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Autores:
M Jos Lpez Garca, Aurora Urbano Felices, Marta Crdenas Povedano
Revisores: Javier M Gutirrez Romero, Iratxe Lpez Pelayo
NDICE
NDICE DE TABLAS
NDICE DE ILUSTRACIONES
PRESENTACIN
CAPTULO 1
BIOLOGA DEL SEMEN
1.1 Anatoma
1.2 Citologa
1.2.1. El espermatozoide
1.3 Fisiologa
1.3.1. La eyaculacin
1.3.2. Movilidad del espermatozoide
1.3.3. Capacitacin del espermatozoide
1.3.4. Espermatogenesis
1.3.5. Regulacin de la funcin gonadal testicular
1.4 Patologa
1.4.1. Esterilidad de la pareja
CAPTULO 2
PREANALTICA
2.1 Factores que afectan a la calidad de la muestra
2.2 Recogida de las muestras
2.3 Recogidas especiales
2.4 Transporte
2.5 Recepcin
2.6 Conservacin: Criopreservacin
CAPTULO 3
EVALUACIN INICIAL DEL SEMEN
3.1 Evaluacin inicial macroscpica
3.2 Evaluacin inicial microscpica
CAPTULO 4
ESTUDIO BSICO DEL ESPERMIOGRAMA
4.1 Recuento
4.1.1. Criptozoospermias y azoospermias
4.2 Morfologa
4.3 Vitalidad
4.3.1. Test de los colorantes supravitales
4.3.2. Test hipoosmticos
4.4 Anticuerpos antiespermatozoides
4.5 Otras clulas
4.5.1. Leucocitos
4.5.2. Clulas de la espermatognesis inmaduras
CAPTULO 5
PRUEBAS ANALTICO-CLNICAS DE SEGUNDA INTENCIN
5.1 Caracteres funcionales de los espermatozoides
5.1.1. Prueba de interaccin moco cervical-esperma
5.1.2. Anlisis del movimiento de los espermatozoides asistido por ordenador (C.A.S.A.)
5.1.3. Estudio de la reaccin acrosmica
5.1.4. Prueba de fecundidad heteroespecfica
5.1.5. Pruebas para explorar la calidad del ncleo espermtico
5.1.6. Estudio por microcopia electrnica de los espermatozoides
5.2 Bioqumica seminal
5.2.1. Eleccin de los marcadores bioqumicos
5.2.2. Determinacin de marcadores bioqumicos
5.2.3. Expresin de los resultados
5.3 Estudios complementarios en sangre
5.3.1. Cariotipo y anomalas cromosmicas
5.3.2. Determinaciones hormonales
CAPTULO 6
ESTUDIO DEL SEMEN EN VASECTOMAS Y VASOVASOSTOMAS
6.1 Semen de postvasectoma
6.1.1. Anlisis en fresco
6.1.2. Anlisis sedimento
6.1.3. Expresin de los resultados
6.2 Semen de prevasovasostoma
6.3 Semen posvasovasostoma
6.3.1. Resultados del semen pre y posvasovasostoma
CAPTULO 7
CAPACITACIN DEL SEMEN
7.1 Campo de aplicacin
7.2 Objetivos de las tcnicas de preparacin de semen
7.3 Tipo de muestra
7.3.1. Semen fresco
7.3.2. Semen congelado
7.4 Materiales y medios necesarios
7.5 Mtodos de preparacin del semen
7.5.1. Mtodo de lavado
7.5.2. Migracin
7.5.3. Gradientes de densidad
7.5.4. Mtodo de filtrado
7.6 Valoracin de los resultados
7.7 Conclusiones
CAPTULO 8
INFORME DEL LABORATORIO
8.1 Resultados
8.2 Valores de referencia
8.3 Comentarios
CAPTULO 9
BIBLIOGRAFA
SOBRE LOS AUTORES DEL LIBRO
SOBRE LOS REVISORES DEL LIBRO
ndice de tablas
ndice de ilustraciones
Presentacin
El objetivo de este manual es actualizar los conocimientos y adiestrar en los procedimientos para
evaluar la calidad del semen y capacitarlo, con el fin ltimo de ayudar al diagnstico de la
subfertilidad y esterilidad de origen masculino (casual o provocada por vasectoma) y al
tratamiento de la pareja mediante la preparacin del semen para las tcnicas de reproduccin
asistida.
Para la elaboracin del manual nuestro grupo de trabajo ha realizado una revisin completa y
actualizada del anlisis y preparacin del semen sobre la que se han desarrollado unos
Procedimientos de Laboratorio de forma detallada y esquematizada, de cada uno de los pasos
del proceso analtico: recepcin de muestras, anlisis del semen, capacitacin e informe de
laboratorio.
Julio 2012
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Captulo 1
1.1 Anatoma
El aparato reproductor masculino est formado por varios rganos que segn su funcin se
podran clasificar en cuatro grupos:
o Dos testculos: tienen una doble funcin, por una parte producen los
espermatozoides mediante un proceso llamado espermatognesis y por otra ejercen
una importante regulacin endocrina, tanto a nivel reproductor como sobre otros
rganos y funciones de nuestro cuerpo.
o Las vas seminales, que tambin son dobles hasta su conexin con la prstata:
transportan los espermatozoides a lo largo del sistema reproductor.
o Las glndulas accesorias: aportan una serie de sustancias vitales para la funcin
reproductora porque forman el lquido seminal, y adems tienen una funcin nutritiva
o reguladora.
o El pene: deposita el semen en la vagina.
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Biologa del Semen
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustracin 20)
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_01a.jpg
A) Testculos
Los testculos se hallan en la regin perineal, tras la base del pene, en el interior de la bolsa
escrotal.
El escroto no tiene grasa y sus msculos reaccionan al calor extendiendo o contrayendo la piel.
Las dos gnadas (testculos) no ocupan el mismo nivel, ya que en la mayora de los hombres el
testculo izquierdo baja un poco ms que el derecho.
Los conductos o tbulos seminferos son los conductos productores de los espermatozoides. Se
encuentran dentro de los lobulillos testiculares (hay entre 200 y 300 por testculo) formados por
los septos testiculares, que parten desde la tnica albugnea y se unen en el mediastinum testis.
Cada lobulillo contiene de 1-4 tbulos seminferos productores de espermatozoides.
Los tbulos seminferos desembocan a travs de los tbulos rectos en las cavidades
denominadas rete testis en el mediastinum testis.
En cuanto a la vascularizacin, los testculos estn irrigados por las arterias espermticas (la
arteria deferencial y la arteria funicular). Del drenaje sanguneo estn encargadas las venas
espermticas y cuando se obstruyen producen el varicocele.
A partir de la pubertad, los tbulos seminferos, desarrollan una pared gruesa y compleja
llamada epitelio germinal, compuesta por dos tipos de clulas:
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
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Biologa del Semen
o Por ltimo hay una regulacin sangunea, de forma que la sangre arterial que entra en
los testculos se enfra por la sangre venosa que sale de ellos.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones de la 1 a la 10)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_02.jpg
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04.jpg
B) Vas seminales
Las vas seminales estn constituidas por: tubos rectos, rete testis, conductos eferentes,
epiddimo, conductos deferentes, ampolla deferencial y el conducto eyaculador.
Los extremos terminales de los tbulos seminferos, revestidos slo por clulas de Sertoli, se
estrechan y forman los tubos rectos, los cuales unen el tbulo seminfero con la rete testis.
La rete testis es una red de delicados tbulos, situado en el hilio del testculo, mediastino
testicular, que lleva los espermatozoides desde los tbulos seminferos a los vasos eferentes. En
la rete testis el lquido seminal se reabsorbe, concentrando los espermatozoides.
Los conductos eferentes unen la rete testis con la cabeza del epiddimo.
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
La ampolla deferencial es una dilatacin del conducto deferente, que almacena espermatozoides
durante el coito. Est situada antes del conducto eyaculador.
El conducto eyaculador:
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones de la 22 a la 24)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_03a.jpg
C) Glndulas accesorias
Las glndulas accesorias se refieren a: las vesculas seminales, la prstata, las glndulas
bulbouretrales de Cowper y las glndulas uretrales de Littr. Vierten a las vas seminales el 80%
del volumen del eyaculado. Contribuyen de esta forma muy decisivamente a la formacin del
plasma seminal, cuya funcin es ser: medio nutritivo, vehculo de transporte y proteccin del
tracto urinario.
Las vesculas seminales estn situadas en la base de la prstata y unidas a ella por su extremo
inferior. Cada una est asociada al deferente y al conducto eyaculador. El eyaculado que
segregan se caracteriza por:
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Biologa del Semen
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones 21 y de la 25 a la 28)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_09.jpg
D) Pene
El pene est formado por tres grandes cilindros de tejido erctil, rodeados por una vaina
elstica. Cada cilindro se rellena de sangre durante la excitacin sexual.
o Los dos cilindros superiores, llamados cuerpos cavernosos, son los responsables de la
rigidez e incremento de volumen y longitud durante la ereccin.
o El cilindro inferior, llamado cuerpo esponjoso, acaba en el glande. La uretra atraviesa
el cuerpo esponjoso. Durante la ereccin se mantiene ms blando que los cuerpos
cavernosos.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustraciones 29 y 30)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_10.jpg
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
1.2 Citologa
1.2.1. El espermatozoide
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.htm
(Ilustracin 17)
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#sistema_masculino
A) Cabeza
El ncleo ocupa la mayor parte de la cabeza. Es una masa de DNA haploide que se fusionar con
el ncleo del ovocito en el momento de la fecundacin. Su cromatina se ha condensado
intensamente a fin de disminuir el volumen de la cabeza, lo que facilita la movilidad del
espermatozoide a travs de los diferentes fluidos y estructuras que debe atravesar. Adems
protege al genoma de daos durante el trayecto.
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Biologa del Semen
El cuello es la unin entre la cabeza y el flagelo y es una zona compleja y de gran importancia,
que soporta algunas estructuras esenciales:
El centriolo proximal est situado bajo la placa basal y a la entrada de ese embudo, pero
formando un ngulo de 70-80 grados con el eje del flagelo. Posee la estructura tpica de nueve
tradas tubulares. El par central de microtbulos del axonema flagelar puede llegar por delante
hasta el interior de la pieza de conexin, incluso hasta el centriolo proximal. Generalmente en
los espermatozoides maduros falta el centriolo distal, el orientado segn el eje del flagelo, pero
residuos de sus nueve tripletes pueden estar unidos a la cara interna de las columnas
segmentadas.
En la regin del cuello, y por fuera de la pieza de conexin pueden encontrarse algunas
mitocondrias orientadas longitudinalmente, que a veces emiten prolongaciones que se
extienden entre las columnas segmentadas.
