INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLGICAS

INTEGRANTES:

Alcocer Herrera Dulce Mariana

lvarez Rangel Jennifer
Mendoza Gmez Areli Monserrat

PRCTICA 4. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA

FORMIATO DESHIDROGENASA Y NITRATO REDUCTASA EN
Escherichia coli

GRUPO: 5IV1 SECCIN: 1

EQUIPO: 2

PROFESORAS:

Carlos Jorge Martnez Canseco

Refugio Elisa Rivera Prez

CALIFICACIN
ASPECTO MN-MAX CALIFICACIN
Hiptesis 0.0 1.0 puntos
Objetivo 0.0 1.0 puntos
Anlisis de
resultados 0.0 1.0 puntos
finales
Discusin de
resultados 0.0 4.0 puntos
Conclusiones 0.0 2.0 puntos
Bibliografa 0.0 1.0 puntos
TOTAL 0.0 10.0
puntos
Fecha de entrega: 21 de abril 2017

Hiptesis

Si Escherichia coli puede favorecer la sntesis de la enzima nitrato

reductasa y formiato deshidrogenasa en condiciones anaerobias,
entonces dichas enzimas presentaran mayor actividad en esas
condiciones que en aerobiosis.

Objetivo general

Analizar los factores que influyen en la actividad enzimtica de

formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa en Escherichia coli
utilizando cadenas de electrones artificiales y cuantificando los
productos finales para determinar las condiciones ptimas de la
reaccin.

Objetivos especficos

Determinar la actividad enzimtica especfica de formiato

deshidrogenasa empleando una cadena artificial de electrones y
cuantificar DCFIF reducido por mtodos espectrofotomtricos.
Determinar la actividad enzimtica especfica de nitrato
reductasa y cuantificar nitritos por el mtodo de Griess.
Determinar la actividad especfica del complejo enzimtico
formado por formiato deshidrogenasa y nitrato reductasa y
cuantificar nitritos por el mtodo de Griess.

Anlisis de resultados finales

Extracto de clulas de Escherichia coli nativa

Contenido de crecidas en condiciones:
Anaerbicas Aerbicas
protenas y
Actividades
1 2 3 4
enzimticas
Sin NO3 Con NO3 Con NO3 con NO3
+ + Sin +
Oligoeleme Oligoeleme Oligoeleme Oligoeleme
ntos ntos ntos ntos
mg de Protena/ mL 32.50 42.27 38.65 33.76
extracto
Actividad Especfica de 0.7654 - - 0.5118
FoDHasa
 ( A 600 nm /min/mg
Protena)
Actividad Especfica de 177.4584. 493.4352 378.8847 477.5726
NRasa (nMoles NO2
/min/mg Protena)
Actividad Especfica del 116.6908 37.9370 39.0401 102.7069
complejo (nMoles NO2
/min/mg protena)
Anlisis de resultados

En la actividad de nitrato reductasa se observa que se produce mayor

cantidad de nitratos en condiciones de anaerobiosis (matraz 2) que
en anaerobiosis (matraz 1, 3) y que en condiciones de aerobiosis
(matraz4) adems que se observa que en condiciones de
anaerobiosis (comparando el matraz 1 y 3) hay mayor actividad de
nitrato reductasa sin la presencia de nitratos en el medio.

En los extractos que se encontraban en condiciones de anaerobiosis

se observ mayor contenido de protenas (extractos 2 y 3) teniendo
mayor cantidad el extracto que tena nitratos y oligoelementos (2). El
extracto que se encontraba en aerobiosis, si presenta protenas, pero
son menores (extracto 4).

La enzima formiato deshidrogenasa presenta mayor actividad en el

extracto 1 que se encontraba en condiciones de anaerobiosis,
mientras que en condiciones de aerobiosis el extracto 4 es el que
presenta menor actividad de esta enzima.

El complejo formiato deshidrogenasa nitrato reductasa presenta

mayor actividad en condiciones de anaerobiosis (extracto 1) seguido
por el extracto 4 en condiciones de aerobiosis (que tena en el medio
nitrato y oligoelementos), mientras que en condiciones de
anaerobiosis el extracto que presenta menor actividad de esta
enzima es el 2, el cual no careca de NO3 ni de oligoelementos.

