Diferenciando bacterias gram-negativa y gram-positiva

La tincin de gram es una de las tcnicas de tincin mas comunes y baratas

para identificar organismos bacterianos.El mtodo fue originalmente creado
por el bacterilogo Danes Hans Christian Gram en 1884.
Principio del mtodo
La tincin de gram se basa en la habilidad que tiene la pared bacteriana de
retener la tincin de cristal violeta durante el tratamiento de decoloracin con
un agente decolorante.Las paredes de bacterias Gram-positiva tiene una
concentracin alta de peptidpoglucanos y un bajo contenido de lpidos respecto
a las bacterias gram-negativa.Las paredes bacterianas estn inicialmente
teidas con cristal violeta, el Iodo es agregado como fijador para formar un
complejo que no pueda ser fcilmente desteido.Este paso es comnmente
referido como fijacin de la tincin.Posteriormente del tratamiento con el
decolorante, que es una mezcla de etanol y acetona, este disuelve la pared de
lpidos de las bacterias Gram-negativas.El remover esta capa de lpidos permite
la lixiviacin de la tincin de cristal violeta de las clulas.Cuando se agrega la
contratincion de Safranina es adiccionada a las bacterias Gram negativa
decoloradas se tie de rosa.En el contraste elsolvente deshitrata la pare mas
gruesa de Bacterias Gram positivas, cerrando los poros de la pared celular se
encoge.Es el resultado, es que el complejo Iodo-cristal violeta es retenido y las
clulas permanecen purpuras.
Proceso de tincin bsico.
1)Hacer una capa delgada de clulas bacterianas en un portaobjetos limpio y
libre de grasa hacer un fresco(18 a 24 horas de crecimiento), de una colonia
bacteriana aislada de una placa de agar nutritivo.Permitir el secado.
2)Fijar con metanol al 95% por 2 minutos,dejar secar al aire.Este mtodo es el
recomendado pues no ocasiona alteraciones de clulas.Calentar la placa por
paso al mechero(que es el mtodo tradicional) puede ocasionar alteraciones de
las clulas y no fija del too bien el espcimen a la placa.
3)Mojar la placa con un poco de cristal violeta(o genciana)por 30 segundos.
4)Lavar la placa con un flujo indirecto de agua por 2 segundos.Agitar
ligeramente la placa para quitar el exceso de agua.
5)Mojar la preparacin con un flujo de Iodo por 30 segundos.
6)Repetir paso 4
7)Agregar el decolorante a la placa hasta que el color no se vaya de ella por
unos 10 a 30 segundos
8)Repetir paso 4
9)Mojar la placa con la contratincion Safranina por 30 segundos.
10)Lavar la placa con un flujo indirecto de agua hasta que el color no se
vaya.Permitir la placa se seque al aire del ambiente o secar con papel
absorbente.
11)Observar placa en microscopio con aceite de inmersin donde las bacterias
gram positivas se vern de color purpura a violeta y las Gram negativa de rosa
claro a rojizo.
Problemas comunes en la tincin.
Preparacion del frotis.
Problema:Si el frotis es muy grueso, las clulas pueden parecer Gram positicas
en un rea muy gruesa.Puede ver la variabilidad de las reas delgadas a las
gruesas.
Soluciones:Intente preparar una capa nica de organismos.Usar controles
negativos y positivos tambin puede ayudar(Placas pre-preparadas como
controles estn disponibles a cierto costo)
Problema:Si las bacterias se preparan en soluciones hiper o hipotnica, su
morfologa puieras verse alterada.
Soluciones:Haga el frotis en una placa completamente seca con un asa esteril.
Problema:Ensuciar demasiado el frotis(esto ocurre por que la mayora de los
frotis deberan ser secados de manera prioritaria al aire, ya que se flamea
demasiado la placa al mechero para sfijar la placa) puede ocasionar que las
clulas parezcan Gram negativas.
Problema:Los frotis de cultivo antiguos pueden causar que las clulas parezcan
Gram-negaivas(paredes dbiles).
Soluciones:Preparar solo frotis en fresco, fase logartmica de
crecimiento(normalmente en cultivos durante la noche)

