09/11/2016 Umensaiooutoflaboratrio:umexemplodecasoparaoefeitodoexercciointensivosobreritmosdaexpressodogenedorelgiohumano

Jritmoscircadianos.201311:10. PMCID:PMC3846773
Publicadoonline2013setembro3.doi:10,1186/174033911110

Umensaiooutoflaboratrio:umexemplodecasoparaoefeitodo
exercciointensivosobreritmosdaexpressodogenedorelgiohumano
AkihikoOkamoto, 1TakuroYamamoto, 2RitsukoMatsumura, 1KoichiNode, 3eMakotoAkashi 1
1
OInstitutodePesquisadeEstudosdeTempo,UniversidadeYamaguchi,16771Yoshida,Yamaguchi7538511,Japo
2
MedicalLaboratoryTechnologyResearch,MedicalUnidadedeNegcios,R&DDiv,SonyCorporation,1545Yushima,Bunkyoku,Tokyo1138510,
Japo
3
DepartamentodeMedicinaCardiovascular,UniversidadedeSaga,511Nabeshima,Saga8498501,Japo
Autorcorrespondente.
AkihikoOkamoto:okamoto@yamaguchiu.ac.jpTakuroYamamoto:Takuro.Yamamoto@jp.sony.com RitsukoMatsumura:rfriz44@yamaguchiu.ac.jp
KoichiNnode@cc.sagAu.ac.jpMakotoAkashi:akashima@yamaguchiu.ac.jp

Recebeu2013maio4Aceito201305deagosto.

Copyright2013Okamotoetal.licenciadoBioMedCentralLtd.

EsteumartigodeAcessoLivredistribudosobostermosdalicenaCreativeCommonsAttribution(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0),que
permiteusoirrestrito,distribuioereproduoemqualquermeio,desdequeaobraoriginaldevidamentecitada.

EsteartigofoicitadoporoutrosartigosemPMC.

Abstrato Vamospara:

fundo
Emboraforadelaboratriodeinvestigaodorelgiocircadianohumanoaonveldaexpressodegenesdo
relgiopermanecedifcil,ummtodorecenteusandoclulasfolicularesdecabelopodemserteis.Enquanto
exercciopodefuncionarcomoumtacodearrastamentoderitmoscircadianos,noficaclaroseoexerccioafetaa
expressodogenerelgiocircadianohumano.

Mtodos
Osesforosparaobservarefeitosaparentesdoexercciosobreaexpressodogenedorelgioexigequesejam
cumpridasvriascondiesespecficas:oexercciointensodeveserhabitualmenterealizadaemumtempo
relativamenteincomumdodiaduranteumperodoprolongadoequalquermudanadefaserelativa,assim,
observadodeveservalidadoporcomparaodeexerccioseperodosnoexerccio.Wakeupehorriosdas
refeiesdevesermantidoquaseconstanteaolongodoperodoexperimental.Opresenteestudofoirealizado
utilizandoumlutadorprofissionalquesereuniucomessescritriosrigorososcomosujeito.amostrasdeplos
faciaisforamcoletadasemintervalosde4hemtornodorelgioparadeterminarritmosdaexpressodogenedo
relgio.

resultados
Duranteumperodoemqueaformaonoturno(20:0022:00)erahabitualmenterealizada,circadianoexpresso
dogenedorelgiofoide2a4hatrasodefaseemcomparaocomque,duranteumperodonoexerccio.nvel
mximoeamplitudecircadianadaexpressodogenedorelgionoforamafetadospelotreinamentonoturno.

concluso
Nossasobservaesexperimentaisilustramapossibilidadedequeoexercciofsicointensopodeafetarfortemente
afasecircadianadaexpressodogenedorelgio.Exercciopodeser,portanto,eficazparaotratamentoclnicode
distrbioscircadianos.Osresultadostambmsugeremqueosatletaspodemexigirprogramaocuidadosade
exercciofsicointensoparamanterafasecircadiananormalegarantirodesempenhoatlticoideal.

fundo
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fundo Vamospara:

Orelgiocircadianopermitecercade24hritmosnaexpressogentica,queporsuavezlevaaoscilao
circadianoemdiversosprocessosfisiolgicose,assim,permitequeosorganismosvivosparaseadaptarrotao
daterra.Investigaodomecanismoderelgiocircadianorequeroexamedaexpressodogenerelgiocircadiano,
jqueoclockdoncleocompostodeumfeedbackdetranscriocelularautnomalaos[1,2].Afasedo
relgioajustadoporestmulosexternos,edepoissincronizadocomaluzexternaciclo/escuro[3,4].Aluz
bemconhecidacomoumafortesugestoambientalpararearmecircadiano,enquantooexercciotambmpensada
paradesempenharumpapeldeajustamentodefase[5].Noentanto,osefeitosdoexercciosobreafasedosritmos
deexpressodegenesdorelgiohumanonosejamcomunicados.