C) Flagelo
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Posee una constitucin interna comn a la mayora de los flagelos del reino animal. En el eje est
el axonema formado por dos microtbulos centrales nicos, rodeados por nueve pares de
microtbulos regularmente distribuidos. Son los microtbulos A y B. Esta estructura se conoce
como axonema 9+2. Cada microtbulo A posee dos brazos en gancho formados por la protena
dineina, la cual puede hidrolizar las molculas de ATP, produciendo la energa necesaria para
impulsar el espermatozoide. Pero el flagelo de los espermatozoides humanos se diferencia de
otros en que el axonema est rodeado por nueve fibras densas externas, lo que lo convierte en
un modelo 9+9+2. Se considera que el axonema es el componente motor y que las fibras densas
externas son estructuras que dan firmeza al flagelo.
o La pieza intermedia mide de 5 a 7 m. El axonema est en esta regin rodeado por las
fibras densas. Se caracteriza por una vaina de mitocondrias orientadas circularmente
y dispuestas extremo con extremo para formar una espiral cerrada. Las mitocondrias
producen la energa necesaria para el movimiento en forma de ATP.
o La pieza principal mide unas 45 m de longitud. El axonema conserva el mismo
aspecto en todo el trayecto pero las fibras densas se modifican, disminuyendo
progresivamente de dimetro y desapareciendo en un orden bien establecido, as por
ejemplo las fibras 3 y 8 se incorporan a las columnas longitudinales de la vaina fibrosa.
o La pieza terminal est formada slo por el axonema, recubierto por la membrana
flagelar. Adems el axonema pierde su disposicin circular para hacerse desordenada.
1.3 Fisiologa
1.3.1. La eyaculacin
En el momento del orgasmo el esfnter interno de la vejiga se contrae, las vesculas seminales se
contraen tambin, lo mismo que los conductos deferentes, el esfnter erctil y la glndula
prosttica. Estas contracciones fuerzan al lquido seminal a fluir a travs de la uretra al
contraerse tambin el propio pene. La actividad contrctil est bajo control de las fibras
adrenrgicas. La ereccin depende sin embargo de impulsos parasimpticos. En el epiddimo
slo la regin distal de la cola experimenta una marcada contraccin bajo el estmulo de las
fibras adrenrgicas de los nervios hipogstricos. Esto evita el paso significativo de
espermatozoides inmaduros durante la eyaculacin.
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Biologa del Semen
o Citrato: es el anin principal y acta como quelante de cationes. Existe una estrecha
correlacin entre las concentraciones de zinc y citrato.
o Zinc: es un catin especfico del plasma seminal dotado de poder bactericida. Su papel
sera estabilizar la condensacin de la cromatina. Es transportado por el citrato y las
protenas.
o Fosfatasa cida: es una enzima activa en la desfosforilacin de los steres ortofosfri-
cos. La isoenzima hallada en el esperma es especfica de la prstata.
b) Marcadores del epiddimo (1 Fraccin del eyaculado)
o L-carnitina
o Est en dos formas en el esperma: L-carnitina y acetilcarnitina.
o Desempea un papel en la adquisicin de la movilidad progresiva, es un
transportador de cidos grasos.
o Es el marcador del cuerpo y la cola del epiddimo, pero no es secretada por las
clulas de la cabeza. Existe una pequea secrecin extraepididimaria del orden
del 15 al 20%.
o 1,4 glucosidasa neutra
o Es una hidrolasa que est en dos formas en el esperma: una forma cida de
origen prosttico y una neutro epididimaria.
o En el epiddimo desempeara un papel en la maduracin de los espermatozoi-
des.
o Slo es segregada en el cuerpo del epiddimo. Existe una dbil secrecin
extraepididimaria, inferior al 10%.
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
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Biologa del Semen
Los espermatozoides de todos los mamferos placentarios son incapaces de fecundar el ovocito
directamente desde el eyaculado, y deben experimentar un proceso en el que se producen
cambios moleculares denominados capacitacin. Los espermatozoides adquieren la capacidad
de fecundar el ovocito despus de haber permanecido durante un tiempo en el tracto genital
femenino.
Una definicin ms exacta seria aquella que describe la capacitacin como la serie de cambios
bioqumicos y fisiolgicos requeridos por el espermatozoide para liberar el contenido acrosomal.
Dichos cambios son tales como:
En condiciones in vivo los espermatozoides mviles se separan del resto del eyaculado por
migracin activa a travs del moco cervical. La capacitacin de los espermatozoides se puede
conseguir in vitro, si son sometidos durante el tiempo necesario, a unas condiciones de cultivo
que faciliten y aporten los cambios y las seales de transduccin de forma semejante a las
condiciones in vivo.
o Reaccin acrosmica.
o Unin a la zona pelucida del ovocito.
o Hipermovilidad.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_17.htm#fecundacion
a) Reaccin acrosmica
El acrosoma es una organela tipo lisosoma localizada en la regin anterior de la cabeza del
espermatozoide por debajo de la membrana plasmtica, como un casquete sobre el ncleo. El
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
acrosoma contiene muchas enzimas que quedan al descubierto con la reaccin acrosmica, que
consiste en la liberacin del contenido acrosomal imediatamente antes de la fecundacin. Esta
reaccin es de exocitosis, la fusin de una vescula intracelular de almacenamiento con la
superficie interna de la membrana celular, seguida de la liberacin del contenido de la vescula.
Esta reaccin requiere la entrada de iones calcio, la salida de iones hidrogeno, un aumento del
pH y la fusin de la membrana plasmtica con la membrana del acrosoma, lo que permite el
contacto con las enzimas y favorece la salida de las retenidas por la membrana interna del
acrosoma. Para que un componente de la zona pelucida del ovocito provoque la reaccin
acrosmica es necesario el contacto del espermatozoide con dicha estructura ovocitaria. Se cree
que este componente es un receptor de glicoproteinas espermticas que tendra una doble
funcin: unirse al espermatozoide e inducir la reaccin acrosmica.
b) Unin espermatozoide-vulo
c) Hiperactivacin espermtica
1.3.4. Espermatogenesis
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Biologa del Semen
La espermatognesis se inicia con la divisin de las clulas madre y finaliza con la formacin de
los espermatozoides maduros. En esta progresin se diferencian tres fases:
a) Fase proliferativa
b) Fase de maduracin
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
consecuencia, los cromosomas, que hasta el momento tenan una sla cromtida,
eran 2n de dotacin gentica, ahora tiene dos, lo que podramos llamar 2nx2.
o Tras el proceso preparatorio se produce la primera meiosis, Meiosis I tambin
llamada reduccional. Como consecuencia un espermatocito primario da lugar a dos
espermatocitos secundarios. Con la Meiosis I pasamos de una clula con dotacin
gentica 2nx2, o sea con 46 cromosomas con dos cromtidas por cromosoma a una
con dotacin nx2, clulas haploides en cuanto al n de cromosomas, pero su
contenido de DNA es diploide ya que tienen dos cromtidas (nx2). La Meiosis I se
divide en cuatro fases: profase, metafase, anafase y telofase. La profase se divide a su
vez en cinco: leptotene, zigotene, paquitene, diplotene y diacinesis. Durante la
profase se produce el fenmeno de apareamiento de cromosomas homlogos
(sinapsis) y el intercambio de material gentico entre ellos (crossing over). Este
fenmeno es muy importante al aumentar la diversidad gentica.
o Tras la Meiosis I o Meiosis reduccional se contina con la Meiosis II o
Meiosis ecuacional. Como resultado final un espermatocito secundario da lugar a dos
espermtides. La dotacin gentica pasa de nx2 del espermatocito a una dotacin
haploide (23 cromosomas) y adems cada cromosoma tiene ya solamente una
cromtida. La meiosis II es un proceso similar a una mitosis, con cuatro fases: profase,
metafase, anafase y telefase.
c) Fase de diferenciacin
o Desarrollo del acrosoma. El aparato de Golgi, del cual deriva el acrosoma, forma
vesculas proacrosmicas que se unen y desplazan junto al ncleo hacia el extremo
apical de la cabeza.
o El desarrollo del flagelo se inicia cuando los centriolos emigran hacia la periferia. Del
centriolo distal se origina el axonema. Conforme se alarga, los centriolos se invaginan
y las mitocondrias se disponen helicoidalmente alrededor del flagelo, formando la
pieza intermedia.
o En cuanto a la reorganizacin del ncleo, este se vuelve elptico, adopta posicin
excntrica, se produce la condensacin de la cromatina y la sustitucin de histonas
por protaminas.
o En la reorganizacin del citoplasma, ste es reducido en su mayor parte, bien porque
es fagocitado por las clulas de Sertoli o bien porque es liberado en el interior de los
tbulos. Puede permanecer unido al espermatozoide durante un tiempo.
La barrera hematotesticular est formada por las clulas de Sertoli, que se extienden desde la
membrana basal hasta la luz de los tbulos seminferos. Estas clulas conectan entre ellas
mediante fuertes complejos de unin, formando un anillo sin solucin de continuidad dentro de
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Biologa del Semen
cada tbulo seminfero. Estos complejos de unin aparecen durante la pubertad, coincidiendo
con el comienzo de la espermatognesis. Durante la espermatognesis las clulas germinales se
van desplazando desde el compartimento basal hasta el adluminal. Esto es posible gracias al
carcter dinmico de la barrera, con aparicin y desaparicin de los complejos de unin. De esta
manera se crea un ambiente nico para el desarrollo de la meiosis y espermatognesis. Por otra
parte las clulas de Sertoli retienen parte del citoplasma de las espermtides que salen a la luz
tubular, formando los cuerpos residuales, que son fagocitados posteriormente.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.udel.edu/biology/Wags/histopage/illuspage/imr/malereproductivesystemppt.
htm (Ilustraciones de la 11 a la 16)
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_05.jpg
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_04b.jpg
La LH se fija a receptores especficos de las clulas de Leydig, activando la adenil ciclasa y esta a
su vez el AMP cclico intracelular, que favorece el transporte de colesterol a las mitocondrias y
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
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Biologa del Semen
o Los factores de crecimiento actan sobre las clulas de Sertoli, clulas de Leydig,
clulas mioides peritubulares y clulas germinales. Intervienen en el crecimiento,
funcin y diferenciacin celulares. Entre ellos encontramos:
o El Factor de crecimiento fibroblstico.
o El Factor transformador de crecimiento.
o La Sustancia inhibidora Mulleriana.
o El Factor de crecimiento nervioso beta.
o Los factores de crecimiento plaquetarios.
o El factor de crecimiento secretado por clulas de Sertoli.
o Las Citocinas.
o La Activina.
o Y la Inhibina que merece especial atencin. Se trata de un pptido no esteroideo.
La mayor parte pasa a tbulos, se reabsorbe en Rete Testi y pasa a sangre. Acta
frenando la secrecin de FSH por la hipfisis y la hormona liberadora de
gonadotropinas en el Hipotlamo. A nivel local restringe la accin de la FSH en el
testculo.
Haciendo un compendio de la regulacin hormonal:
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Ilustraciones recomendadas:
http://www.uaz.edu.mx/histo/TortorAna/ch28/28_07.jpg
1.4 Patologa
Segn el 5 manual de OMS, la esterilidad no debe tratarse como un problema individual, sino
que es un problema de pareja.
o Se entiende por estril la pareja que tras 12 meses de relaciones sexuales sin mtodos
anticonceptivos, no queda gestante.
o Infrtil es aquella pareja que presenta incapacidad para llevar a trmino las
gestaciones. Se embarazan, pero abortan.
Hoy da la situacin ms frecuente entre las parejas que acuden a la consulta es de
subfertilidad, y se entiende como una probabilidad disminuida de conseguir un hijo vivo.
Cuando se estudian las causas se pueden encuadrar en cuatro tipos: factor femenino, factor
masculino, factor mixto y la esterilidad de causa desconocida. El factor masculino oscila en estos
aos en unas cifras en torno al 35%.
Cualquiera que fuere su grado de especializacin, la buena ejecucin de todos estos exmenes
ser esencial para lograr una actuacin teraputica adaptada y eficaz.
