presentan una nica capa de grosor
variable (10 a 80 nm; 1 nm = 0,000001 mm) de pared celular compuesta por peptidoglicano
(un polmero de carbohidratos unidos mediante cadenas de pptidos) de la cual pueden
sobresalir otras estructuras (por ejemplo, polisacridos tipo cidos teicoicos o protenas tipo
pili). Sin embargo en las Gram-negativas se distinguen dos capas finas, una de ellas es
una delgada capa de peptidoglicano y rodendola se localiza la membrana externa de la que
sobresaldran tambin otros tipos de estructuras. Adems, ambos tipos de superficies
bacterianas pueden estar rodeadas de otra capa ms externa constituida por polmeros de
monosacridos; son los polisacridos exocelulares o exopolisacridos (EPS).

 Los EPS bacterianos pueden estar organizados estructuralmente de forma

compacta, formando una cpsula que presenta uniones muy fuertes a otros componentes de
la superficie celular y permanece unida a la misma. Generalmente estas cpsulas
polisacardicas (CPS) se detectan como zonas claras que rodean a la bacteria cuando sta
se visualiza al microscopio ptico mediante tincin negativa (tinta China, por ejemplo). Sin
embargo, otros tipos de EPS no tienen una organizacin tan compacta y se mantienen
unidos de forma dbil a la superficie celular o son liberados al medio extracelular formando
una matriz de EPS, la cual es de grosor ms o menos variable segn la solubilidad en el
agua del polmero que la compone (Figura 2). Atendiendo a su composicin qumica
y a su modo de sntesis, los EPS de
bacterias lcticas se dividen en
homopolisacridos (HoPS) los cuales
B estn compuestos por un nico tipo
de monosacrido y hay un nico

EPS
enzima implicado en su sntesis, y los
heteropolisacridos (HePS) que estn
constituidos por dos o ms tipos de
monosacridos, que pueden llevar
unidos otras molculas, y en su
sntesis y polimerizacin estn

Figura 2: Cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis implicados varios enzimas. Estos
(B) rodeada de una matriz de EPS visualizada mediante
microscopia electrnica de barrido cryo-SEM. Barra 2 m. estn codificados por genes que se
encuentran agrupados en el genoma.
Segn el tipo de monosacrido presente, los HoPS se subdividen en fructanos (compuestos
por fructosa) y glucanos (compuestos por glucosa). Segn el tipo de enlace ( o ) y la
posicin que ocupa el carbono del enlace principal, existe una gran variedad de polmeros
que reciben distintos nombres y son producidos por distintos miembros de las bacterias
lcticas (Tabla 1) aunque, hasta el momento, no se ha descrito ninguna bifidobacteria
productora de HoPS. Los enzimas implicados en la sntesis de -fructanos y de -glucanos
son miembros de la familia de las glicosil-hidrolasas (GH), especficamente fructansacarasas
(familia GH68) y glucansacarasas (familia GH70, segn la clasificacin de la web CAZY
Carbohydrate-Active Enzymes: http://www.cazy.org). Utilizando el disacrido sacarosa [-
D-glucopiranosil-(12)--D-fructofuransido] como sustrato estos enzimas transfieren una
glucosa o una fructosa a un -glucano o un -fructano en formacin, respectivamente. Estos
enzimas llevan a cabo la polimerizacin de los HoPS en el exterior de la bacteria productora.
En el caso de los -glucanos, la sntesis del polmero es llevada a cabo por otro tipo de

enzima denominado glicosiltransferasa (GTF) mediante un mecanismo que an no ha sido

completamente elucidado.

Tabla 1. Tipos ms frecuentes de homopolisacridos producidos por bacterias lcticas.

HoPS Enlacepredominante(50%) Ejemplosdeespeciesproductoras

glucano
Dextrano DGlucp(16) Lactobacillusreuteri
Lactobacillussakei
Lactobacillusfermentum
Lactobacillusparabuchneri
Lactobacillusplantarum
Leuconostocmesenteroides
Streptococcusmutans
Streptococcussalivarius
Mutano DGlucp(13) Lactobacillusreuteri
Streptococcusmutans
Streptococcusdownei
Streptococcussobrinus
Aternano DGlucp(16)/DGlucp(13) Leuconostocmesenteroides
Reuterano DGlucp(14) Lactobacillusreuteri
glucano
3)[DGlcp(12)]DGlcp(1 Lactobacillusdiolivorans
Pediococcusparvulus
Oenococcusoeni
Propionibacteriumfreudenreichii

fructano:
Levano DFrup(26) Lactobacillusreuteri
Lactobacillussanfranciscensis
Streptococcussobrinus
Streptococcussalivarius
TipoInulina DFrup(21) Lactobacillusreuteri
Leuconostoccitreum
Streptococcusmutans