Comoevidenciadopelacorrelaoentreadisfunocircadianaeaincidnciadedoenaspatolgicas,taiscomo
distrbiosdosono,sndromasmetablicas,doenascardiovasculares,distrbiosdohumoredocancro[610],
novasestratgiasparamonitorizaraexpressodogenedorelgioemsereshumanossonecessriasparaprevenir
ritmocircadianodoenasrelacionadoscom[11,12].Almdaavaliaomdicadedistrbiosdoritmocircadiano,
apesquisabsicaemtrabalhoporturnosejetlageaplicaescronofarmalgicostambmexigemestratgias
eficazesparaestudaraexpressodogenedorelgiohumano.Noentanto,afaltadeummtodoestabelecidoparaa
avaliaodaexpressodegenesdorelgiocircadianotemimpedidooprogressodoestudodosritmoscircadianos
humanos.

Emboraamediodemelatoninatemsidotradicionalmenteadoptadaemetabolitosnosorotmsidorecentemente
utilizadascomomarcadorescircadianos,estessoafectadospelomascaramentoclarasouinduzidaporalimentao,
eporconseguintenecessitamdeumambientecontroladonointeriordolaboratrio.Maisfundamentalmente,a
investigaodopacemakercircadianoexigeoexamedaexpressodogenerelgiocircadiano,jqueoclockdo
ncleocompostodeciclosdefeedbackdetranscriocelularesautnoma.Nossomtodoutilizandoclulasdo
folculopilosorecentementeapuradospodemresolverestesproblemasepromoverainvestigaodeoutof
laboratriodorelgiohumano,aindaqueeleaindarequeraprimoramentotcnico[13].

Vriascondiesexperimentaispodepermitiraobservaodeumefeitoaparentedeexerccionaexpressodo
genedorelgio:emprimeirolugar,oexerccionodeveserrealizadaduranteodia,massimaumtempo
relativamenterarodediaEmsegundolugar,oexercciohabitualeintensivaduranteumalongaduraopodemser
necessriosparadetectarefeitosperceptveisterceiro,acomparaoentreexercciosenoexerccioperodos
permitiraconfirmaodamudanadefaseinduzidapeloexerccioequarto,Serviodedespertadorerefeio
vezesdevesermantidoquaseconstanteaolongodoperodoexperimentalparareduzirapossibilidadedequeos
dadosobtidosresultamdeoutrosdoqueoexercciofatores.Encontramosumlutadorprofissionalqueconheceu
estescritriosparaparticipardesteestudo.

materiaisemtodos Vamospara:

informaessujeitas
Ovoluntriofoiumlutadorprofissionalsaudveldosexomasculino,quefoienvelhecido34anosepesava92kg
nomomentodaamostragem.Suaingestocalricamantevepraticamenteinalteradoaolongodoperodo
experimental.Duranteoperododeexerccio,elefoisubmetidoaumtreinamentointenso20:0022:00(totalde2h
deexercciopordia),masnenhumexercciointenso(total0hdeexercciopordia)duranteoperododeno
exercciode16julho31agosto.oshbitosdevidaautoreportados(dormirecomer)dosujeitopermaneceu
constanteduranteoperodoexperimental.Emboranofomoscapazesdemonitoraraexposioaluzdoassunto,
eleestavaemcondiesescurasregularesnahoradedormir.

Coletadeclulasdofolculopiloso
vezesotempoefarelodedespertadorforamestabelecidoscombasenoshbitosdevidadosujeito.Oassuntofoi
convidadoaseabsterdeconsumirlcoolemexcesso,comerlanchesemexcessoetomarsestaslongasduranteos
diasdeamostragem.clulasdofolculopilosoforamrecolhidosporpuxararaizdocabelofacial,erapidamente
embebidoemtampodedissoluo(QuantiGeneVeritus).Osvoluntriosrecolhidosfolculofaciaiscabeloporsi
mesmoforadolaboratrio(casa,escritriooucentrodeformao)acadaquatrohorasaoredordorelgio(12:00,
16:00,20:00,24:00,4:00,8:00,12:00).Aamostragemduranteanoitefoirealizadasobluzambientedetrabalhoe
terminounoprazodecincominutosafimdeminimizarosefeitosinduzidospelaluz.Asclulasforam