A) Azoospermia
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Biologa del Semen
1. Cuestionario
El cuestionario permite la investigacin de los factores de riesgo de la infertilidad. Tiene que ser tan
completo como sea posible, ya que, excepto causas especficas, no olvidar que una patologa
general puede repercutir en la espermatognesis. Hay que considerar:
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
2. Examen clnico
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Biologa del Semen
B) Vasectoma y vasovasostoma
La vasectoma est considerada como uno de los mtodos ms efectivos y populares de control
de la natalidad. Esta tcnica es de eleccin, sobre todo para parejas estables que ya tienen hijos
y no desean tener ms. La incorporacin de nuevas tcnicas quirrgicas que han sustituido la
mera ligadura y sutura del conducto deferente, ha aumentado la eficiencia de la vasectoma, que
se considera el mejor mtodo anticonceptivo. La evidencia cientfica actual considera el anlisis
de semen como la mejor metodologa de valoracin de la efectividad de la tcnica quirrgica, ya
que hay que considerar que existe un riesgo bajo, pero no nulo, de complicaciones o de que se
recanalice el conducto seccionado.
La vasectoma es una operacin simple que tiene una duracin media de 30 minutos y que se
realiza en el mbito ambulatorio, con la utilizacin de anestesia local. Tiene como fundamento la
oclusin quirrgica de los conductos deferentes. Inmediatamente despus de la vasectoma,
todas las eyaculaciones pueden contener en teora espermatozoides potencialmente frtiles, por
lo que se debe aconsejar continuar con otros mtodos anticonceptivos hasta que se demuestre
la eficacia de la intervencin. La experiencia del cirujano, junto con el nmero de
vasectomas/ao que realice, ha demostrado ser el factor ms importante en el xito de la
operacin y la posible aparicin de complicaciones.
La recanalizacin espontnea puede ser precoz (antes de los 4 meses) o tarda. La recanalizacin
precoz presenta una incidencia entre 0,36-0,75% segn los diferentes estudios y una posterior
paternidad de 0-0,08% y la tarda presenta una incidencia aun menor del 0,1%. Todo paciente
que vaya a ser sometido a una vasectoma debe ser informado por el clnico de estos datos.
Debe existir un equilibrio entre la realizacin del anlisis de los controles que demuestren la
eficacia de la tcnica y el tiempo de espera para realizar el primer control, ya que si ste se
realiza demasiado pronto, se puede tener un elevado nmero de falsos positivos (varones con la
vasectoma bien realizada que presentan espermatozoides mviles en el eyaculado). Los
espermatozoides residuales pierden capacidad de fecundacin entre los 3-8 das despus de la
intervencin y se encuentran inmviles transcurridos 15 das. El 97% de los pacientes presentan
una azooospermia a los 4 meses de la intervencin, el 3% restante puede presentar
espermatozoides residuales hasta 12 meses despus, asociado probablemente a un mayor
reservorio del tracto urogenital; aunque numerosos estudios aseguran que en estos pacientes
esto no implica un mayor riesgo de gestacin que la azoospermia. Se estima que existe un 16%
de pacientes operados que no realizan ningn tipo de control tras la vasectoma.
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
comporta una mayor complejidad y unos resultados ms pobres. La experiencia del cirujano y la
tcnica de microciruga empleada es un factor importante.
Se han descrito una tasa de recuperacin testicular y posterior paternidad entre el 30-65% de los
intervenidos, en funcin de los aos transcurridos desde la vasectoma. La realizacin de una
epiddimo-vasostoma est indicada cuando han transcurrido ms de 10 aos de la vasectoma.
Una alternativa actual que se debe plantear despus del fracaso de la vasovasostoma, es la
utilizacin de tcnicas de reproduccin asistida (ICSI) a partir de espermatozoides obtenidos por
aspiracin de espiddimo o biopsia testicular.
24
Preanaltica
Captulo 2
Preanaltica
Un anlisis de semen correcto se debe realizar sobre una muestra de semen completa:
o La primera parte del eyaculado aporta las secreciones del testculo-epididimo (en esta
fraccin estn los espermatozoides) y las secreciones de la prstata.
o La segunda parte corresponde a las secreciones de vesculas seminales.
Por tanto, si se derrama una fraccin de la primera parte, al faltar parte de los espermatozoides
obtendremos una concentracin irreal, ms baja; y si se derrama una fraccin de la segunda, la
fraccin que aporta ms volumen, lo que ocurrir es que obtendremos un volumen ms bajo y
una concentracin espermtica ms alta. En consecuencia, una muestra incompleta debe ser
desechada.
25
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
C) Abstinencia sexual
En un estudio de 11 individuos que recogieron 4 muestras en 8 das (De Jonge et al., 2004;
Carlsen, Jorgen, Andersson & Niels, 2004), se observ que la abstinencia entre 1 y 8 das no
influye en la movilidad, en la morfologa, en la vitalidad ni en el pH, pero s en las
determinaciones de volumen y concentracin, que van aumentando a lo largo de los ocho das.
Por otra parte, parece que el periodo de abstinencia de la penltima eyaculacin podra
condicionar los valores de la ltima, siempre que una eyaculacin no consiga vaciar los depsitos
del epiddimo. Sin embargo, cuantificar en qu medida influye es difcil, por lo que la OMS no lo
incluye dentro de las normas a seguir en su ltimo manual.
D) Variabilidad biolgica
En otro estudio en el que participan 52 individuos a lo largo de 540 das, se puede apreciar que
hay unos considerables saltos en la concentracin espermtica, as como en el nmero total de
espermatozoides por eyaculacin, en algunos individuos se observan valores por debajo de la
normalidad.
Se puede concluir que es imposible caracterizar a un individuo con un solo anlisis de semen y
que es necesario realizar 2-3 anlisis para estudiar el estado basal de un individuo.
E) Frmacos
Podemos encontrar gran cantidad de principios activos que van a afectar la calidad seminal,
actuando a diferentes niveles.
o Antipsicticos (fenotiazidas)
o Antidepresivos
o Antihipertensivos (alfametildopa)
o Antihistamnicos
o Andrgenos, esteroides anabolizantes
o Antiulcerosos (ranitidina, cimetidina)
o Espironolactona
o Nitrofurantona
o Colchicina
o Quimioterapia
26
Preanaltica
o Sulpiride
En el caso de que el tratamiento se prolongue en el tiempo y/o que los efectos sean
irreversibles, como en la quimioterapia, es recomendable que se conserven los espermatozoides
en un banco de semen.
F) Txicos
ltimamente se ha descubierto que hay multitud de factores ambientales que actan como
disruptores endocrinos. Son sustancias que tienen accin estrognica o antiestrognica. Actan
en las primeras fases del desarrollo fetal, en los periodos pre o perinatal, pero sus efectos son de
aparicin tarda, pudiendo aparecer incluso en generaciones posteriores. Algunos autores
opinan que los disruptores endocrinos son los causantes del llamado Sndrome de disgenesisa
testicular, que cursa con: aumento de criptorquidia e hipospadias, aumento de cncer de
testculo y descenso en la calidad seminal.
La lista de sustancias descritas es muy amplia, pero vamos a destacar algunas para que veamos
en qu medida convivimos con ellas peligrosamente de forma ms habitual de lo que
imaginamos:
H) Duracin de la espermatognesis
Otro de los factores que se ha de tener en cuenta cuando se estudie la calidad seminal es que
cualquier intervencin sobre el testculo necesitar al menos 75 das (2 meses y medio) para
ponerse en evidencia. Esto es as porque la espermatognesis del hombre dura eso, 75 das. Por
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
I) Otros
o Ejercicio fsico
o Fiebre
o Estrs
o Exposicin a altas temperaturas.
A) Instrucciones
o Lugar de recogida.
o Forma de recoger la muestra.
o Contenedores de recogida.
o Medidas higinicas.
o Abstinencia.
o Tiempo recogida-entrega laboratorio.
o Normas de transporte al laboratorio, si se recoge en casa.
o Medicacin.
B) Forma de recogida
28
Preanaltica
C) Abstinencia sexual
La OMS recomienda una abstinencia entre dos y siete das. Adems aconseja que en caso de
repeticin se mantengan los tiempos de abstinencia para hacerlo de esta forma en las mismas
condiciones y evitar la variabilidad.
Recordemos adems que se recomiendan entre 2 y 3 anlisis para fijar el estado basal de un
individuo, si bien algunos autores son de la opinin que si el primer anlisis es normal no es
necesario volver a repetir.
D) Contenedores de recogida
Los contenedores de recogida que utilicemos deben ser de cristal o plstico. Adems deben
estar testados para comprobar que el material no es txico. Antes de la recogida de la muestra
hay que mantenerlos atemperados entre 20-37C.
E) Recogida de datos
Cuando la muestra es entregada debe ser rotulada: con nombre y apellidos, y con el cdigo de
laboratorio. Inmediatamente despus debe ser guardada en estufa a 37C.
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
A) Anlisis microbiolgico
En el caso de que la muestra vaya a usarse para anlisis microbiolgico tenemos que tener en
cuenta que:
o Cuando se trate de una recogida de muestra para una prueba diagnstica no tendr
mayor importancia. Trataremos de tranquilizar a nuestro paciente, recomendndole
dar una vuelta antes de intentarlo de nuevo. Si el bloqueo persiste se recomendar la
recogida de la muestra en casa.
o El problema surge cuando el anlisis de semen va encaminado a evaluar una muestra
que debe ser utilizada posteriormente para tcnicas de reproduccin asistida, donde
la recogida no puede dilatar ms all de unas cuantas horas. Si los mtodos anteriores
no dan resultado habr que recurrir a la administracin de frmacos, tales como
levitra, Cialis o Viagra.
30
Preanaltica
C) Eyaculacin retrgrada
Otro caso de recogida especial es cuando ocurre una eyaculacin retrgrada, donde la
eyaculacin de la muestra en lugar de seguir la va habitual a travs de la uretra asciende hasta
la vejiga atravesando el orificio uretrovesical.
Hay que sospecharlo en pacientes con un volumen de muestra bajo, menos de 1 ml, incluso con
ausencia de eyaculado, lo que se conoce como aspermia. Es frecuente en diabticos, en lesiones
medulares y enfermedades neurolgicas.
En estos casos podemos recuperar los espermatozoides de la orina y utilizarlos para alguna
tcnica de reproduccin asistida, bien inseminacin o fecundacin in vitro. Para ello es necesario
alcalinizar primero la orina, cuyo pH es cido, con objeto de conseguir que los espermatozoides
sean viables. El protocolo es el siguiente:
D) Anlisis postvasectmicos
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
http://nuevo.sefertilidad.com/consentimientos/pdf2008/04.pdf
2.4 Transporte
El manual de la OMS de la 5 edicin recomienda que la recogida de la muestra se haga cerca del
laboratorio, para controlar fluctuaciones de temperatura y tiempo al comienzo del anlisis. Pero
si no se puede hacer de esta forma hay que ofrecer la posibilidad de recoger la muestra en casa,
siempre que se cumpla que:
2.5 Recepcin
Segn nos indica el manual de la OMS, el anlisis hay que realizarlo preferiblemente antes de
transcurridos 30 minutos desde la recogida de la muestra. Nunca debe retrasarse ms de una
32
Preanaltica
Los espermatozoides humanos presentan bajo contenido en agua por su pequeo tamao,
matriz viscosa con alto contenido en protenas y azcares, y una estructura
compartimentalizada. El dao producido en el espermatozoide por la congelacin y posterior
descongelacin tiene lugar a distintos niveles estructurales y/o funcionales, por lo que todava
no existe un mtodo de criopreservacin espermtica universalmente aceptado que logre
mejores tasas de criosupervivencia. El proceso de congelacin afecta sobre todo a la movilidad
espermtica, no existiendo parmetros espermticos en el anlisis inicial que nos permitan
correlacionarlos positivamente con la supervivencia.