En el caso de los HePS, los monosacridos que se encuentran de forma ms

habitual, tanto en bacterias lcticas como en miembros del gnero Bifidobacterium, son
glucosa, galactosa y ramnosa. Tambin se detectan con cierta frecuencia monosacridos N-
acetilados (N-acetil-glucosamina y N-acetil-galactosamina) y, de forma poco abundante,
fucosa y manosa. Estos azcares pueden a su vez estar modificados por otros componentes
orgnicos o inorgnicos (acetilo, glicerol, fosfato, etc). Cada HePS est constituido por
unidades repetitivas formadas por distintas combinaciones de los componentes descritos
anteriormente. En general, estas unidades repetidas se caracterizan por tener una
estructura monosacardica central de la que pueden salir cadenas laterales, presentndose
mltiples combinaciones (en funcin del tipo de enlace y posicin del carbono, as como de

la posiccin que ocu

upa el carbono del enlace de la cadena
c laterral). Por ello
o, hasta la fecha
f se
han desscrito nume
erosas unid
dades repettidas compu
uestas desd
de 2 a 8 m
monosacrid
dos y se
estn describiendo
o continuam
mente nueva
as estructuras. A mod
do de ejemp
plo ilustrativ
vo, en la
Figura 3 se muesstra la unidad repetid
da de uno de los EPS (de altto peso mo
olecular,
madamente 1x106Da) sintetizado
aproxim s por la cep
pa Bifidobaccterium aniimalis subp
ps. lactis
IPLA-R1 [Leivers S., Hidalgo-Canntabrana C., Robinson
R G., Margolles A., Ruas-Madied
do P. y Laws A. (2011)

0-17].
ydrate Researrch, 346, 2710
Carbohy

Figura 3:: Estructura deel HePS sintettizado por Biffidobacterium animalis subssp. lactis IPLA
A-R1.
G galactosa; Glc, glucosa;; Rha, ramnossa; p, anillo pirranosa; f, anillo furanosa
Gal,

E inters de la investig
El gacin y ca
aracterizaci
n de los n
meros EPS
S descritos hasta la
actualid
dad en las bacterias lcticas se debe a su
u relacin con
c la mod
dificacin, bien
b sea
positiva
a o negativa
a, de las propiedades
p s sensoriales (principa
almente visscosidad, te
extura y
estructu
ura) de loss alimentoss fermenta
ados en lo
os que se encuentra
an estas bacterias
b
producttoras de EP
PS. Ms reccientemente
e, se ha sus
scitado un renovado
r in
nters en ell estudio
de esto
os biopolmeros puesto que se les atribuye
en posibles efectos be
eneficiosos para la
salud. Por
P ello se ha
h ampliado
o el mbito de bsque
eda de cepa
as producto
oras de EPS
S a otros
ecosiste
emas, distin
ntos de loss alimentos, como el tracto
t gastrrointestinal (TGI) de animales
a
(incluido
o el human
no). Y, en parte,
p sta es la razn
n por la qu
ue se estn
n estudiando cepas
producttoras de EP
PS en bifido
obacterias, las
l cuales no
n se encue
entran de fo
orma natura
al en los
alimento
os pero s en
e el TGI animal.
a El grupo de in
nvestigacin
n del IPLA que pertenece a la
RedBAL acterizando las propiedades func
L est cara cionales de lactobacilo
os y princip
palmente
dobacterias aislados del TGI, ta
de bifid anto por su
s posible aplicacin tecnolgica en la
elaboracin de pro
oductos lctteos como por su capa
acidad para
a conferir efectos bene
eficiosos
para la salud. Aun
nque, hasta el momentto, las evide
encias cien
ntficas de lo
os EPS en relacin
directa con la salud
d son escassas y la ma
ayora de elllas han sido
o obtenidass mediante estudios
in vitro, es un cam
mpo de estu
udio muy acctivo y con proyeccin futura. Estos polmero
os estn
n presente
tambin es en la superficie de cepas
s denomin
nadas prob
biticas qu
ue son
microorrganismos vivos
v que cuando
c se administran
n en cantida
ades adecu
uadas confi
fieren un
beneficiio a la salu
ud del hosp
pedador (d
definicin de
d la FAO/W
WHO, 2001
1, consensu
uada en
castella
ano por la Sociedad
S Esspaola de Probiticos
s y Prebiticcos http://w
www.sepyp..es). Por

tanto, los EPS podran estar relacionados con la capacidad de algunos probiticos para
interaccionar con nuestro organismo una vez que estas bacterias incluidas en los
denominados alimentos funcionales son ingeridas en la dosis adecuada. Aunque uno de
los principales retos que an queda por resolver en este campo de la investigacin es
responder a la pregunta: las bacterias probiticas, bien las ingeridas o las residentes
habituales del TGI, son capaces de producir EPS in vivo en este complejo nicho ecolgico?

EPSme quieren en productos lcteos fermentados

Las cepas de bacterias lcticas productoras de EPS (tipo HePS) se han aislado de
numerosos productos lcteos fermentados naturales y aquellas capaces de conferir
propiedades sensoriales (viscosidad y textura, Figura 4) adecuadas, se han seleccionado
para su uso como cultivos funcionales en la industria lctea para la elaboracin de leches
fermentadas, como el yogurt, kfir y ciertas leches fermentadas escandinavas (viili, lngfil).