Discusin de resultados

Las cadenas respiratorias de las bacterias, comparadas con las de las

mitocondrias, presentan 3 aspectos diferenciales caractersticos:

1. Las bacterias tienen diversos tipos de cadenas transportadoras de

electrones.
2. Una determinada bacteria puede modificar su cadena respiratoria
como respuesta a muchas variaciones del medio en donde est
creciendo.
3. Muchas cadenas respiratorias bacterianas presentan ramificaciones
con vas alternativas que transportan los electrones hasta una amplia
variedad de aceptores terminales de electrones reflejando la amplia
versatilidad de las bacterias.
El desarrollo de E.coli en condiciones anaerobias depende de la presencia de
un aceptor de electrones apropiado, el cual puede ser un producto de la
fermentacin de los azucares, pero puede tambin utilizar fumarato y
nitrato como aceptores finales de electrones en un sistema que comprende
citocromos.

Cuando el nivel de oxigeno disponible es alto, funciona una sola cadena

respiratoria constituida por NAD- deshidrogenasa, ubiquinona, citocromos b
y citocromo oxidasa. Las bacterias tienen un ciclo del cido tricarboxlico
funcional, sin embargo, la -cetoglutarato deshidrogenasa es muy sensible
a las condiciones anaerobias, pudiendo disminuir su actividad hasta
interrumpir el ciclo. Entonces el crecimiento slo puede proseguir
fermentativamente, en este caso se acumulan en el medio una serie de
catabolitos secundarios: ac. Lctico, ac. Actico, ac. Frmico y Etanol. Las
cadenas respiratorias pueden utilizar una gran variedad de sustratos, cada
una de las distintas deshidrogenasas unidas a la membrana (NADH +H + ,
lactato, succinato, formiato o glicerol-3-fosfato deshidrogenasas) pueden
dar electrones a un pool comn de quinona (ubiquinona-8 en condiciones
aerobias y metaquinona en condiciones anaerobias). La quinona da a su vez
electrones a las reductasas terminales y a los complejos de citocromos.
Durante el crecimiento aerobio, el NADH + H + puede ser reoxidado por la
cadena respiratoria, pero en condiciones anaerobias el NAD + se regenera de
otro modo y tienen lugar cambios metablicos importantes. En condiciones
aerobias la cadena respiratoria tienen al oxigeno como aceptor final de
electrones.

Figura 1. Cadena respiratoria con oxgeno como aceptor final de

electrones.

El oxgeno accesible puede disminuir como consecuencia del rpido

crecimiento bacteriano o cultivar en condiciones de anaerobiosis y entonces
aparece citocromo a y un citocromo d que acta de oxidasa terminal. Al
mismo tiempo, se sintetiza metaquinona. El grupo de citocromos utilizados
para la respiracin con fumarato en ausencia de oxigeno est constituido
por citocromos b555 , citocromo b558 , citocromo a y citocromo d. Las
bacterias de E.coli tienen un ciclo del cido tricarboxlico funcional en
condiciones aerobias, sin embargo anaerbicamente se reducen los niveles
de citrato sintasa, aconitasa e isocitrato deshidrogenasa, pero se genera el
-cetoglutarato necesario para la biosntesis, al su vez la -cetoglutarato
deshidrogenasa es drsticamente reprimida en anaerobiosis, impidindose
la formacin de succinato, este ltimo, es necesario para la biosntesis y se
forma por reduccin del oxaloacetato, el cual a su vez se genera por
carboxilacin del piruvato. La fumarato reductasa, uno de los enzimas
implicados en la generacin de succinato a partir de fumarato, es una
enzima respiratoria que genera fuerza protonmotriz, de este modo, las
bacterias pueden crecer anaerbicamente con sustrato no fermentable
siempre y cuando est presente el fumarato como aceptor de electrones
exgeno.

Figura 2. Ciclo de los cidos tricarboxlicos y brazo reductor que

posibilita la sntesis en condiciones anaerobias de succinato a
partir de oxalacetato.

La anaerobiosis disminuye la formacin de piruvato deshidrogenasa, que

produce NADH. La funcin de este enzima es reemplazada por la piruvato
formiato liasa, la cual produce acetil CoA y formiato. El formiato es, a su vez,
convertido en CO2 y H2 por la formiato deshidrogenasa e hidrogenasa.
Figura 3. Catabolismo de la glucosa por las bacterias fermentativas
que respiran nitrato. FDH-H, formiato deshidrogenasa-H; HYD-3
hidrogenasa isoenzima 3; CoA, coenzima A; NR, nitrato reductasa.