En el territorio del Estado Espaol la criopreservacin seminal est definida, en la Ley 14/2006
sobre Tcnicas de Reproduccin Humana Asistida, como una tcnica especfica de los
establecimientos acreditados para Reproduccin Humana Asistida, y dentro de ellos los que lo
estn como Banco de Gametos. Cualquier laboratorio que quiera criopreservar semen deber
solicitar la correspondiente acreditacin como banco de gametos. Es una actividad que requiere
acreditacin especfica, no siendo suficiente con la solicitada para las actividades habituales de
laboratorio.
A) Muestras
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Todo el material fungible empleado as como los medios de cultivo y de congelacin deben ser
estriles y manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar; adems deben
estar testados para toxicidad espermtica y tener certificacin CE.
Medios de congelacin
Los medios de congelacin tienen como objetivo proteger a las clulas del choque producido por
el enfriamiento a temperaturas por debajo de 0C, que es uno de los factores ms importantes
que afecta a la supervivencia espermtica.
34
Preanaltica
C) Mtodos de congelacin
35
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Con el objetivo de cumplir la normativa que establece el RD 1301/2006 (trazabilidad en todos los
procesos que conlleva la congelacin y almacenamiento de semen), es fundamental el control
exhaustivo de la velocidad y la temperatura de la muestra en cada momento, por lo que
actualmente se recomienda la utilizacin de congeladores programables ms que otros mtodos
clsicos como la congelacin en vapores de nitrgeno lquido o la congelacin en pldoras en
molde de hielo seco.
36
Preanaltica
Tiene la ventaja de no necesitar congelador programable, pero las condiciones del proceso estn
poco estandarizadas.
Realizar todo el proceso como el protocolo anterior hasta el paso 9, y una vez rellenadas y
desinfectadas las pajuelas, colocarlas en un contenedor con nitrgeno lquido aproximadamente
a 10 cm. de la superficie del mismo durante 30 minutos (un contenedor con una rejilla para
depositar horizontalmente las pajuelas es adecuado). Una vez terminado el proceso de
congelacin, seguir el protocolo anterior desde el paso 11 para introducir las pajuelas en la
unidad y en el sistema de almacenamiento.
37
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Conservacin
Entrega de instrucciones y
Transporte Recepcin hasta su
contenedor
procesamiento
1 semana antes
Fertilidad y capacitacin
1) SEMEN EN CONTENEDOR
CUANDO
Si espermiograma previo IDENTIFICAR
(fertilidad), Nombre,apellidos
3 meses despus. N Laboratorio.
Si vasovasostoma,
6 meses despus. PASAR A CONSERVACIN.
Abstinencia
2-7 das. 2) CUESTIONARIO
30 minutos,
MTODO Inmediato, CONFIRMAR
mximo 1h.
Masturbacin. mximo 1h Totalidad de la muestra.
37C
Si no, con preservativo 22-37C Masturbacin (o preservativo).
Rotacin.
sin espermicida. Protegido de Slo una eyaculacin.
la luz. Abstinencia 2-7 das.
CONTENEDOR Si espermiograma previo: 3
Plstico o vidrio, no meses de diferencia.
txico, 20-37C. Si vasovasostoma: anotar
fecha de operacin, y muestra
LUGAR 6 meses despus.
Lo ms prximo al
laboratorio. ANOTAR
A 1 hora mximo. Medicacin.
Hora de recogida de la muestra.
Hora de entrega al laboratorio.
Tabla 1. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
38
Preanaltica
Entrega de
Conservacin
Instrucciones y
Transporte Recepcin hasta su
contenedor
procesamiento
1 semana antes
Cultivo
MTODO 1) SEMEN EN CONTENEDOR
1) Lavar y aclarar
genitales y manos. IDENTIFICAR
2) Orinar. Nombre,apellidos
3) Lavar y aclarar N Laboratorio.
genitales y manos.
4) Masturbacin. PASAR A CONSERVACIN.
Inmediato, Mximo 3 h
CONTENEDOR 2) CUESTIONARIO
mximo 1h 2-8C.
Plstico o vidrio,
2-8C. CONFIRMAR
estril.
Medidas higinicas, orinado y
LUGAR lavado previos.
Lo ms prximo al Por masturbacin.
laboratorio.
A 1 hora mximo. ANOTAR
Hora de recogida de la muestra.
Hora de entrega al laboratorio.
Bloqueos
PARA DIAGNSTICO
1) Despejarse
2) Si persiste, recoger en casa.
El que corresponda. - -
PARA FIV
1) Despejarse
2) Levitra, Cialis o Viagra
Tabla 1 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
39
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Entrega de
Conservacin
Instrucciones
Transporte Recepcin hasta su
Y contenedor
procesamiento
1 semana antes
Eyaculacin retrgrada
1) LTIMA ORINA EN
PREPARATIVOS
CONTENEDOR
Abstinencia
2-7 das.
IDENTIFICAR
Noche previa:
Nombre,apellidos
Ingerir 2 g NaHCO3
N Laboratorio.
MTODO
PASAR A
Recoger orina: 0h. En el
CONSERVACIN
laboratorio determinan
Osmolaridad y pH.
2) CUESTIONARIO
Ingerir 4 g NaHCO3
Recoger orina:
Inmediato. CONFIRMAR Procesamiento
cada 15 hasta que el
22C Abstinencia inmediato
laboratorio diga si la
2-7 das.
Osmolaridad y pH son
Noche previa
adecuados.
2 g NaHCO3
Orgasmo.
Recogida de orina
Recoger orina.
tras alcalinizacin y
orgasmo.
CONTENEDOR DE LTIMA
ORINA
ANOTAR
Frasco con 10 ml de
Medicacin.
medio de cultivo.
Hora de recogida de
la muestra.
LUGAR
Hora de entrega al
Prximo al laboratorio.
laboratorio.
Tabla 1 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
40
Preanaltica
Entrega de
Conservacin
Instrucciones
Transporte Recepcin hasta su
Y contenedor
procesamiento
1 semana antes
Postvasectoma
1) SEMEN EN CONTENEDOR
IDENTIFICAR
CUANDO Nombre,apellidos
N Laboratorio.
Control 1)
4 meses despus de PASAR A CONSERVACIN
vasectoma.
Control siguiente: 2) CUESTIONARIO
4 semanas despus
del previo. CONFIRMAR
Abstinencia Totalidad de la muestra.
Inmediato, 30 minutos,
2-7 das. Por masturbacin.
mximo 1h mximo 4h
Slo una eyaculacin.
22-37C 22-37C
MTODO Abstinencia 2-7 das.
Masturbacin.
Protegido de la Si Control 1)
Rotacin.
luz. 4 meses dp de vasectoma.
CONTENEDOR Si Control sig)
Plstico o vidrio. 4 semanas dp del previo.
LUGAR ANOTAR
Lo ms prximo al Fecha de vasectoma y del
laboratorio. control previo.
A 1 hora mximo. Medicacin.
Hora de recogida de la
muestra.
Hora de entrega al
laboratorio.
Tabla 1 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
41
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Entrega de
Instrucciones Conservacin
Transporte Recepcin
Y contenedor Hasta su procesamiento
1 semana antes
Criopreservacin
1) SEMEN EN 1) 30a 37C rotacin.
CONTENEDOR 2) Alcuota semen.
3) Atemperar el medio de
IDENTIFICAR congelacin.
PREPARATIVOS
Nombre,apellidos 4) Medir volumen de semen.
Medicacin
N Laboratorio. 5) Calcular n pajuelas,
(3 meses desde
quimioterapia) identificar
PASAR A 6) Aadir medio congelacin: 1
Abstinencia CONSERVACIN
2-7 das gota en 5, movimiento.
Leer y firmar 7) Llenado con 1 ml semen.
2) CUESTIONARIO 8) Sellar.
Consentimiento
informado. 9) Desinfectar el exterior
CONFIRMAR pajuela.
Inmediato Totalidad de la
MTODO 22-37C muestra. OPCIN CONGELADOR
Masturbacin. Por masturbacin. PROGRAMABLE
Slo una eyaculacin. 10a) Ciclo congelacin:
CONTENEDOR
Abstinencia T amb4C-80C-160C-196C
Plstico o vidrio. Sumergir visotubo en N2(l) y
2-7 das.
Si quimioterapia, 3 pajuelas.
LUGAR
meses despus.
Lo ms prximo OPCIN MANUAL
al laboratorio. 10b) Colocar las pajuelas en
ANOTAR
A 1 hora mximo.
Medicacin. contenedor de N2(l) a 30 cm de
Hora de recogida de superficie, 30
la muestra. 11) Pajuela control.
Hora de entrega al 12) Tarjeta identificativa y
laboratorio. registro.
Tabla 1 continuacin. Procedimiento de laboratorio para la recepcin de muestras de semen
42
Evaluacin inicial del semen
Captulo 3
A) Licuefaccin
La licuefaccin se realiza mediante una simple observacin visual. Una muestra normal es una
muestra licuada, homognea, sin grumos ni cogulos.
Sin en embargo cuando se eyacula el semen se trasforma en una masa semislida coagulada, es
a los pocos minutos cuando el semen comienza a licuarse y homogeneizarse, a veces se
encuentran hilos de moco y cuerpos gelatinosos. No tienen ninguna importancia clnica, pero
dificultan el anlisis ya que son artefactos que pueden obturarnos una pipeta o impedir una
buena colocacin de un cubreobjetos sobre el porta. Hay que intentar separarlos de la muestra a
la hora de recoger alcuotas para las diferentes determinaciones.
Si tenemos dudas con una simple observacin visual siempre nos queda el recurso de observar la
muestra al microscopio, donde tendremos la tpica imagen de una muestra no licuada, con
manchas que recuerdan a acmulos de grasa.
43
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Cuando la muestra no lica en 60 minutos hay que recurrir a algn mtodo que nos permita
licuarla y homogenizarla porque slo de esta forma obtendremos resultados fiables.
o El primer mtodo consiste en aadir una solucin de bromelina, que es una enzima
proteoltica que producira la licuefaccin. Esto no se puede hacer en muestras
destinadas posteriormente a reproduccin asistida, ya que estn destinadas a
ponerse en contacto con gametos femeninos. Por otra parte, al aadir bromelina se
puede afectar la movilidad, las determinaciones de bioqumica y de morfologa. Slo
debemos usarla para calcular la concentracin espermtica.
o Otro sistema sera diluir la muestra con igual volumen del tampn fosfato PBS.
o El tercer sistema sera el ms sencillo. Consiste en pasar la muestra por una jeringa
dotada de aguja roma con un calibre de 18-19. Hay que actuar con cuidado para no
formar burbujas que afectaran a nuestros resultados.
B) Viscosidad
No hay que confundir una muestra viscosa con una muestra no licuada. El aspecto de la muestra
puede ser lquido, homogneo y luego hacer un gran filamento cuando la recogemos con pipeta
pasteur, en el caso de ser muy viscosa.
Para eliminar la viscosidad se realizan los mismos tratamientos que en el caso anterior de falta
de licuefaccin.
C) Apariencia
o A veces puede tener un aspecto traslcido; ello es debido a que posiblemente tenga
una baja concentracin de espermatozoides.
44
Evaluacin inicial del semen
Para la medida del volumen el manual de la OMS nos describe dos mtodos.