EPS- EPS+ EPS- EPS+ EPS+ (ropy)

(a) (b) (c)

Figura 4: Producto lcteo fermentado con cepas de Streptococcus thermophilus productoras de EPS (EPS+)
y no productoras (EPS). La viscosidad aparente (a) de la cepa EPS+ es mayor que la cepa no productora y la
leche fermentada con la cepa EPS+ fluye de forma continuada a travs de un embudo Posthumus. La textura
(b) producida por la cepa EPS+ es lisa y homognea, en contraposicin de la de la cepa EPS- que es
granulosa y grumosa. Las cepas productoras de EPS con fenotipo ropy o pegajoso (c), el cual se detecta
por la formacin de un largo filamento cuando se introduce una punta en la leche fermentada, son las que
confieren mejores propiedades sensoriales a las leches fermentadas ya que el EPS producido in situ durante
la fermentacin actuara como espesante y viscosificante natural.

En los ltimos aos se est estudiando, y aplicando de forma eficaz, el uso de cepas
productoras de HePS en la elaboracin de queso con bajo contenido graso. De esta forma el
EPS producido in situ, durante la etapa de coagulacin y posteriormente durante
maduracin del queso, acta como un espesante natural y un sustituto eficaz de la grasa,
consiguindose un queso bajo en caloras con una textura y consistencia adecuadas. Por
otro lado, se incrementa el rendimiento de produccin dada la capacidad de alguno de estos
EPS para retener agua. Sin embargo, la aplicacin de estos polmeros purificados a partir de
la bacteria productora como aditivo alimentario es poco factible dado su bajo rendimiento de
produccin, incluso en los medios ptimos de crecimiento. El rendimiento de produccin de
5

los EPS vara segn la cepa de bacteria lctica que los sintetiza; en general el rendimiento
de HePS oscila entre 24 y 600 mg/L y nicamente en algunos casos excepcionales de HoPS
(tipo dextrano o fructano) el rendimiento de produccin de cepas especficas puede llegar a
los 10 g/L, como el caso de Lactobacillus reuteri LB121. Otra excepcin es el kefirn, el EPS
presente en el kfir, el cual se podra aislar en cantidades apreciables de este producto
lcteo. Pero, generalizando, el rendimiento de produccin de EPS de bacterias lcticas es
bajo si se compara con el de otros polmeros de origen bacteriano que se emplean
habitualmente como espesantes alimentarios (mayor de 20 g/L), por ejemplo el gellano o el
xantano producido por las bacterias Gram-negativas Sphingomonas paucimobilis y
Xanthomonas campestris, respectivamente. En el caso de los EPS sintetizados por
bifidobacterias los escasos datos existentes indican que su produccin es an menor que la
de las bacterias lcticas. Esto puede ser debido a que la posible funcin de estos polmeros
en los ecosistemas naturales en los que se encuentran las bacterias productoras (alimentos
o TGI) es diferente. Finalmente, es necesario destacar que no todos los EPS producidos
por bacterias lcticas son capaces de incrementar la viscosidad o de mejorar la textura y
estructura de los productos lcteos fermentados en los que se encuentran. Esta capacidad
depende de las caractersticas fsico-qumicas del EPS (composicin qumica, estructura y
tamao) las cuales a su vez determinan el comportamiento de estos polmeros en solucin
acuosa (en el caso que nos ocupa, la leche tiene de media un 85% de agua) y su capacidad
para interaccionar con otros componentes de la leche (principalmente la casena, que es la
protena lctea). En este sentido, las cepas con fenotipo ropy, que podramos traducir por
filamentoso, son tecnolgicamente las ms interesantes puesto que pueden conferir unas
propiedades reolgicas (viscosidad) y de textura muy deseables en la leche fermentada que
se traduce en una sensacin muy agradable en el paladar y, adems, no confieren ningn
aroma ni sabor indeseable al producto fermentado. Un ejercicio interesante cuando
compramos en el supermercado leches fermentadas, por ejemplo yogurt, con 0% de materia
grasa es leer su composicin y comprobar si llevan o no espesantes. En este ltimo caso, si
no hay espesantes y la textura del producto es lisa, sin grumos, ligeramente viscosa, con
poca sinresis (o separacin del suero lcteo) probablemente lleve en su formulacin
fermentos lcticos productores de EPS.

EPSNo me quieren en bebidas alcohlicas fermentadas y en productos

crnicos elaborados
Los EPS que producen las BAL son beneficiosos en algunos alimentos, como las
leches fermentadas segn se indic en el apartado anterior. Sin embargo, en otros
alimentos tienen efectos negativos y su presencia representa una alteracin del producto

invalidando su utilizacin comercial. Esta alteracin se manifiesta como un aumento de