En presencia de nitrato, el formiato es oxidado por una formiato

deshidrogenasa diferente, siendo transferidos entonces los electrones al
nitrato y no formndose hidrogeno. La cadena de transporte que se
establece desde el formiato al nitrato permite generar ATP por fosforilacin
oxidativa.

Figura 4. Cadena respiratoria con nitrato como aceptor final de

electrones

Los oligoelementos son bioelementos presentes en pequeas cantidades

tanto para los microorganismos como para los seres vivos, cumplen diversas
unciones importantes para el desarrollo y crecimiento de bacterias y seres
humanos, tanto su ausencia como su alta concentracin presente en el
microorganismo puede ser perjudicial y txica para su crecimiento, son muy
necesarios para el crecimiento de las bacterias cuando se quieren aislar en
un medio de cultivo, deben comprender parte de la formulacin del medio
debido a que participa en la activacin y son parte de las enzimas que
catalizan muchas reacciones qumicas que la bacteria necesita para
reproducirse y seguir viviendo.

Parte de esta prctica fue utilizar las enzimas Nitrato reductasa y Formiato
deshidrogenasa en donde se sabe que estos oligoelementos son parte muy
importante en su sntesis.

La enzima nitrato reductasa adems de ser inducida por la presencia

de Nitrato de Potasio como aceptor final de electrones en su cadena
respiratoria para ser activada necesita de un oligoelemento muy
importante y que es parte de la sntesis de otras enzimas importantes
adems de esta el cul es el Molibdeno y el Fierro por ello est
enzima es llamada enzima sulfomolibdeno flavoprotena porque en su
 sitio cataltico necesita la incorporacin de Fierro y Molibdeno para
poder reducir al nitrato a nitritos.
Por otro lado la enzima Formiato deshidrogenasa tambin necesita la
incorporacin de Molibdeno y Selenio para que la enzima pueda
utilizar al formiato una vez que Escherichia coli ha sido incubada en
condiciones de anaerobiosis y con estos oligoelementos es inducida
su sntesis tanto por ellos como la presencia de una fermentacin
cido mixta donde uno de sus productos finales es el formiato que
dar el incremento de la actividad de esta enzima importante para la
respiracin anaerobia de Escherichia coli.

Es importante aclarar que tanto la enzima nitrato reductasa y la formiato

deshidrogenasa necesitan obligatoriamente estos oligoelementos para
presentar su mxima funcin metablica, es decir sin estos presentes en el
desarrollo de la bacteria su actividad enzimtica se reduce tanto hasta
valores de 0.

Los extractos celulares de E.coli que se muestran en la tabla de resultados

se obtuvieron cultivando clulas en medios adicionados con glucosa por 18
horas a 37 C, posteriormente se agregaron oligoelementos y nitrato de
potasio segn lo indica la tabla y se cultivaron los primeros tres en medio
estacionario en condicin de anaerobiosis mientras que el cuarto se cultiv
en condiciones aerbicas en medio agitado.

La actividad del formiato deshidrogenasa determino se cuantificando el 2,6

DCFIF reducido empleando la siguiente cadena artificial de electrones:
 Actividad de nitrato reductasa.

La enzima nitrato reductasa es la encargada de la reduccin de NO3 a

NO2 en condiciones de anaerobiosis ya que al no estar presente el 02
como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria de E.coli en
anaerobiosis el NO3 ser el encargado de aceptar los electrones.

La desnitrificacin requiere de un sustrato oxidable (orgnico o

inorgnico) por lo que la desnitrificacin la pueden realizar bacterias
hetertrofas o auttrofas (1).

En el extracto 1 se encontraba en anaerobiosis y no haba presencia de

KNO3 por lo que la nitrato reductasa no tena que presentar actividad,
pero experimentalmente si presento actividad, esta actividad se podra
deber a que en el medio en el que creci E.coli que era de Sypher y
Strauss estaba presente NO3 de alguno forma y por eso la enzima pudo
presentar actividad.