45
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
E) pH
Respecto a la realizacin tcnica debemos usar tiras de papel pH graduacin 6-10. Chequear el
color antes de 30 segundos. Situamos la muestra sobre el papel y antes de transcurrido ese
tiempo debemos hacer la lectura. Chequear tiras reactivas con soluciones patrn de pH para
asegurar la buena calidad de nuestro resultado.
En la evaluacin microscpica realizamos en primer lugar una observacin a 100x, usando para
ello un ocular 10x y objetivo 10x. En esta primera observacin vamos a estudiar las
agregaciones, las aglutinaciones y por ltimo las clulas no espermticas.
Pasaremos luego a colocar un objetivo 20x o 40x. La observacin a 200x o 400x nos permite
hacer la estimacin de la dilucin que necesitamos para calcular la concentracin espermtica, y
tambin el estudio de la movilidad espermtica.
Se vuelve a recordar que la muestra debe estar atemperada a 37C y que adems debe estar
bien homogenizada. Para ello, tal y como dijimos anteriormente lo ideal es colocar un agitador
46
Evaluacin inicial del semen
orbital dentro de la estufa. Otro mtodo alternativo que nos indica el manual de la OMS es por
aspiracin 10 veces de la muestra con pipeta de plstico de 1,5 mm de dimetro.
A) Observacin a 100X
Agregaciones
Aglutinaciones
47
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
PARTES GRADOS
Cabeza-
Cabeza
Flagelo-
Flagelo
Punta-
Flagelo
Cabeza-
Cabeza +
Flagelo-
Flagelo
Cabeza-
Flagelo
Clulas no espermticas
El eyaculado contiene otras clulas y su identificacin puede ser clnicamente relevante. Son las
llamadas clulas no espermticas, que incluyen a clulas epiteliales y clulas redondas. El
nombre genrico de clulas redondas engloba a clulas germinales inmaduras y a leucocitos.
Diferenciar las clulas epiteliales de las clulas redondas es relativamente fcil, ya que se trata
de clulas muy diferentes en morfologa. La misma tincin que usaremos en morfologa, Diff
Quick, las diferencia claramente. Sin embargo, diferenciar con este tipo de tinciones las clulas
de la espermatognesis de los leucocitos no resulta fcil en la mayora de los casos, es necesario
recurrir a pruebas especficas como las de actividad de peroxidasa o a anticuerpos frente al
antgeno CD45; la de la peroxidasa es la ms comn, y ser la que estudiaremos ms adelante.
48
Evaluacin inicial del semen
Movilidd
La clasificacin de los tipos de movilidad que introduce el quinto manual de la OMS ha supuesto
un gran cambio con relacin a manuales anteriores. En estos se diferenciaba la movilidad
progresiva en lenta y rpida, establecindose el punto de corte de los dos en una velocidad de
25 micras por segundo. En este nuevo manual se unifican en un solo tipo de movilidad, la
movilidad progresiva, quedando por tanto slo tres tipos de movilidad (Ilustracin 2):
Tambin ha habido cambios en los valores de referencia. El quinto manual establece el lmite
inferior de referencia para la movilidad total en 40% (38%-42%), y para la movilidad progresiva
32% (31%-34%).
49
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
o Se debe contar siempre a una distancia de los bordes mayor de 5mm con objeto de
prevenir artefactos. A partir de esa distancia y conforme nos acerquemos al borde, el
movimiento ir disminuyendo hasta encontrar slo espermatozoides inmviles.
(Ilustracin 3B).
o Se debe hacer un doble contaje, para ello habr que preparar dos portaobjetos.
o Al menos hay que contar 5 campos en cada uno de estos portaobjetos.
50
Evaluacin inicial del semen
o Hay que contar al menos 200 espermatozoides por porta. Si no se consigue contando
5 campos, se deber seguir hasta alcanzar ese nmero de 200.
Ilustracin 4. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos porcentajes
Tabla 3. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de
200 spz (400 spz)
Posteriormente hay que evaluar los resultados utilizando la grfica (ilustracin 4) y la tabla 3 del
intervalo de confianza del 95% para diferencias entre los dos porcentajes. Esto equivale al
mximo error esperado entre dos contajes en el 95% de los casos cuando el nico error es el
atribuible al contaje. Si el error es mayor habr que hacer dos nuevas preparaciones y empezar
de nuevo.
51
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
52
Estudio bsico del espermiograma
Captulo 4
4.1 Recuento
Material necesario:
53
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
La dilucin se hace tomando como base el diluyente Weigman. El diluyente al estar preparado
con formol inmovilizar los espermatozoides y nos permitir contarlos ms fcilmente, cosa que
no ocurre con otro tipo de mtodos que cuentan espermatozoides vivos. Se aade
posteriormente el semen usando la pipeta de desplazamiento directo. La dilucin debe estar
perfectamente homogenizada, usando si es posible un agitador tipo vortex.
Cmara de contaje
La OMS recomienda cmaras que tengan al menos 100 micras de profundidad y que permitan el
contaje con muestras fijadas, sin movimiento. Sin embargo no recomienda, lo cual no quiere
decir que prohba:
La cmara esta subdividida en dos subcmaras, lo que nos va a permitir el doble de contaje de
forma ms rpida (ilustracin 5A).
54
Estudio bsico del espermiograma
Cada una de las dos subcmaras tiene 9 rejillas, cada una de las rejillas tiene 100 nl de volumen.
Por tanto, el total de la cmara es de 900 nl (ilustraciones 5B). Cada rejilla est formada por
cuadros que llamaremos grandes, agrupados en filas. A su vez, cada cuadro grande est dividido
por una triple lnea en cuadros que llamaremos pequeos. Centrndonos en la 5, sta tiene
25 cuadros grandes y cada uno de ellos est dividido en 16 cuadros pequeos (ilustraciones 5C,
5D).
VOLUMEN/CUADRO VOLUMEN/FILA
N CUADROS N
N DE REJILLA 100 nl/ n cuadros g 100 nl/ n filas
GRANDES FILAS
nl nl
4,6 20 5 5 20
2,8 20 5 4 25
1,3,7,9 16 6,25 4 25
5 25 4 5 20
Mtodo de recuento
o Se ha de llenar la cmara de Neubauer improved con cada una de las dos diluciones
que hemos preparado.
o Se deja 5 minutos de reposo en cmara hmeda para que los espermatozoides se
asienten.
o Contar en la rejilla 5 hasta 200 espermatozoides. (Ilustracin 6A)
o Si no se completan los 200 espermatozoides contar en la 4, y si tampoco se
completasen, seguir en la 6.
o Contar siempre filas completas. Si se llega a 200 contar toda la fila.
o Para diluciones al seguir contando las 9 rejillas.
o Apuntar el nmero de espermatozoides y las filas contados.
o Respecto a la triple lnea que separa los cuadrados grandes, se ha de tener en cuenta
lo siguiente (Ilustracin 6B):
o La lnea media muestra el cuadrado relevante.
o Contar todos los espermatozoides que estn dentro del cuadro central.
o Contar cuando la cabeza cae dentro.
55
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Una vez contados al menos 200 espermatozoides en cada una de las dos cmaras debemos
evaluar los resultados. Como chequeo se calcula la suma y diferencia de los dos contajes y se
compara con la grfica (ilustracin 7) o tabla 6 que recoge el intervalo de confianza del 95% para
diferencias entre dos contajes; que corresponde a la diferencia esperada en el 95% de muestras
slo por error estadstico de contaje. Mayores diferencias sugieren: error de dilucin, de contaje,
o una distribucin no homognea de espermatozoides en la dilucin.
56
Estudio bsico del espermiograma
Ilustracin 7. Grfica del intervalo de confianza del 95% para dos recuentos
Tabla 6. Diferencias aceptables entre dos porcentajes, calculados a partir de dos recuentos de
200 spz (400 spz)
Si hemos contado 400 espermatozoides totales, el lmite mximo de diferencia entre los dos
contajes es de 39, si la diferencia superara el lmite permitido habra que empezar desde el
principio, preparando dos nuevas diluciones y realizando de nuevo el doble contaje.
Clculo final
o Para diluciones 1/5, 1/20, 1/50, en las que se han contado las filas de los cuadros 5, 4,
6, de las dos subcmaras, se ha de tener en cuenta el volumen correspondiente de
cada fila (tabla 5):
57
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
El resultado final se da con dos cifras significativas: si es menor de 10 se da el nmero entero con
un decimal; si es igual o mayor de 10 slo se da el nmero entero.
El manual de la OMS establece el valor conocido como lmite inferior de referencia para la
concentracin y para el contaje total de espermatozoides como sigue.
58
Estudio bsico del espermiograma
MTODO 400X
Porta + cubre 22x22 Neubauer improved
MUESTRA 10 l semen 50 l semen + 950 l dil. Weigman
1 2 3 4
Dil. Dil. Dilucin Dilucin
RECUENTO 170 spz/campo
1 1 Subcmara 205
2 Subcmara 253
Suma 458
Diferencia 48
Valoracin No vlido
2 1 Subcmara 215
2 Subcmara 232
Suma 447
Diferencia 17
Valoracin Vlido
Clculo C = (447/5)x(1/20)x20
= 89 millones spz / ml
o Una muestra con criptozoospermia suele ser vlida para realizar la tcnica de
reproduccin asistida ICSI.
o Sin embargo, la nica posibilidad de poder realizar esa tcnica en un paciente con
azoospermia es recurrir a una biopsia de testculo. Tras tratamiento de la pieza
biopsiada se estudia la existencia o no de espermatozoides, que tras ser aislados nos
servirn para nuestra tcnica de ICSI.
En teora slo seran candidatas a biopsia de testculo y posterior ICSI las azoospermias
obstructivas. Sin embargo la popularizacin de la tcnica de biopsia de testculo ha demostrado
que en la mayora de azoospermias secretoras existen algunos focos de tbulos seminferos con
espermatognesis funcional y por tanto estos pacientes son tratados como si fuera una
azoospermia obstructiva.
59
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
En las azoospermias con volumen seminal muy bajo hay que descartar la existencia de una
eyaculacin retrgrada. En este caso los espermatozoides eyaculados en lugar de seguir la va
habitual son vertidos a la vejiga a travs del orificio uretrovesical. Es importante conocerlo
porque la recuperacin de esos espermatozoides posibilita la realizacin de tcnicas de
reproduccin asistida.
Si tienen o no movilidad
A veces es importante saber si adems los espermatozoides son mviles. Por ejemplo si los
necesitamos para hacer una ICSI, en la cual slo trabajamos con espermatozoides mviles. Al
igual que en el caso anterior:
60
Estudio bsico del espermiograma
o Si se observan 0 espermatozoides:
El intervalo de confianza del 95% del valor 0 es 0 y 3,7, quiere esto decir que el
95% de las veces que contemos 0 el valor estar comprendido entre 0 y 3,7. El
error asociado a un contaje de 3,7 es el 52%. La concentracin de
espermatozoides cuando se cuentan 3,7 espermatozoides por el mtodo ya
descrito es 4100 spz/ ml.
61
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
La cmara Leja es desechable, est dividida en dos subcmaras, cada una de las cuales tiene
100 micras de profundidad y un volumen de 25000 nl.