viscosidad en alimentos lquidos como la leche, zumos de frutas y bebidas como la sidra o la
cerveza. En productos crnicos procesados ready to eat (RTE), como el jamn york, las
salchichas tipo Frankfurt o el chopped, se reconoce por la presencia de una especie de
hilillos blancos o limos en la superficie de los mismos. Adems, la aparicin de estos
limos constituye uno de los primeros indicadores de alteracin en los productos crnicos
envasados al vaco y refrigerados. Las especies de BAL que con mayor frecuencia se han
aislado de productos con este tipo de alteracin pertenecen al grupo de lactobacilos
homofermentativos, o son miembros del gnero Leuconostoc. La carne constituye un
excelente medio de cultivo para los microorganismos y de hecho las BAL se encuentran en
la mayora de las carnes y productos crnicos, tanto frescos como curados, en nmeros
pequeos [10 unidades formadoras de colonia (ufc)/g]. En el caso de los productos
envasados al vaco, o en atmsferas modificadas, y refrigerados, durante el almacenamiento
tienen lugar cambios en la composicin de la fase gaseosa. En consecuencia, las
poblaciones bacterianas cambian seleccionndose aquellas especies de crecimiento lento
que toleran el CO2, principalmente representadas por BAL que crecen a temperaturas de
refrigeracin como algunos leuconostocs (Leuconostoc mesenteroides) y lactobacilos
(Lactobacillus curvatus / Lactobacillus sakei). El crecimiento limitado de estas bacterias no
siempre implica el deterioro en la calidad de la carne. Pero pueden llegar a alcanzar niveles
de 108 ufc/g y desencadenar alteraciones como sabores cidos, malos olores, cambios de
color, formacin de gas, cada del pH y produccin de limos (EPS). No obstante, la
capacidad de producir EPS depende de cepa y de los sustratos (nutrientes) que encuentra
disponibles para su crecimiento.
Las BAL tambin estn presentes en la elaboracin de sidra y vino, y al utilizar
diferentes compuestos de los mostos (azcares, cidos, compuestos nitrogenados) mejoran
las caractersticas organolpticas (sensoriales) de la bebida. De hecho las BAL llevan a
cabo una de las ms importantes transformaciones que ocurren durante la vinificacin del
vino tinto y en la elaboracin de sidra natural, la denominada fermentacin malolctica, que
consiste en la transformacin del cido L-mlico en un cido ms dbil como es el cido L-
lctico, disminuyendo la acidez de los mostos. Sin embargo, el desarrollo incontrolado de
estas BAL puede tener consecuencias negativas debido a su capacidad para ocasionar
diversas alteraciones que disminuyen la calidad de la bebida, tales como la acetificacin y el
ahilado. El ahilado o tambin denominado aceitado es ocasionado por ciertas cepas de
bacterias lcticas que sintetizan EPS, que al ser excretados al medio extracelular aumentan
la consistencia (viscosidad) de la bebida. Las bebidas ahiladas son rechazadas por el
consumidor ya que al ser transvasadas presentan un aspecto aceitoso o filante. En la
actualidad, esta alteracin ocurre ocasionalmente en vinificacin, y con mayor frecuencia en

 oracin de sidra natu

la elabo ural ya que
e en este ltimo
o, en general, no se realizan
caso
tratamie
entos de esstabilizacin
n microbiol
gica. La alteracin pu
uede ocurrir cuando la
a bebida
est tod
dava en lo
os tanques de fermen
ntacin, y se
s puede re
educir la viscosidad mediante
m
tratamie
entos de ag
gitacin mecnica. Sin
n embargo, en la mayo
ora de los casos la allteracin
se dessarrolla en botella, hacindose
h e evidente despus de seman
nas o meses del
embotellado. La especie de
e BAL que
e ms frecuentemente produce
e la altera
acin en
vinificaccin es Pe
ediococcus parvulus, si bien tambin se
e han encontrado ce
epas de
Oenoco
occus oeni productoras de EPS. En la sidra natural vasca se han aislado cepas
pertene
ecientes a estas esspecies, y adems diversas especies de Lacto
obacillus
(Lactobacillus dioliivorans y La
actobacilluss suebicus).
C
Como se ha
a indicado anteriormen
a nte, en gene
eral las BAL
L producen los EPS en
n niveles
bastante
e bajos lo que
q dificulta
a su estudio
o y de hech
ho todava constituyen
c un gran re
eservorio
por exp
plorar. El efecto
e bene
eficioso pa
ara la salud
d que cierrtos EPS p
parecen eje
ercer ha
impulsa
ado su estu
udio en los ltimos aos. A la b
squeda de EPS producidos por
e nuevos E
BAL, se
e lleva a ca
abo un estu
udio entre varios grup
pos de inve
estigacin d
de la RedB
BAL, que
incluye las BAL altterantes de productos crnicos y de bebidass alcohlica
as. Por el momento,
m
la caraccterizacin de los EP
PS producid
dos por Lb
b. sakei, La
actobacilluss plantarum
m y Leu.
mesenteroides aissladas de productos
p c
crnicos, a revelado que son
ha -glucanos de tipo
dextrano. Con resp
pecto a la estructura
e d los EPS producidoss por aislad
de dos de vino y sidra,
as cepas esstudiadas de la especie P. parvullus sintetiza
todas la an un -gluccano idntic
co, cuya
unidad repetitiva est
e constitu
uida por glu
ucosa con enlaces
e -(13) en la
a cadena prrincipal y
aciones de un nico monosacrido en posicin -(12) [Figura 5, Dueas-Chaasco, M.T.,
ramifica
Rodrgue
ez-Carvajal, M.A.,
M Tejero-M
Mateo, P., Fran
nco-Rodrguez, G., Esparte
ero, J.L., Irastorza-Iribas, A.,
A and Gil-
Serrano, A.M. (1997) Carbohydrate
C e Research, 303,
3 453-458)]].