Problema:El medio del cual se toman las colonias es importante.Pues el tomar

colonias de medios liquidos o selectivos, puede ocasionar que las clulas
parezcan Gram-negativas y mas del tipo cocos.
Soluciones:Tomar una muestra simple de colonias frescas en un agar nutritivo.
Tincion.
Problema:Decolorar demasiado:Este es un problema demasiado comn, bien
puedes ser ocasionado por usar un declorante muy fuerte o bien por exponer la
placa al mismo demasiado tiempo.
Soluciones:
-Usar un decolorante fabricado por la misma compaa que las tinciones, asi
como seguir el protocolo.
-Usar controles positivos y negativos contra tus tinciones diarias.
-Probar el decolorante usando diferentes tiempos(ejemplo 5,10,15 segundos)
con culivos ligeramente positivos y negativos, hasta encontrar el que mejor se
ajuste.

Problema:La variabilidad de Gram,esto puede deberse al propio organismo y no

al mtodo de tincin.
Soluciones:La vasta mayora de organismos Gram-variablesson Gram
positivos .De manera caracterstica los organismos Gram variables(ejemplo
Corynebacterium variabilis)debido a su alteracion de la membrana por
envejecimiento, y aparentemente Gram-variables(ejemplo Arthrobacterium
spp.) son agrupados como Gram-positivos.Por lo tanto se deben tratar como
organismos Gram positivos.
Opciones de tincin de Gram.
Las preparaciones convencionales para Iodo-Gram son relativamente
inestables debido a que pierden cerca del 60% del Iodo disponible despus de
30 dias de ser guardados a 25 c. Los organismos Gram-positivos pueden
eentonces teirse pobremente debido a que el Iodo disponble se ha perdido en
un 40%.El Iodo es una solucion que se puede estabilizar por ciertas
manufacturas como son adicionar bicarbonato de sodio a la solucion, o creando
un Iodo estabilizado polivinypirrodlidina Iodo.

GRAM STAINING OPTIONS

The conventional preparation for Grams iodine is relatively unstable and may
lose up to 60% of the available iodine in 30 days when stored at 25C. Gram-
positive organisms may stain poorly when 40% of the available iodine is lost.
The iodine solution is stabilized by some manufactures by the addition of
sodium bicarbonate to the solution, or creating stabilised iodine-
polyvinylpyrrolidone iodine.
Metodos adicionales para distinguir entre bacterias gram positivas y
negativas-

Gram stain results are not always a conclusive test to indicate the structure of
the cell wall of bacteria. Certain gram-positive bacteria lose some of their cell
wall properties with age or exposure to harsh or bacterial static/ bactericidal
agents causing them to appear gram-negative or gram-variable. Also many
Bacillus sp. and Clostridium sp. stain falsely gram-negative. Several additional
tests can be performed to aid in the determination of gram reactivity, although
none are foolproof.

1. L-alanine-4-nitroanilide (LANA) can distinguish aerobic and facultative

anaerobes. The reagent is sold commercially impregnated in cotton swabs,
which turn yellow when touched to the colony of a gram-negative bacterium.

2. Potassium hydroxide (KOH) test also detect gram-negative bacteria. A loop of

growth from a colony is emulsified on the surface of a glass slide in a
suspension of 3% KOH and stirred continuously for 60 seconds. Gram-negative
cell walls break down and when the loop is gently pulled from the suspension it
will be thick and stringy.

3. Vancomycin is an antimicrobial agent that acts on the wall of most gram-

positive bacteria. Heavily inoculate the organism onto the surface of a sheep
blood agar plate and place a 5-ug vancomycin disk on the inoculated area. Any
zone of inhibition of growth after overnight incubation usually indicates a gram-
positive bacterium. Many lactic acid bacteria are typically resistant to
vancomycin. Some gram-negative organisms, especially Moraxella and
Acinetobacter, may be sensitive to vancomycin. Conversely, most gram-
negative bacteria are susceptible to polymyxin at 10ug/ml.

4. Maconkey agar is selective for the growth of gram-negative bacteria. Gram-

positive organisms are inhibited by the crystal violet and bile salts.

5. Columbia colistin-nalidixic acid agar (CNA) is selective for the growth of

gram-positive cocci.