NUMERACIN DE COLIFORMES, DETERMINACIN DEL NMERO MS

PROBABLE (NMP)

I. OBJETIVOS

Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de

alimentos.
Determinar la numeracin de coliformes mediante el mtodo
de recuento en placa.
Determinar en NMP de coliformes fecales en muestras de
alimentos.

II. FUNDAMENTO TERICO

COLIFORMES
Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran
comnmente en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los
humanos. La presencia de bacterias coliformes en el suministro de
agua es un indicador de que el suministro de agua puede estar
contaminado con aguas negras u otro tipo de desechos en
descomposicin. Generalmente, las bacterias coliformes se
encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en
los sedimentos del fondo. Los coliformes se introducen en gran
nmero al medio ambiente por las heces de humanos y animales. Por
tal motivo suele deducirse que la mayora de los coliformes que se
encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, existen
muchos coliformes de vida libre.

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies

bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn
e importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua
y los alimentos.
Coliformes significa con forma de Coli, refirindose a la bacteria
principal del grupo, la Escherichia Coli, descubierta por el
bacterilogo alemn THEODOR VON ESCHERICH en 1860.
Caracteres bioqumicos:
El grupo agrupa a todas las bacterias entricas que se caracterizan
por tener las siguientes propiedades bioqumicas:
ser aerobias o anaerobias facultativas
ser bacilosGram negativos;
 no ser esporgenas
fermentar la lactosa a 35 C en 48 horas, produciendo cido
lctico y gas.

Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el

intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es
decir, homeotermos, pero tambin ampliamente distribuidas en la
naturaleza, especialmente en suelos, semillas y vegetales.
Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por
las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que
la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de
origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.

III. OBJETIVOS
Determinar el NMP de coliformes totales en muestras de
alimentos.
Determinar la numeracin de coliformes mediante el mtodo
de recuento en placa.
Determinar en NMP de coliformes fecales en muestras de
alimentos.

IV. EQUIPOS Y MATERIALES:

1. Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la
muestra de alimentos.
2. Incubadora de 35C 37C
3. Pipetas bacteriolgicas de 1ml
4. Aguja de incubacin con alambre de nicrn o platino iridio.
5. Caldo verde brillante bilis lactosa (CALDO BRILA) volmenes de
1ml en tubos de 150x15mm conteniendo tubos de
fermentacin invertidos (75x1mm).
6. agar violeta cristal-rojo neutro- bilis (VRBA) o agar ENDO o agar
Mc CONKEY

V. PROCEDIMIENTO
NUMERO MS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES
1. Preparar las muestras de alimento de acuerdo al procedimiento
recomendado.
2. Pipetear 1ml de c/u de las diluciones del homogenizado de alimento
en tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA) utilizando
tres tubos por dilucin.
3. Incubar los tubos a 35C 37C por 24- 48 horas
 4. Anotar los tubos que muestren produccin de gas (prueba presuntiva)
5. De cada tubo que contiene gas, aislar sobre placas con agar-violeta
cristal-rojo neutro-bilis (VRBA) o agar ENDO.
6. Incubar los tubos a 35C 37C por 24- 48 horas
7. Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:
a. la formacin de colonias, rojo oscuro con dimetro mayor de
5mm en agar VRBA.
b. La formacin de colonias rojas rodeadas halo en agar ENDO.
8. Anotar el nmero de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP
para expresar el resultado.

NUMERACIN DE COLIFORMES DE
ORGEN FECAL

I. EQUIPOS Y
MATERIALES
1. Asa de
inoculacin.
2. Bao de agua,
regulado a 44
(+/- 0.1C)
3. Pipetas
bacteriolgicas
de 5ml
4. Caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA), volmenes de 10ml
en tubos de 150x15mm. Conteniendo tubos de fermentacin
invertidos (75x10mm).
5. Caldo triptosa, volmenes de 1ml en tubos de 150x15mm.
6. Reactivo de KOVACS.

II. PROCEDIMIENTO:
1. Seleccionar los tubos de caldo verde brillante bilis lactosa
(caldo BRILA) que muestren formacin de gas en prueba
presuntiva.
2. Inocular una azada de cada tubo gas positivo a un tubo de
caldo BRILA y un tubo de caldo triptosado.
3. Incubar los tubos a 44 (+/- 0.1C)
4. Despus de 24 horas de incubacin, efectuar la prueba de indol
en los tubos con caldo triptosa.
5. Controlar la formacin de gas en los tubos con caldo BRILA
despus de 24 y 48 horas de incubacin.
6. Los cultivos que muestran produccin de gas en caldo BRILA y
formacin del indol en caldo triptosa son positivos para
coliformes fecales.
 7. Referirse a la tabla de NMP para expresar el resultado.

NUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MTODO DE

RECUENTO EN PLACA

I. MATERIALES:
1. Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la
muestra.
2. Incubadora a 45-37C.
3. Pipetas bacteriolgicas de 1ml.
4. Bao de agua regulada a 44- 46C, para temperar el agar.
5. Agar Violeta Cristal Rojo Negro Bilis (VRBA)

II. PROCEDIMIENTO
1. Prepara la muestra por el procedimiento recomendado para la
preparacin de dilucin de muestra.
2. Transferir 1ml de cada dilucin de la muestra a una placa de
Petri estril.
3. Adicionar a cada placa de Petri, 10-15ml de agar violeta cristal
rojo bilis temperado a 44- 46C.
4. Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de
vaivn y rotacin de cada placa. Dejar solidificar la mezcla 5 a
10 minutos, luego distribuir un adicional de 10ml de medio de
plaqueado como doble capa, cubriendo completamente la
superficie de medio solidificado e que inhibir la formacin de
colonias en la superficie.
5. Invertir e incubar las placas durante 24 horas a 35-37C.
nicamente las colonias rojo oscuro que midan 0.5mm o ms
de dimetro en la placa, que tengan entre 20 y 200 colonias, se
consideran bacterias coliformes. Si es posible seleccionar para
el recuento solamente aquellas placas no con ms de 150
colonias de estas colonias. Multiplicar el nmero de colonias
por dilucin para obtener el nmero de bacterias coliformes por
gramo o ml de muestra.

a) Calculados a partir de los datos de Man (1975)

b) En cada nivel de dilucin, inocular 1ml en cada uno de tres tubos de

medio.
Para calcular en NMP de las diluciones mayores que las que se sealan
multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de 10,100,1000 , etc.
Por ejemplo , si se han seleccionado tubos provenientes de las diluciones

10-2,10-3, 10-4, multiplicar por 10 , si de las diluciones

10-3, 10-4, 10-5 multiplicar por 100 .

VI. RESULTADOS
NUMERO MS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES

NEGATIVO:
Color verde botella , translucido,
no hay gas en la campana

POSITIVO:
Color verde olivo, opaco o
turbio, si hay presencia de gas
en la campana.
Grupo 1

2 = positivo
1 = positivo

Grupo 2

4 = hay gas positivo

translucido
3 = gas positivo translucido
5y6 = no hay gas

En 1 ML. Hay 2100.

2100 coliformes, es una leche no contaminada, la calidad es bastante
buena.
VII. CONCLUSIONES

Estas bacterias se elimina con tratamiento trmico a 60 65C

aunque es muy bajo y se puede aumentar la temperatura.

Coliforme lactosa positiva ocurre la fermentacin y se obtiene CO 2

es decir el medio de cultivo esta dentro y va a salir en forma de
gases quiere decir que la reaccin es positiva y si no ocurre nada
la reaccin es negativa.

Cuando hablamos de coliformes totales nos referimos a casi todas

su familia como lactosa positivo se le denomina con el nombre de
coliforme.

VIII. RECOMENDACIONES
Se recomienda trabajar con 3 muestras consecutivas y con
esos valores se encuentra el resultado.
Tener buena limpieza en los baos especialmente ya que estos
se dispersen rpidamente, produciendo diarrea, es la bacteria
con la que constantemente estamos tratando en todo sentido.
Esterilizar el ambiente.
Se necesario trabajar con MERCK es ms HOMOGENEA en caldo
caldo brilla.

IX. CUESTIONARIO
1.-Por qu es importante este indicador microbiolgico para
evaluar la calidad microbiolgica de productos alimenticios?