Figura 5: Estructura del -(13)-D-glucano sin

ntetizado por Pediococcus
P pparvulus 2.6.

os -(13)
esis de esto
La snte glucanos est
e controllada por un nico enzima, una GT
TF unida

a memb
brana, y en
n el caso de
d la cepa P. parvulu
us 2.6 se trata
t de un
na protena de 567
aminoccidos y 65 kDa.
k Los aislados de sidra
s Lb. dio G y O. oeni I4 sintetiz
olivorans G77 zan este

 ms Lb. dioliivorans sinttetiza un --(16)glucano ramifiicado en

mismo -glucano, pero adem
n 2, y O. oeni
posicin o produce heterop
polisacridos constituid
dos por ga
alactosa, glucosa y
ramnosa.

EPS
Sy en ve
egetales fe
ermentado
os???
E
Existe una gran diverssidad de alimentos veg
getales ferm en cuya produccin,
mentados e
las BAL
L (perteneccientes al gnero Lacctobacillus, principalm
mente) dese
empean un
u papel
esencia
al, producien
ndo cido l
ctico a parrtir de los azcares
a de
e la materia prima, lo que
q hace
descend
der el pH del medio y de esa forma
f se im
mpide el de
esarrollo de
e microorga
anismos
indesea
ables (altera
antes o pa
atgenos). Muchas de
e estas baccterias aisla
adas de su
u medio
natural poseen gen
nes que cod
difican la prroduccin de
d EPS y so
on capacess de sintetiz
zarlos en
el laborratorio, com
mo es el ca
aso de la ce
epa Lactob
bacillus pen
ntosus LPS2
26 que produce un
HePS cuya
c fracci
n de alto peso
p molecular est fo
ormada por una unidad
d repetida de
d cinco
acridos que presenta la particula
monosa ener dos grrupos acetilo en el cido -D-
aridad de te
glucurnico y otro grupo acettilo en la --L-ramnosa
a [Figura 6, Rodrguez-Carvajal, M.A., Snchez,
J.I., Cam
mpelo, A.B., Martnez,
M B., Rodrguez,
R A.,, and Gil-Serrrano, A.M. (20
008) Carbohy
ydrate Resea
arch, 343,
70].
3066-307

ura 6: Estructuura del HePS sintetizado po

Figu or Lactobacilllus pentosus L
LPS26.
Glc, glucossa; GlcA, ciddo glucurnicoo; Rha, ramno
osa; Ac, grupoo acetilo; p, annillo piranosa

bargo, el co
Sin emb onocimiento
o acerca de
e la capacid
dad de esta
a cepa para
a producir el
e HePS
en cond
diciones na
aturales de fermentacin es muy escaso. Lo
o que s ess cierto es que, en
aquelloss pocos cassos de ferm
mentacioness de vegetalles en los que
q se ha de
escrito la prresencia
de EPS
S, no parecce que sto
os afecten negativame
n ente a las caracterstic
c cas sensoriiales del
productto final. Es el
e caso de las aceituna
as fermentadas.
L producccin de aceiitunas verde
La es de mesa entacin lcctica, es un proceso
a por ferme
tradicion
nal en el qu
ue las BAL (principalme
( ente, las pe
erteneciente
es a la espe
ecie Lb. pen
ntosus) y
las leva
aduras jueg
gan un papel fundam
mental. Las
s primeras, produciendo cido l
ctico a
as de los azcares que
expensa q ne el fruto y, las seg
contien gundas, pro
oporcionand
do a las
bacteria
as lcticas vitaminas
v de
el grupo B6 y contribuy
yendo con su
s metabolissmo, adems, a las
caractersticas sen
nsoriales tpicas del producto
p fe
ermentado. Hasta hacce poco tie
empo se
a que lacttobacilos y levadurass se desarrollaban aislados en las salmueras de
pensaba
fermenttacin. Sin embargo, hemos podido comprobar que ambos se asocian fo
ormando
comunid mplejas denominadas biofilms. Dichos biofilms se fo
dades com orman tanto
o en las

superficies inorgnicas o abiticas (paredes del fermentador, Figura 7) como en las

orgnicas o biticas (aceitunas, Figura 8) que ofrece el proceso fermentativo. Uno de los
aspectos ms interesantes de estos biofilms es que los microorganismos aparecen
embebidos en una matriz polimrica, probablemente de EPS, especialmente cuando se
encuentran adheridos a la superficie de los frutos (Figura 8).

Figura 7: Biofilm de lactobacilos productores de Figura 8: Biofilm de lactobacilos productores de

EPS (filamentos) en una superficie abitica (pared EPS (matriz en forma de velo) en una superficie
del fermentador de aceitunas) visualizado con bitica (aceitunas) visualizado con microscopio
microscopio electrnico. Barra 10 m. electrnico. Barra 10 m.