Procedimiento
62
Estudio bsico del espermiograma
empleado, que es de 1000 spz/ ml. Se informa por tanto que la concentracin es
menor de 1000 spz/ ml.
o Si se observan 0 espermatozoides:
4.2 Morfologa
63
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
64
Estudio bsico del espermiograma
Interpretacin de la morfologa
Un espermatozoide debe cumplir los siguientes criterios estrictos (Kruger) en cada una de sus
partes para considerarse normal. Ilustracin 9.
o Cabeza:
o Forma oval.
o Longitud 3,7-4,7 micras.
o Anchura 2,5-3,2 micras.
o Relacin longitud/anchura 1,3-1,8.
o Acrosmica 40-70% de la cabeza.
o Pieza intermedia:
o Anchura <1 micra.
o Longitud 1 y cabeza.
o Unin axial a la cabeza.
o Gotas de restos citoplasmticos <1/3 de la cabeza.
o Flagelo:
o Recto o no presentar angulaciones bruscas que sugieran rotura.
o Longitud 45 micras.
o Restos citoplasmticos:
o El rea de los restos citoplamsticos debe ser menor a 1/3 de la cabeza.
65
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
o Defectos especiales:
o Flagelos sueltos.
o Cabezas sueltas.
o Sndrome de globozoospermia: todos los flagelos carecen de acrosoma. Los
espermatozoides son incapaces de fertilizar ovocitos in vivo, debi a la
imposibilidad de penetrar a travs de sus envolturas. Como alternativa se
propone realizar la ICSI, microinyeccin intracitoplasmtica de espermatozides, y
usando inductores de la activacin tales como ionforos del calcio.
Los flagelos y cabezas sueltas no se cuentan (ilustracin 6B), al igual que en la
concentracin, sin embargo las cabezas sin acrosoma s estaran dentro de las
anormalidades de la cabeza. No obstante, la OMS hace una apreciacin sobre los
defectos especiales, y es que si estas anomalas son muy abundantes si se cuentan e
informan, en el caso de la globozoospermia habra que destacar este hecho, de tal
forma que no pase desapercibido para el clnico.
http://bit.ly/ThJ9p0
66
Estudio bsico del espermiograma
Valoracin de la morfologa
Como en tcnicas anteriores, una vez obtenidos los resultados hay que evaluarlos utilizando la
tabla del intervalo de confianza del 95% para diferencias de dos porcentajes. Si el error es
mayor, no ser necesario repetir las dos preparaciones como en el caso de la concentracin,
pero s que se tendr que repetir el contaje de ambas.
El quinto manual de la OMS establece un valor para el lmite inferior de referencia para la
morfologa espermtica del 4%.
4.3 Vitalidad
El manual de la OMS sugiere que el test de vitalidad debe hacerse de forma rutinaria en todas las
muestras y considera que es obligatorio cuando la movilidad progresiva es menor del 40%.
o Test hipoosmticos.
Se fundamenta en estudiar la funcionalidad de la membrana plasmtica cuando est
situada en el medio hipoosmolar. Cuando la membrana est funcionalmente activa no
permite la salida de sustancias osmticamente activas y compensa el desequilibrio
osmtico captando agua, por lo que la membrana del espermatozoide se hincha y el
flagelo se riza. Se considera pues que un espermatozoide con la membrana hinchada
es un espermatozoide funcionalmente activo y por tanto vivo; sin embargo, si la
membrana no est funcionalmente activa permitir la salida de sustancias
osmticamente activas y no se hinchar, en este caso un espermatozoide se considera
no funcional.
Diversos estudios (Jeyendrn, 1984; Ramirez, 1992) han demostrado que no existe un alto grado
de correlacin entre test colorantes y test hipoosmticos ya que miden efectos caractersticos
diferentes de la membrana plasmtica. Por una parte los colorantes nos estaran midiendo el
estado estructural de la membrana plasmtica y el test hipoosmtico el estado funcional. Es por
eso que el resultado del test de colorantes siempre ha de ser superior al test hipoosmtico: un
espermatozoiode vivo, no teido con el colorante, podr tener el test hipoosmtico positivo o
negativo, ser funcional o no; pero un espermatozoide muerto debe tener el test hiposomtico
negativo siempre.
67
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Tcnica de la Eosina
o Solucin de Eosina:
Eosina Y .......................... 0,67 g
ClNa ................................ 0,9 g
Agua ............................... 100 ml
Tcnica de la Eosina/Nigrosina
o Solucin Eosina/Nigrosina:
Nigrosina ........................ 10 g
Solucin Eosina ............... 100 ml
Mezclar la Nigrosina con la solucin Eosina, hervir, filtrar, enfriar y guardar en bote de
vidrio.
68
Estudio bsico del espermiograma
Interpretacin
Ilustracin 10. Ejemplo del test de vitalidad con Eosina/Nigrosina. A) Espermatozoide muerto,
teido; B) Espermatozoide vivo, ligeramente teido; C) Espermatozoide vivo, sin teir
Tcnica
Interpretacin
69
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Ilustracin 11. Ejemplo del test de vitalidad con Sol. Hiposmtica. El Hos(-) est intacto,
muerto; los Hos (+) que tienen el flagelo encogido en distinto grado por hinchamiento,
estn vivos
El lmite inferior de referencia que marca el nuevo manual de la OMS es del 58%.
La vitalidad puede servirnos como evaluacin de los resultados de movilidad. Esto es as porque
el tanto por ciento de espermatozoides viables siempre debe ser igual o superior al de
espermatozoides mviles. Por ejemplo:
70
Estudio bsico del espermiograma
Tambin se debe valorar clnicamente los casos de movilidad baja con resultados de vitalidad
aceptables:
o En los tbulos seminferos, las clulas de Sertoli se unen entre ellas a travs de unas
50 a 60 uniones, formando una barrera de defensa conocida como Barrera
Hematotesticular.
o Esta barrera asla el comportamiento adluminal donde se encuentra el
espermatozoide del compartimento basal y del contacto con clulas
inmunocompetentes del torrente sanguneo, evitando as el reconocimiento
inmunolgico del espermatozoide.
71
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
o Traumas.
o Intervenciones quirrgicas.
o Necrosis, torsiones testiculares.
o Neoplasias.
o Varicoceles
o Criptorquidias.
o Infecciones recidivantes del tracto genitourinario.
o Obstrucciones.
Una vez rota la barrera los anticuerpos producidos pueden tomar contacto con los
espermatozoides alterando su funcionalidad.
Se considera que existe un factor inmunolgico cuando ms del 50% de los espermatozoides
mviles de un eyaculado tienen adheridos anticuerpos antiespermatozoide.
Hay que tener en cuenta que los niveles de respuesta inmune fluctan, por lo que es interesante
el seguimiento de los niveles de anticuerpos antiespermatozoide en el factor masculino
inmunolgico. Sin embargo, encontrar anticuerpos no implica necesariamente el factor
72
Estudio bsico del espermiograma
inmunolgico. Para ello hay que demostrar que existe una alteracin funcional mediante
pruebas funcionales.
Permiten caracterizar los isotipos presentes as como cuantificar la respuesta inmunolgica. Sin
embargo el hecho de medir solamente sobre espermatozoides mviles, hace que en casos de
Astenozoospermia elevada y Necrozoospermia no tengan ninguna utilidad y por tanto sean
intiles para detectar un factor inmunolgico masculino.
73
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
o IB TEST DIRECTO
o Utiliza semen lavado.
o Emplea una matriz de poliacrilamida.
o Nos permite detectar IgG e IgA tanto de origen secretor como no secretor.
o Nos dar ms informacin que el Mar test al no interferir el lquido seminal.
En esta tcnica los anticuerpos antiespermatozoide se pondrn en evidencia en caso de
existir porque se unirn a ellos antiinmunoglobulinas G o A fijados a las esferas de
poliacrilamida y por tanto se observan los espermatozoides mviles con las esferas
adheridas.
o 3,5 l de semen completo y 3,5 l de esferas revestidas con IgG (o IgA humana).
o Mezclar.
o Aadir 3,5 l de antisuero frente a IgG (o IgA humana).
o Mezclar y cubrir con cubre 22x22.
o Mantener 3 minutos en cmara hmeda.
o Realizar la observacin microscpica a 400x utilizando contraste de fases. Contar al
menos 200 espermatozoides en cada portaobjetos.
o Realizar la observacin en cmara hmeda:
o 1 medida, a los 3 minutos. Si el 100% de los espermatozoides mviles presentan
esferas unidas no hacer ms observaciones.
74
Estudio bsico del espermiograma
El nuevo manual sigue sin dar unos valores normales, entendiendo por ellos unos realizados
estudiando una poblacin de varones frtiles. Aunque se mantiene el valor de consenso del
50% como valor indicativo. Esto es as porque hay estudios que demuestran que la
penetracin de espermatozoides en moco cervical y fertilizacin in vivo tiende a no
correlacionar cuando los valores de anticuerpos antiespermatozoides son iguales o
superiores a 50%.
o Clulas epiteliales.
o Clulas redondas, una terminologa que agrupa a leucocitos y clulas de la
espermatognesis. Un nmero alto de estas clulas puede ser indicativo de procesos
inflamatorios o alguna patologa o alteracin a nivel testicular.
Para calcular la concentracin de estas clulas podramos recurrir al mtodo ya visto, doble
dilucin y medida en cmara de Neubauer improved. Se hara a la par que se realiza el contaje
de los espermatozoides para la medida de la concentracin espermtica. Sin embargo este
mtodo no es muy apropiado, ya que salvo que haya una alta concentracin de clulas redondas
75
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
las diluciones empleadas suelen ser demasiado altas como para poder realizar una medida
fiable, que recordemos pasa por contar al menos 400 elementos para obtener un error que no
supere el 5%.
Por tanto, la forma ms adecuada para calcular la concentracin de clulas redondas es usando
las extensiones teidas para la realizacin de la morfologa espermtica. A la vez que se hace la
morfologa se anotar el nmero de clulas redondas visualizadas y se aplicar la siguiente
frmula:
o Si se cuentan menos de 400 clulas redondas el error es superior al 5%, y aparte del
resultado hay que informar el error asociado al n de espermatozoides contados.
o Si se cuentan menos de 25 clulas redondas, el error es superior al 20%, que
recordemos se consideraba el error mximo permitido para poder dar un resultado
respetable. Por lo tanto, el resultado se debera acompaar con el comentario de que
el nmero de clulas redondas contadas es demasiado pequeo para poder asegurar
esa concentracin.
Ejemplo
o Supongamos que en una de las preparaciones Diff-Quik, a la vez que vamos contando
la morfologa, contamos 16 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En la
otra preparacin, contamos 19 clulas redondas por cada 200 espermatozoides. En
total habremos contado 35 clulas redondas por 400 espermazotoides.
o Para un contaje de 35 clulas la diferencia mxima permitida es de unos 10, en
nuestro caso es 3. Luego el resultado ser apto. Si no lo fuera tendramos que
recontar de nuevo las dos preparaciones.
o Aplicando estos datos a la frmula ya conocida, obtendremos una cifra de
7,79 millones/ ml. El resultado no debe tener ms de dos cifras significativas, por lo
tanto informaremos 7,8 millones de clulas redondas / ml.
o Pero no hemos contado 400 clulas redondas sino 35, con lo que el error ser mayor
del 5% y deberemos informarlo, el error ser del 17%.
o El informe final ser millones clulas redondas / ml, con un error del 13%.
o Se ha de tener en cuenta que al superar el milln por mililitro debe ser investigada la
presencia de leucocitos por alguno de los mtodos vlidos, como el test de la
peroxidasa.