La Microbiologa de Alimentos es la rama de la Microbiologa que se

ocupa entre otros aspectos del estudio de los microorganismos que
pueden afectar la calidad sanitaria de los alimentos y el agua. El rea
de la microbiologa de los alimentos es basta y compleja, pues incluye
adems las caractersticas generales de estos microorganismos, su
ecologa, su resistencia al medioambiente, su capacidad para
sobrevivir y desarrollarse en los alimentos, las consecuencias de este
desarrollo y los factores que influyen en este proceso.
La Microbiologa de Alimentos se relaciona con la microbiologa
mdica, la veterinaria, la virologa, la parasitologa, la gentica,
la bioqumica, la tecnologa de los alimentos, la epidemiologa. Es
importante en el diseo y aplicacin del sistema de anlisis de peligro
y puntos crticos de control, esencial para garantizar la inocuidad de
los alimentos, en el estudio de brotes de enfermedades asociadas al
consumo de alimentos, en el diseo y evaluacin de tcnicas
modernas de anlisis, en el estudio de los procesos que tiene lugar
durante el deterioro de los alimentos y en la fabricacin de aquellos
que hacen uso de microorganismos.

2.-Qu importancia tiene para evaluar la calidad

microbiolgica del suelo y del agua?
El agua no debe presentar ningn tipo de riesgo que pueda causar
irritacin qumica, intoxicacin o infeccin microbiolgica que sea
perjudicial a la salud humana (VARGAS, 1996).

Debido a estas condiciones, en el caso de los microorganismos

patgenos no existe un lmite inferior tolerable; por lo que el agua
destinada al consumo, la preparacin de alimentos y bebidas o la
higiene personal no debe contener ningn agente patgeno para los
seres humanos. Esto se puede conseguir seleccionando fuentes de
agua de buena calidad, tratando y descontaminando eficazmente el
agua contaminada con heces de seres humanos o de animales u
otras sustancias y protegindola para que no haya contaminacin
durante la distribucin al usuario. (OMS, 1995).

Los microorganismos en general, son encontrados comnmente en el

agua, suelo y aire. La cantidad de ellos, presentes en cualquiera de
estos medios, depende de una serie de factores tales como:
humedad, temperatura y nutrientes. (CACERES, 1990).

El peligro ms comn y difundido, relativo al agua de consumo

humano es el de su contaminacin microbiana con aguas servidas y
excretas del hombre y de los animales.Para controlar los peligros se
aplican criterios (guas y estndares) para normar la calidad de las
aguas; stos establecen requisitos que deben satisfacer las aguas
para que puedan ser destinadas al consumo humano sin que afecten
 su salud. El cumplimiento de los requisitos de calidad sanitaria debe
reducir en forma significativa los riesgos de contraer enfermedades
infectocontagiosas (INHEM, CUBA, 1992). Sin embargo, si los
requisitos de calidad sanitaria no son los adecuados, carecern de
importancia para proteger y controlar la calidad del agua y su
aplicacin no cumplir con los objetivos previstos.

3.-Qu indica la presencia de E.coli?

E. coli ha venido utilizndose como ndice de posible presencia de

patgenos de procedencia entrica (entre ellos, Salmonela) en el
agua y los alimentos.

4.-Utilizando qu buenas prcticas de manufactura se podra

evitar el aumento del NMP de coliformes totales?
Instalaciones fsicas
Instalaciones sanitarias
Manejo de desechos
Caracterizacin de agua
Control de plagas

Tener en cuenta todos los requisitos para un buen proceso

prctico en un laboratorio o empresa industrial. Esto con el fin de
obtener buenos resultados que no perjudiquen la salud de los
seres humanos y la institucin tenga un buen prestigio higinico.

I. BIBLIOGRAFA

1.- Bourgeois C.M. Microbiologa Alimentaria. Editorial Continental

S.A.1995.

2.-Frazier ,W.C. Microbiologa de los alimentos .Ed. Acribia . Espaa

2000.
3.- Mossel.D.Microbiologa de los alimentos. Ed. Acribia. Espaa 2000.
4.-DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
5.-MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.
6.-Ministerio de Salud DIGESA . Manual de Anlisis Microbiolgico de
Alimentos.
7.-FAO-ONU- Manuales para el control de calidad de Alimentos para la
agricultura y la Alimentacin. Roma.

II. ANEXOS
Tabla de NMP para expresar resultados.

Diluci Diluci Diluci NMP 99% 95%

n 10-1 n 10-2 n 10-3 por g.

0 1 0 3 1 23 1 17
1 0 0 4 1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 38
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 80 2 38
2 0 1 14 3 82 3 48
2 1 0 15 3 85 5 50
2 1 1 20 0 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 610
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 <100 1900 200 1400
3 3 1 500 100 3300 200 2400
3 3 2 >1100 200 6400 100 1800