Separando los biofilms de la epidermis de la aceituna y sometindolos a un proceso con

objeto de purificar dicha matriz hemos podido comprobar que est formada principalmente
por EPS, cuya estructura estamos en proceso de determinar. Quin produce el EPS: los
lactobacilos, las levaduras o ambos? Probablemente, cuando se determine la estructura del
mismo podemos apuntar a uno u otro (o a
ambos) grupo de microorganismos como
responsable productor. Lo que s es cierto es que
un porcentaje muy alto de los lactobacilos
aislados de estos biofilms (alrededor del 70-80%)
producen EPS. Probablemente, sea este EPS el
responsable de lo que se conoce con el nombre
de salmueras melosas (Figura 9). En
determinadas ocasiones, sobre todo cuando el
Figura 9: Salmuera melosa de aceituna proceso fermentativo est bastante avanzado
fermentada debido a la produccin de EPS
(entre 45-60 das de fermentacin), se puede
comprobar que las salmueras de fermentacin se vuelven espesas y de color caramelo,
como si fuera miel. De ah su nombre. Las aceitunas, por otro lado, no presentan ningn tipo
de alteracin sensorial, conservando sus propiedades caractersticas de olor y sabor. Pues

10

bien, cuando sometemos esas salmueras a un proceso para purificar EPS, podemos
obtener unos 600 mg de EPS liofilizado/L de salmuera. Si tenemos en cuenta que un
fermentador industrial de aceitunas de 10.000 kg contiene aproximadamente 6.000 litros de
salmuera, se podran obtener ms de 3 kg de EPS por fermentador. De esta forma, se
aprovechara un subproducto de la fermentacin que de, otra forma, ira a parar a una balsa
de evaporacin. Y, sera de utilidad este EPS? Aunque las investigaciones son muy
recientes, todo apunta a que podemos buscarle un campo de aplicacin en salud animal y
humana.
En cantidades tan pequeas como un 1% (peso/volumen) el EPS de salmueras de
aceituna es capaz de adherirse in vitro a una cepa bacteriana (Escherichia coli) causante de
diarreas en lechones. A esas pequeas concentraciones, el EPS retarda sensiblemente el
desarrollo de esta bacteria lo que, a falta de datos experimentales in vivo con los animales,
augura una buena perspectiva de utilizacin en salud animal. Pero esas pequeas
cantidades de EPS son tambin suficientes para impedir de manera clara la adhesin de
una bacteria patgena (Listeria monocytogenes) a la clulas del epitelio intestinal humano
(denominadas Caco-2). En este caso, como en el anterior, las perspectivas futuras de
aplicacin en salud humana son esperanzadoras.
Nuestro prximo objetivo de investigacin consiste en comprobar que esos EPS
suponen una barrera efectiva que impida o retarde la adhesin de microorganismos
patgenos a las clulas intestinales animales y humanas, contribuyendo de esa manera a la
salud de potenciales consumidores de este producto microbiano.

Nuevas aplicaciones de los EPS en el campo de la salud

En los apartados anteriores ha quedado claramente recogida la funcin beneficiosa o
negativa de los EPS sintetizados por las BAL sobre las propiedades organolpticas de los
alimentos y bebidas fermentadas. Adems, como tambin se ha indicado, los EPS
bacterianos pueden incidir beneficiosamente en la salud humana, en esta seccin nos
vamos a central en su posible papel como agentes prebiticos e inmunomoduladores.
An no existe una definicin consensuada por la comunidad cientfica internacional
sobre los compuestos prebiticos; una de las ms utilizadas indica que son ingredientes
fermentados selectivamente que permiten cambios especficos en la composicin y/o
actividad de la microbiota intestinal confiriendo beneficios para la salud y el bienestar del
hospedador (la microbiota intestinal es la comunidad de microorganismos que viven en
nuestro TGI). Entre los prebiticos cabe destacar que los oligosacridos (consumidos en
nuestra dieta a travs principalmente de los vegetales, cereales y legumbres), los cuales no
somos capaces de digerir y llegan ms o menos intactos al colon (intestino grueso), son el
prototipo de agentes prebiticos. Un ejemplo de este tipo es la inulina, un fructo-
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oligosacrido (FOS) que se encuentra de forma natural en la achicoria, bardana, ajo,

puerros, etc., y su nombre procede del helenio (Inula helenium) la primera planta de la que
se purific. La inulina es un -D-Frup (21) con un bajo grado de polimerizacin, es decir
con un nmero pequeo de molculas de fructosa (entre 3 a 60). Tambin es habitual
encontrarla como ingrediente prebitico de algunos alimentos funcionales. En este contexto,
y segn se indic en la Tabla 1, los EPS sintetizados por BAL, que tienen similar
composicin qumica pero son de tamao mucho ms grande, podran ser el sustrato para
generar estos compuestos prebiticos en el colon, donde tendran el potencial de modular
los componentes de la microbiota intestinal con capacidad de metabolizar estos
biopolmeros. Es decir, promoveran el crecimiento de bacterias beneficiosas en el colon y
este efecto podra redundar en una mejora del estado inmune del hospedador humano.
Adems, los oligosacridos tienen un valor calorfico bajo (no engordan), no son
carcinognicos y tienen asociado un bajo riesgo de infecciones y diarrea. Los pioneros en la
investigacin y produccin de oligosacridos en los alimentos han sido los japoneses. Sin
embargo, actualmente Estados Unidos y Europa se han convertido en lderes de la
produccin de oligosacridos, debido al bajo coste de produccin a partir de materias primas
baratas y fciles de obtener (Tabla 2), procedentes generalmente de plantas.

Tabla 2. Tipos ms frecuentes de olgosacridos no digeribles y su materia prima de obtencin mediante distintos
procesos qumicos (trans-glicosilacin, hidrlisis, isomerizacin o extraccin) que origina molculas con
distintos enlaces y grados de ramificacin. Glu, glucosa; Fru, fructosa; Gal, galactosa; Xyl, xilosa.