76
Estudio bsico del espermiograma
4.5.1. Leucocitos
Procedimientos
Test de la Peroxidasa
o Fundamento
Las peroxidasas del leucocito polimorfonuclear reaccionan con el agua oxigenada de la
solucin de trabajo desprendiendo oxgeno que reacciona a su vez con la
ortotoluidina, oxidndola y haciendo que adquiera el tono marrn.
o Limitaciones
o No se tien leucocitos polimorfonucleares que estn activados y hayan liberado
sus grndulos de peroxidasa.
o No se tien linfocitos, macrfagos o monocitos ya que no contienen grnulos de
peroxidasa.
77
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
o Tcnica
o Hay que preparar cuatro soluciones:
1 NH4Cl................................ 250 g/ L
2 Na2EDTA ........................... 50 g/ L en PBS
3 Orto-toluidina................... 0,25 mg/ ml
4 H2O2 ................................. 30%
El resultado se dar con dos cifras significativas, por ejemplo si obtenemos 2,74 lo
redondearemos a 2,8.Si se cuentan menos de 400 clulas el error ser superior al 5% y junto
al resultado habr que informar el error asociado al nmero de clulas contadas.
Para calcular la sensibilidad del mtodo, suponiendo un error mximo admisible del 20%, la
sensibilidad sera 138888 PMN / ml
78
Estudio bsico del espermiograma
Ejemplo
o Valores de referencia
El manual no establece unos valores de referencia con la poblacin de estudio de este
manual, es decir, en parejas que han quedado gestantes en el plazo de un ao o
menos. Mientras no existan estudios, se mantiene el valor de referencia de 1 milln
de leucocitos por mililitro.
79
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Procedimientos
o Espermatogonia-8 micras
o Espermatocito-10 micras
o Espermtida-5 micras.
Sin embargo, esto slo sirve de referencia porque la degeneracin o los periodos de divisin
afectan estos tamaos.
http://bit.ly/ThJ9p0
80
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
Captulo 5
Estas pruebas permiten apreciar la aptitud de los espermatozoides para migrar en el moco y
adems, son esenciales en la evaluacin de la calidad funcional de los espermatozoides. La
prueba de Hhner es un examen solicitado sistemtica y precozmente en el estudio de la
subfertilidad de la pareja.
Se trata de una prueba simple, no invasiva y barata. Aporta informacin sobre la calidad del
moco cervical consecuencia de la secrecin de estrgenos y de la calidad del movimiento
flagelar de los espermatozoides. Las anomalas en la interaccin moco-esperma son
responsables del 5 al 15% de los casos de infertilidad.
El estudio de estos parmetros permite establecer un ndice, el ndice de Insler (Insler score).
Exige diferentes materiales biolgicos: moco cervical de la mujer, esperma del marido, esperma
testigo y moco testigo. Consiste en poner en contacto el moco de la mujer con el esperma de su
pareja, los espermatozoides del paciente con un moco testigo y el moco de la paciente con el
esperma testigo. Esta prueba tambin se realiza lo ms prximo posible a la ovulacin. Evala la
calidad y la cantidad de espermatozoides que ha penetrado en los diferentes mocos. La
interpretacin de esta prueba es a veces difcil cuando existe participacin del moco y de los
espermatozoides, en los defectos de migracin.
82
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
Aqu se puede ver un vdeo demostrativo del anlisis del movimiento asistido por ordenador:
http://www.micropticsl.com/esp/productos/analisis_esperma_sca_video03.html
Este examen se practica en muy pocos laboratorios. Los espermatozoides capacitados tienen
que ser capaces de efectuar la reaccin acrosmica con el fin de penetrar en los ovocitos. Parece
bien demostrado que el resultado de la fecundacin in vitro (FIV) est correlacionado con la tasa
de reaccin acrosmica y que un fracaso de FIV puede ser debido a la ausencia de reaccin
83
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
acrosmica. As, una tasa de reaccin acrosmica inducida inferior o igual al 5% sera predictiva
de una tasa dbil de fecundacin.
Permite estudiar, por una parte, la interaccin entre las membranas ovocitarias y la membrana
del espermatozoide y por otra parte, la aptitud de los espermatozoides para desarticular su
ncleo despus de su penetracin en un citoplasma ovocitario. Se hace con ovocitos de hmster
depelucidados, ya que la pelcida es una barrera interespecies. Es de realizacin delicada y slo
se hace en algunos laboratorios de Biologa de la Reproduccin.
Se valoran las cabezas expandidas por ser indicativas de que el ncleo del espermatozide, que
estaba muy contrado en el momento de entrar en el ovocito, ha conseguido entrar en l, ha
desaparecido la membrana nuclear del espermatozoide, se ha descondensado la cromatina y
expandido el ncleo dentro del ovocito. La prueba es positiva si se observa la presencia de una o
ms cabezas expandidas en ms del 10% de los ovocitos.
Permite confirmar las anomalas constitucionales de los espermatozoides, como es el caso de las
disquinesias flagelares. Confirma, por ejemplo, las anomalas del axomena de los
espermatozoides (ausencia de brazos de dineina, ausencia de los tbulos centrales, anomalas
84
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
fisiolgico, sino nicamente en que sea producido especficamente mediante una de las
glndulas anexas o una zona muy determinada del tracto genital masculino. Permiten realizar
una verdadera cartografa anatmica del aparato genital.
Es posible, en efecto, localizar una afeccin del tracto genital en funcin de la disminucin de un
determinado marcador, teniendo en cuenta que:
o Una azoospermia;
o Una oligozoospermia;
o Un volumen pequeo;
o Una infeccin genital;
o Una disminucin de la movilidad (< al 20%);
o Otros: viscosidad anormal, preparacin de esperma para FIV o ICS.
VESCULAS
PRSTATA EPIDDIMO
SEMINALES
o Citrato o -1,4 Glucosidasa neutra o Fructosa
o Zinc o L-Carnitina
o Fosfatasa cida
85
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
Despus de analizar el semen se toma una alcuota de la muestra que nos quede y se procede a
la centrifugacin: durante 10 minutos a 1000g de Fuerza Centrfuga Relativa (FCR = 1,118 x 10-5 x
R [cm] x V2 [rpm]). Posteriormente se decanta el plasma seminal del sobrenadante y se conserva
congelado a -20C hasta su procesamiento.
Es largo y meticuloso.
La cuantificacin de los tres sustratos, carnitina, fructosa y citrato, se basa en el mismo principio
cuando se realiza a 340 nm. El parmetro a determinar es el primer sustrato de una cascada de
reacciones enzimticas a 37 C, es pues el parmetro limitante. La ltima reaccin es la reaccin
indicadora, que acaba en la formacin o el consumo de NADH2 o a NADPH2, que se mide por la
variacin a punto final de la absorbancia por espectrofotometra UV a 340 nm. La deteccin se
desarrolla en 2 tiempos:
o Se incuba en primer lugar el plasma seminal con el reactivo 1 que contiene el tampn
de reaccin, los sustratos anexos necesarios y las diferentes enzimas de la cascada,
excepto la primera enzima.
o Luego se aade el reactivo 2, reactivo desencadenante, conteniendo la primera
enzima que inicia la cascada de reacciones. Se efecta la medida al final de la
reaccin, cuando se agota el sustrato inicial.
o L-Carnitina. El reactivo desencadenante es la carnitina acetil transferasa.
Ilustracin 13.
o Fructosa. El estuche comercial utilizado est concebido para analizar al mismo
tiempo la fructosa y la glucosa. El esperma contiene poca glucosa, pero sin
embargo hay que eliminar esta interferencia. Ilustracin 14.
86
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
87
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
D) Tcnicas colorimtricas
88
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
Los valores normales de los marcadores seminales varan de un laboratorio a otro, en funcin de
las tcnicas utilizadas. Cada laboratorio tiene que establecer sus propios valores usuales. Tienen
que ser establecidos a partir de esperma procedente de sujetos que ya hayan procreado. Los
resultados se expresan en concentracin o en cantidad por eyaculado.
Un estudio hormonal es indispensable ante una azoospermia, una oligospermia o ante una
degradacin de los parmetros del esperma. Se ha de investigar un origen secretorio de los
trastornos de la espermatognesis cuando se ha observado un hipogonadismo o una
hiperprolactinemia reveladora de un adenoma hipofisario.
89
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
Viscosidad
o Varilla
Apariencia o Visual
o Pesada
Volumen
o Recipiente graduado
pH o Tiras reactivas pH (6-10)
EVALUACIN INICIAL MICROSCPICA
o Microscopio contraste de fases, pletina 37C
o Porta y cubreobjetos:
l muestra Cubreobjetos
10 22x22
6,5 18z18
11 21x26
Agregacin 100X
Aglutinacin 100X
Cel no espermticas 100X
o Montar porta-cubre y esperar 1
o Visualizar a 5 mm del borde
o Contaje: 200X o 400X
1 Porta: 2 Porta:
Movilidad
5 campos 5 campos
200 spz 200 spz
Suma con IC = 95%
% Progresivos, % No Progresivos, % Inmviles
200x: 400x: DILUCIN Weigman
Estimacin del >404 >101 1/20
Recuento 64-400 16-100 1/5
<64 <16 1/2
Tabla 8. Procedimiento de laboratorio para anlisis del semen en estudios de fertilidad:
Espermiograma
90
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
1 Subcmara: 2 Subcmara:
200 spz 200 spz
N = Suma spz con IC = 95%
C = (N/n filas) x (1/20) x Dil
Cripto y azoospermias
RECUENTO APROXIMADO: Porta y cubre
< 4 spz/campo <2 mill/ ml
0 spz/campo: contar todo el porta
- 10 l sedimento (1 ml, 15, 500g)
- 40 l si movilidad.
Recuento Criptozoospermia
RECUENTO EXACTO:
o Micr. Contraste Fases o Micr. Fluorescencia
o 400x o 250x
o Neubauer improved o Cmara Leja
o Dilucin Weigman o Dilucin Hoeschst
o Contar cmara total o Contar cmara total
o C= N x (1/1800) x2=spz/ ml o C= N x (1/50000)x2=spz/ ml
o %SE= 100 (N/N) o %SE= 100 (N/N)
N C %SE N C %SE
<400 Frmula Frmula <400 Frmula Frmula
(>5) (>5)
25-0 27777=S 20 25-0 1000=S 20
0 4100 52 0 150 52
91
Manual de Laboratorio para el Anilsis del Semen
Morfologa
o Microscopio 1000x
1 Porta: 2 Porta:
200 spz 200 spz
Suma con IC = 95%
Segn criterio Kruger
% Normales, % Anormales
Obligatorio si PR<40%
COLORANTE SUPRAVITAL T.HIPOOSMTICO
92
Pruebas analtico-clnicas de segunda intencin
acrosoma
N=25-0, C=S=138888
SEGUNDA INTENCIN
Moco cervical y esperma:
o Prueba de Hhner o Penetracin cruzada in vitro
FUNCIONA-
Anlisis del movimiento asistido por ordenador C.A.S.A.
LIDAD DEL
ESPERMA- Reaccin acrosmica
TOZOIDE Prueba de fecundidad heteroespecfica
Exploracin de la calidad del ncleo espermtico
Microscopia electrnica de los espermatozoides
o Gentica
o Hormonas
93
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Captulo 6
vasovasostomas
Se recomienda que el laboratorio analice las muestras de semen lo antes posible con un lmite
mximo de 4 horas desde la eyaculacin.