En el extracto 2 se encontraban presente todas las condiciones para que

la enzima tenga una actividad mayor a los otros extractos, pues estaban
presentes KNO3 para usarse como aceptor de electrones, estaba en
condiciones de anaerobiosis y tena oligoelementos, pero la actividad
que se obtuvo experimentalmente no fue esa, de echo es el extracto
donde hay menos actividad, esto se puede deber a que el regulador
errores del analista al no adicionar algn reactivo como el regulador de
fosfatos para darle a la bacteria el pH que necesitaba para trabajar, a
falta de corriente de nitrgeno en el envase o a un mal sellado del
envase durante el proceso. En el extracto 3 tena que haber una
actividad baja de la enzima pues aunque tena el KNO3 y estaba en
anaerobiosis, no haba presencia de oligoelementos que le permitan
 tener una buena actividad. Y en el extracto 4, que se encontraba en
aerobiosis, no tena que haber nada de actividad de la enzima pues E
coli prefiere usar el O2 como aceptor final de electrones en lugar de
NO3, pero experimentalmente presenta una alta actividad, incluso mayor
a los extractos con condiciones de anaerobiosis.

Determinacin de protenas.

Algunas bacterias como E.coli producen nitrato reductasa en su cadena

trasportadora de electrones y pueden usar el NO3 como aceptor de
electrones en lugar de O2. La produccin de protenas es proporcional
al crecimiento de la bacteria, por lo que un incremento de protena en el
paquete celular indica que hay mayor concentracin de clulas (2). Para
que el microorganismo pueda crecer requiere tener todas las condiciones
necesarias como: nutrientes, presencia o ausencia de o2, etc.

En el experimento se observa que el extracto 1 se encuentra en

anaerobiosis, no tiene NO3 ni O2, por lo tanto el crecimiento que
presentara E.coli tiene que ser una fermentacin acido mixta, el sustrato
que uso la bacteria es glucosa y como las fermentaciones son
oxidaciones incompletas del sustrato se espera poco crecimiento de la
bacteria. El extracto 2 contaba con todos los medios para un buen
crecimiento (condiciones de anaerobiosis, NO3 y oligoelementos)
pudiendo realizar la respiracin anaerobia. En el extracto 3 a pesar de
tener NO3 y estar en condiciones de anaerobiosis, no estaban presente
lo oligoelementos, por lo tanto el crecimiento tiene que ser menor al
extracto 2. En el extracto 4 E. coli est en condiciones de aerobiosis por
lo tanto prefiere usar el O2 como aceptor de electrones que el NO3, por
lo tanto el crecimiento tiene que ser mayor.

Experimentalmente el extracto 1 presenta poco cantidad de protenas

debido a las condiciones en las que se encontraba E.coli y que solo
oxido la glucosa de forma parcial. El extracto 2 es el que presenta mayor
cantidad de protenas pues tena las condiciones ptimas para crecer. En
el extracto 3 hay una cantidad de protenas mayor al extracto 1, pero
menor al extracto 2 por que tena NO3, pero le haca falta
oligoelementos que son necesarios para su crecimiento. En el caso del
extracto 4 la cantidad de protenas es baja aunque debera de ser mayor,
este resultado se puede deber a que la cantidad de O2 que se
encontraba en el envase no estaba limitada, por lo tanto la produccin
de protenas tambin.

CONCLUSIONES:

E.coli puede sintetizar nitrato reductasa el tener en el medio

compuestos con NO3 y estar en condiciones de anaerobiosis.
El crecimiento de una bacteria como E.coli depender de las
condiciones en las que se encuentre, donde la produccin de
protenas es proporcional al crecimiento de la bacteria.
BIBLIOGRAFA:

[1] Ramn Pars, Antonio Jurez, 1997, Bioqumica de los

Microorganismos, Editorial Revert S.A, Mxico, pp: 182, 191-198.

[2] D.G. Nicholls "Bioenergtica Introduccin a la teora quimiosmtica" es

de Editorial Revert S.A Mxico, 1987, Pginas: 135-139.

(3)http://www.unac.edu.pe/documentos/organizacion/vri/cdcitra/Informes_Fin
ales_Investigacion/Octubre_2011/IF_DECHECO
%20EGUSQUIZA_FIPA/CAPITULO%20N%BA%2005.pdf

(4)http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/U4c_MedicionCrecimiento_17
801.PDF