Materiaprima Oligosacrido Estructuramolecular

Almidn Ciclodextrina (Glu)n
Almidn Gentiooligosacridos (Glu)n
Almidn Isomaltooligosacridos (Glu)n
Almidn Maltooligosacridos (Glu)n
Almidn(soja) Oligosacridosdesoja (Gal)nGluFru
Sacarosa Glicosilsacarosa (Glu)nFru
Sacarosa Isomaltulosa(palatinosa) (GluFru)n
Sacarosa Fructooligosacridos (FOS) (Fru)nGlu
Sacarosa Rafinosa GalGluFru
Sacarosa Estaquiosa GalGalGluFru
Sacarosa/Lactosa Lactosacarosa GalGluFru
Lactosa Lactulosa GalFru
Lactosa Galactooligosacaridos (GOS) (Gal)nGlu
Xilano Xilooligosacridos (XOS) (Xyl)n

Actualmente, los EPS producidos por bacterias lcticas estn siendo investigados
como potenciales agentes prebiticos para su posterior introduccin en el mercado. Esto es
debido al hecho de que la diversidad de las rutas metablicas de las BAL permitira ampliar
el espectro (polmeros con distintas composicin qumica) de compuestos bioactivos

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prebiticos. Para obtener oligosacridos a partir de los HoPS sintetizados por bacterias
lcticas, la aproximacin consistira en una seleccin bacteriana basada en su capacidad
enzimtica para sintetizar y degradar el EPS. Esta capacidad reside en dos clases de
enzimas las glicosil-hidrolasas (GH descritas anteriormente que estn implicadas en la
sntesis del HoPS) y las polisacrido-liasas (los enzimas que llevan a cabo su degradacin).
Una estrategia que permitira seleccionar estas bacterias, sera cultivarlas en presencia de
su propio EPS purificado como nica fuente de carbono. Con ello se podran identificar los
enzimas capaces de utilizar (degradar) esta biomolcula y posteriormente purificar el enzima
especficamente involucrado en esta biocatlisis del HoPS para obtener oligosacridos de
tamao ms pequeo para ser utilizados comercialmente como sustratos prebiticos, una
vez demostrada su funcin beneficiosa para la salud. En el caso de los EPS tipo HePS, la
aproximacin sera distinta debido a la complejidad de sntesis de estos polmeros (hay
numerosos enzimas implicados) y a la baja produccin del mismo por parte de la bacteria
productora. Por tanto, a priori, no sera factible obtener HePS como sustratos de prebiticos
o como aditivos en cantidades suficientes. Sin embargo, en algunos grupos que forman
parte de la RedBAL se est investigando la capacidad de HePS sintetizados por BAL y
bifidobacterias para ejercer un efecto prebitico cuando las bacterias productoras son
ingeridas bien en un alimento o en un preparado alimentario. Es decir, en este caso la
hiptesis que se est estudiando es si los EPS producidos por BAL probiticas son capaces
de modificar la microbiota intestinal hacia microorganismos beneficiosos para la salud del
hospedador, siendo estos microbios buenos los que consumiran los EPS prebiticos
producidos por BAL y bifidobacterias. En este caso podramos estar hablando de un
alimento / preparado alimentario sinbitico (no es una falta de ortografa), que sera aquel
que combina probiticos y prebiticos en su formulacin.

Otro aspecto a tener en cuenta en la relacin EPS bacterianos con la salud humana
es la posible capacidad inmuno-moduladora que estos biopolmeros podran ejercer sobre
nuestro sistema inmune. Un inmunomoduldor es una sustancia que tiene un efecto sobre el
sistema inmune como inmunosupresor o como inmunoestimulante para inhibir o estimular
dicho sistema. Especficamente el uso de inmunomoduladores incluidos como aditivos en
los alimentos puede ser importante para combatir infecciones, para prevenir procesos que
conducen a la aparicin de cncer del tracto digestivo o para tratar enfermedades debidas a
inmunodeficiencias, como por ejemplo enfermedades inflamatorias intestinales (enfermedad
de Crohn y colitis ulcerosa). En este contexto, HoPS o HePS producidos por bacterias
lcticas no han sido todava utilizados para elaborar alimentos funcionales o validados
experimentalmente en estudios con humanos como moduladores de las respuesta inmune,
puesto que las primeras evidencias cientficas de la capacidad inmunomoduladora de los