94
Estudio del semen en vasectomas y vasovasostomas
95
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
96
Estudio del semen en vasectomas y vasovasostomas
o Porta y cubre 22 x 22 mm
o Microscopio contraste de fases 400x
o 20-30 campos
Si 0 spz:
o Todo el semen en tubo cnico
Recuento o 1000g, 15 Si se observan
o Sedimento en 100 l spz:
o (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces o Movilidad
o Micr. contraste de fases 400x o Recuento como
o 40 campos Criptozoospermia
Si 0 spz: Si se observan spz:
o No se observan spz o Movilidad
o C<188 spz/E, %SE>5 o Se observan spz
PREVASOVASOSTOMA
o Pesada
Volumen o Recipiente graduado
o Todo el semen en tubo cnico
o 1000g, 15
o Sedimento en 100 l
o (10 l + porta-cubre (22x22))x10 veces
Recuento
o Micr. contraste de fases 400x
o 40 campos
o Si 0 spz: No se observan spz, C <188 spz/Eyaculado, %SE>5
POSVASOVASOSTOMA
reciente
97
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Captulo 7
98
Capacitacin del semen
Adems, el plasma seminal puede contener agentes infecciosos que deben eliminarse antes de
cualquier tcnica de reproduccin asistida, ya que son susceptibles de provocar infecciones en la
mujer y contaminar los cultivos de ovocitos y embriones. Exposiciones prolongadas (ms de
2 horas) de los espermatozoides al plasma seminal pueden provocar una prdida de la capacidad
fecundante y ejercer un efecto negativo sobre su movilidad. As la separacin de los
espermatozoides del plasma seminal debe realizarse lo ms rpido y eficazmente posible.
La muestra de semen debe recogerse siguiendo las indicaciones del captulo de Preanaltica.
Pasados 30 minutos de la eyaculacin separar una alcuota de semen para su valoracin
siguiendo las recomendaciones de la ESHRE y la OMS.
99
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
En aquellas situaciones en las que no se puede emplear semen fresco se puede recurrir a semen
congelado. Existen dos tipos de muestras de semen criopreservadas:
La muestra de semen criopreservada contiene un agente crioprotector que debe ser retirado
antes de utilizarla para cualquier tcnica de reproduccin asistida.
Evaluacin de la criopreservacin
100
Capacitacin del semen
o Los medios de cultivo han de atemperarse antes de su uso y tener la certificacin CE.
o Todos los materiales empleados as como los medios de cultivo deben ser estriles y
manejarse en condiciones de asepsia, en campana de flujo laminar.
o Los medios de cultivo deben tener una osmolalidad entre 280-300 mOsm/kg.
101
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Los mtodos incluyen desde la simple dilucin y centrifugacin hasta tcnicas ms complicadas.
o Dilucin y lavado del semen. Los mtodos que utilizan solo lavado, deberan
abandonarse y emplear tcnicas ms seguras de preparacin de espermatozoides
o Migracin: el movimiento del espermatozoide es un requisito esencial
o Gradientes de densidad: separan los espermatozoides en funcin de su punto
isopcnico.
o Adherencia-Filtracin: combinan la movilidad de los espermatozoides con la
adherencia a las matrices de filtracin (lana de vidrio, sefadex).
102
Capacitacin del semen
Procedimiento
7.5.2. Migracin
Swim-up
El semen licuado se deposita sobre un medio de cultivo y los espermatozoides con buena
movilidad se dirigen al medio de cultivo de forma semejante al proceso in vivo a travs del moco
cervical. Dentro de esta categora existen dos formas principales Swim Up directo y Swim Up
convencional.
Swim Up directo
El proceso consta de varias fases (Ilustracin 16A):
103
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
o Pasado este tiempo aspirar aproximadamente 300l de medio de cultivo, con cuidado
de no aspirar semen (para lo cual durante todo el proceso se debe mantener el
ngulo del tubo). Si hay ms de un tubo de una misma muestra se unifica todo el
aspirado en un nico tubo.
o Si el volumen obtenido es mayor de 500l, valorar el grado de movilidad y la
concentracin de los espermatozoides. Centrifugar y llevar a un volumen final de
300-500l para inseminar.
Swim Up convencional
Se basa en el mismo principio pero requiere un primer paso de lavado.
Swim-down
Este procedimiento es similar al Swim-up, pero en este caso se coloca primero el medio de
cultivo y despus se deja resbalar el semen por la pared del tubo para que quede arriba. Se
incuba a 37C / 5% CO2 y se descarta el sobrenadante, ya que en este caso los
espermatozoides ms aptos van a nadar hacia la parte de abajo, donde est el medio de
cultivo. Ilustracin 16B.
104
Capacitacin del semen
o Se preparan los tubos que sean necesarios por muestra teniendo en cuenta que no se
debe depositar ms de 1,5 ml de semen por tubo.
o Dispensar 0,5 ml del gradiente de 40% en un tubo cnico, a continuacin con una
jeringa de 1 ml conectada a una aguja larga de carga, depositar 0,5 ml del gradiente
de 80% en el fondo del tubo (cono), muy despacio para que el gradiente de 40% suba
y queden bien definidas las dos capas.
o Decantar el semen licuado, resbalando por las paredes de los tubos, con cuidado de
no romper la interfase. El semen debe quedar encima del gradiente de 40%.
o Centrifugar a 300g durante 20 minutos.
o Aspirar las distintas capas con una pipeta pasteur en la zona del menisco para evitar
alterar las interfases y las posibles contaminaciones, hasta alcanzar claramente el
gradiente de 80%, donde se encuentra el sedimento con los espermatozoides
maduros. Repetir el proceso con todos los tubos de la misma muestra.
o Cambiar de pipeta, al aspirar el/los sedimentos. Transferir a un nico tubo nuevo
(para evitar contaminaciones) con 1-2ml de medio de lavado, homogeneizar y
centrifugar a 500g durante 10 min.
o Retirar todo el sobrenadante, con cuidado de no aspirar el botn celular.
o Resuspender en 300-500l de medio de cultivo.
105
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Esta tcnica se basa en el hecho de que los espermatozoides muertos o con importantes
disrupciones de membrana presentan una clara tendencia a la absorcin a determinados
materiales (fibra de vidrio, partculas de vidrio, etc.). Aprovechando esto pueden construirse
columnas de lana de vidrio que permitan filtrar a los espermatozoides obtenindose la fraccin
de clulas viables. Se realiza mediante una malla de fibra de vidrio en porciones de 15-20mg que
situamos en el interior de una jeringa de insulina hasta la divisin 0,06ml. A continuacin
lavamos el filtro con 2-3ml de medio para eliminar las partculas de fibra de vidrio que pudieran
estar libres y procedemos a filtrar aproximadamente 500l del semen en fresco o previamente
lavado. Despus del filtrado lavaremos el filtro de nuevo con 200-300l de medio de cultivo para
liberar los espermatozoides de buena calidad que pudieran quedar en el. Sin embargo se ha
indicado que las columnas de lana de vidrio podran daar las membranas de la cabeza de los
espermatozoides y de pequeas contaminaciones de fragmentos de fibra de vidrio.
106
Capacitacin del semen
Una vez terminada la tcnica hay que calcular el porcentaje de espermatozoides con movilidad
progresiva y realizar el recuento de los mismos.
Los resultados se obtienen multiplicando el tanto por ciento de espermatozoides con movilidad
progresiva, por los millones de espermatozoides recuperados y por el volumen final. Se
expresar como millones de espermatozoides recuperados con movilidad progresiva. Si el semen
se va a utilizar para inseminacin artificial se informar como millones inseminados y se
calcularn multiplicando por el volumen inseminado. En caso de utilizar parte del volumen
eyaculado, los resultados deben expresarse en funcin del volumen utilizado, y multiplicarse por
el factor de correccin.
Para el correcto desarrollo de este proceso se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:
107
Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
7.7 Conclusiones
El papel de los parmetros seminales como factor pronstico en la fertilidad masculina est
actualmente sometido a debate. Se ha propuesto el test de recuperacin de espermatozoides
mviles (REM) en el estudio de la pareja estril como prueba para distinguir qu parejas se
beneficiarn de la inseminacin artificial y cules no, porque incluye la concentracin, la
movilidad as como los efectos del procesamiento de los espermatozoides.
De las tcnicas de capacitacin anteriormente descritas las ms utilizadas en los laboratorios por
su simplicidad y eficacia son el Swim-up y los gradientes de densidad. Aunque no existe
evidencia cientfica para recomendar una tcnica de preparacin de semen, las ventajas de cada
uno de estos mtodos se recogen en la tabla 10.
Una revisin Cochrane (Boomsma, Heineman, Cohlen & Farquhar, 2007) sobre las diferentes
tcnicas de preparacin de semen concluye:
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Capacitacin del semen
5, 10C-20C
(-196C) en pajuela
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
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Informe del laboratorio
Captulo 8
Digirido a: es responsabilidad del clnico y no del laboratorio el comunicar los resultados del
anlisis del semen a sus pacientes. El informe del laboratorio ha de ir dirigido al clnico
solicitante.
o Nombre
o Identificacin laboratorio
o Nmero Historia clnica
o Fecha de obtencin de la muestra
o Periodo de abstinencia
o Volumen
o Resultados
o Valores de referencia
o Comentarios
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
8.1 Resultados
En la ltima edicin del Manual de la OMS en lugar de hablar de valores de referencia, se habla
de Lmites inferiores de Referencia (tabla 12):
o Que incluye al 95% de los individuos de referencia con valores superiores al percentil
5, y no en torno al percentil 50 como hasta ahora se haba considerado en los valores
de referencia del espermiograma.
o En una poblacin compuesta por hombres con fertilidad reciente, pertenecientes a
parejas que han obtenido el embarazo en un tiempo inferior o igual a 12 meses.
Es conveniente aclarar que los lmites inferiores de referencia no son valores de referencia de
esterilidad o fertilidad:
o Ya que ni son los valores mnimos que se necesitan para lograr un embarazo, pues
habr muchos varones con valores superiores que no puedan conseguir un embarazo
por causas estrictamente femeninas o por factores que no se ponen en evidencia en
los parmetros del seminograma.
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Informe del laboratorio
Adems, puede haber diferencias regionales en la calidad del semen, y entre laboratorios. Estos
laboratorios debern considerar la preparacin de sus propios valores de referencia.
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
8.3 Comentarios
Conclusin
Recuento Oligo-
Movilidad asteno-
Morfologa terato-
zoospermia
HEMATES Hemos o Hematospermia
OTROS ELEMENTOS FORMES
LEUCOCITOS Leucos, Leucocito o Piospermia
Tabla 13. Nomenclatura de la calidad del esperma
A modo de resumen, el analista puede incluir un comentario sobre la calidad del esperma en
funcin de los resultados cuantitativos del espermiograma, para lo cual se ha de emplear la
terminologa adecuada: permia se refiere al eyaculado; y zoospermia se emplea para
referirse a los espermatozoides. Tabla 13.
Orientacin diagnstica
Azoospermia
o La FSH plasmtica permite explorar el eje gonadotropo y orientar hacia una etiologa
pretesticular y testicular.
o La L-carnitina y la -1,4glucosidasa seminales permiten explorar todo el tracto a partir
de los cuerpos del epiddimo porque son los marcadores ms significativos.
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Informe del laboratorio
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Manual de Laboratorio para el Anlisis del Semen
Oligozoospermias
La fructosa es sintetizada en las clulas epiteliales de las vesculas seminales, por conversin a
partir de la glucosa sangunea. La diabetes conlleva un falso aumento de la fructosa seminal
y puede, por ejemplo, disfrazar una bajada de este parmetro.
Otras anomalas
Los marcadores bioqumicos pueden estar alterados en los varicoceles, en los sujetos VIH...
116
Bibliografa
Captulo 9
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Sobre los autores
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