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EPS de BAL y bifidobacterias han sido obtenidas con modelos de estudio in vitro (en
laboratorio). Sin embargo, los grupos de investigacin de la RedBAL que trabajan con EPS,
junto con otros grupos internacionales, han comprobado que muchas de las bacterias
lcticas y bifidobacterias (algunas cepas son probiticas) con propiedades
inmunomoduladoras producen EPS. Adems, la naturaleza y estructura de algunos de estos
biopolmeros sintetizados por bacterias lcticas indican que tienen potencial como
inmunomoduladores. Este es el caso de los -glucanos que son conocidos como
modificadores de la respuesta biolgica" debido a su capacidad para activar el sistema
inmunolgico. En este contexto, grupos de la RedBAL han mostrado que bacterias lcticas
pertenecientes a los gneros Lactobacillus and Pediococcus productoras de (1,2) (1,3)--
glucano son capaces de inmunomodular macrfagos humanos in vitro [Fernndez de Palencia
P., Werning M.L, Sierra-Filardi E., Dueas M.T., Irastorza A., Corb A.L, and Lpez, P (2009) Applied
Environmental Microbiology, 75, 4887-4891]. El tratamiento de los macrfagos con el biopolmero
purificado conlleva un aumento de la secrecin de interleuquinas antiinflamatorias. Tambin,
la evaluacin de cepas productoras de -glucano revel que P. parvulus 2.6 and Lb.
suebicus CUPV221 son resistentes a las condiciones de estrs del tracto gastrointestinal
humano y que la presencia del EPS confiere a las bacterias productoras un incremento en
su capacidad de adhesin a las clulas del epitelio intestinal humano [Garai-Ibae G., Werning
M.L., Lpez, P., Fernndez de Palencia, P. (2010) Bioresource Technology, 191, 9254-9263]. As, el uso
de (1,2) (1,3) -glucano o sus bacterias productoras podran tener potencial como
inmunomodulador en el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Adems, el consumo de
productos fermentados basados en avena y preparados con P. parvulus 2.6 tambin
conlleva una disminucin de los niveles sricos de colesterol, confirmando el efecto previo
detectado con (1,3)--D-glucano presente en la avena. Finalmente, aunque estas cepas
productoras de (1,2) (1,3) -D-glucanos no han sido aisladas de productos lcteos, se ha
comprobado la capacidad tecnolgica de estas cepas para la elaboracin de derivados
lcteos o mezclas zumo-leche [Elizaquvel P., Snchez G., Salvador A., Fiszman S., Dueas M.T., Lpez
P., Fernndez de Palencia, P., and Aznar R. (2011) Journal of Dairy Science, 94, 3271-3278]. Dentro del
grupo de los EPS tipo HoPS, tambin los dextranos (-glucanos) han sido investigados
como inmunomoduladores y tienen potencial para reducir la respuesta inflamatoria. Por ello,
dada la gran capacidad de produccin de HoPS por parte de algunas BAL y sus
propiedades inmunomoduladoras, hace predecir que en un futuro las BAL productoras y sus
HoPS podrn ser evaluados como aditivos alimentarios en alimentos funcionales. De nuevo,
el caso de BAL y bifidobacterias productoras de EPS tipo HePS es diferente debido a la
menor produccin del biopolmero que no hace factible su uso como aditivo alimentario. Sin
embargo, en el grupo de investigacin del IPLA se est estudiando el papel de los HePS
producidos por bifidobacterias de origen humano sobre la capacidad para modular

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(modificar) la respuesta inmune humana. Estudios in vitro llevados a cabo con una batera
de 10 polmeros purificados de distintas bacterias productoras, y empleando como modelo
clulas mononucleares aisladas de sangre perifrica humana, muestran que los EPS son
capaces de modificar el patrn de produccin de citocinas de estos monocitos (las citocinas
son las protenas que producen las clulas animales para comunicarse entre s). Es decir,
los HePS de bifidobacterias actuaran in vitro como moduladores de la respuesta inmune
[Lopz, P., Montesern, D.C., Gueimonde, M., de los Reyes-Gaviln, C.G., Margolles, A., Surez, A., and Ruas-
Madiedo (2012) Food Research International, (doi:10.1016/foodres.2011.11.020)]. Por otro lado,
resultados preliminares obtenidos in vivo, en ratas alimentadas con bifidobacterias
productoras de HePS, mostraron que una de las cepas es capaz de disminuir la respuesta
inmune inflamatoria. Esto podra tener aplicaciones prcticas, en un futuro ms bien lejano,
para reducir el estado inflamatorio asociado con algunas enfermedades, como la
enfermedad inflamatoria intestinal indicada anteriormente.

Como corolario a esta seccin, hay que resear que an hay un largo camino por
recorrer antes de poder aplicar cepas productoras de EPS en el campo de la salud humana.
Adems de demostrar in vitro que los EPS per se pueden actuar como agentes prebiticos o
como moduladores de la respuesta inmune (entre otros campos de estudio) o que las cepas
productoras de estos biopolmeros son microorganismos probiticos, es necesario
demostrar su capacidad en modelos in vivo. Finalmente, en el marco legal Europeo en el
que nos encontramos, es imperativo demostrar mediante estudios clnicos bien diseados
que estos polmeros y sus bacterias productoras funcionan para mejorar la salud humana; y
en estos estudios es necesario que se implique el personal clnico imprescindible para
llevarlos a cabo. Los destinatarios finales de estos posibles alimentos o ingredientes
funcionales son los consumidores, en concreto grupos de poblacin especficos que se
podran beneficiar de un tipo de bacteria o EPS con unas caractersticas especiales para
cada situacin. Por ello el sector industrial, tanto de la alimentacin como de preparados o
suplementos dietticos, es otro de los actores principales llamados a desempear un papel
importante para que los cientficos, a partir del conocimiento bsico, puedan generar
conocimientos susceptibles de ser transferidos al tejido industrial y que, finalmente, el
beneficio revierta a la sociedad.

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