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armazenadasa20Catmedio.Emcadapontodeamostragem,foramnecessrioscercadecincorazesde
plosfaciais.Emborapossamexistirdiferenasindividuaiseraciaisnorendimento,plosdapontadoqueixo
tendemaproduzirumamaiorquantidadedeARN.OpresenteestudofoiaprovadopeloConselhodeticada
UniversidadeSagaReview,efoiobtidoconsentimentoinformadodoassunto.

determinaomRNA
DeterminaodeRNAfoirealizadautilizandosondasdeADNramificado(QuantiGeneVeritus),comorelatado
anteriormente[13].Assondasforamconcebidospelaempresa,esuassequnciasnosorevelados.Comeste
mtodo,apurificaototaldeRNA,transcrioreversaeamplificaoporPCRnosonecessrios,ealvo
mRNA,assim,directamentedetectadosemsoluesdecitlise.OsdadosforamcorrigidospelaPp1anveis.

Cossenocurvadeajustededadosdaexperincia

AcrophasesforamcalculadosusandoumsoftwarechamadoAcro,quefornecidopeloDr.RobertoRefinetti.

Resultadosediscusso Vamospara:

Nscomparamosaexpressodogenerelgiocircadianoduranteumperododeexerccionoturnohabitualcom
que,duranteumperodonoexerccio(Tabela1).Oexercciofsicorealizadopelosujeitoenvolvidoumtipode
esportedecombate,ebastanteintenso.Nesteexperimento,asclulasdofolculopilosoforamcoletadasapartir
doqueixoacadaquatrohorasaoredordorelgio.Asvantagensdautilizaodeclulasfolicularesdecabeloso
dequeelespodemserobtidasrelativamentenoinvasivaeclulasfrescasnuspodeserobtidasimplesmentepor
arrancarosplos,semseparaodeclulasadicionais.Maisimportante,estasclulassoadequadosparao
isolamentodeARNtotaldeelevadaqualidade[13].Naspresentesexperincias,aexpressodogenefoi
detectadoutilizandoumensaiocombasenadeADNramificado(ADNb).Emnossaanliseanteriordaexpresso
circadianados7genesdorelgio,descobrimosque,enquantoaexpressodePer3,Nr1d1/Reverbe/Reverb
Nr1d2genesapresentaramflutuaescircadianosclarosebemreproduzveis,osPer2ePADgenesosciloucom
amplitudesmaisbaixas,eeramporissomenostilparaadetecodepropriedadescircadianos.ParaBmal1e
Npas2,apenaspequenasoscilaesforamdetectados.Decidimos,portanto,usaroPer3,Nr1d1/Reverbe
Nr1d2/Reverbgenesparaavaliaocircadianonesteestudo.

tabela1
informaessujeitas

Nsinvestigamosaexpressodogenerelgiocircadianonoassuntoduranteumperododetreinamentoduro
duranteanoite.24htempodecursodeamostragemfoirealizadaduasvezesdurantetantooexerccioeno
exerccioperodos("Exerccio+"e"Exerccio"),ereprodutibilidadefoiconfirmada(Figura1).Dedespertare
horasdasrefeiesforammantidosquaseconstantesaolongodoperodoexperimentalparareduzirapossibilidade
dequeosdadosobtidosapartirdeoutrosresultoudoqueoexercciofactoresexternos.Noperodooff(Exerccio
),Per3,Nr1d1/ReverbeNr1d2/Reverbforamexpressosemformacircadianocomumafasesemelhante
deindivduosquetmumestilodevidaregular[13]emgeral,opicodestestrsgenesdorelgioexpresso
observadoimediatamenteantesoualgumashorasantesdahoradedespertar.Osdadosdesriestemporaisajustar
umacurvacossenobem,earelaodefaseentrePer3,Nr1d1/ReverbeNr1d2/Reverbfoibem
reprodutvel.AcrophasesforamcalculadosusandoumsoftwarechamadoAcro,quefornecidopeloDr.Roberto
Refinetti.Duranteoperodoemqueaformaonoturno(20:0022:00)erahabitualmenterealizada(mostradocomo
"Exerccio+"),circadianoexpressodogenedorelgioeraclaramentepor2a4horasatrasadoemfasecomparada
coma"Exerccio".Estafasetardiafoiobservadanaexpressodetodososgenescircadianorelgioexaminados
opicodeexpressodestesgenesfoidetectadologoapsoualgumashorasapsahoradedespertar.Embora
PER3,NR1D1eNR1D2nosocomponentesdociclodefeedbacknegativoncleoclssica,arelaodefase
entreestestrsgenesePer2ritmosdeexpressotemsidobemreprodutvelentrequasetodososassuntosque
examinamosatagora.Mesmosobcondiesdeavanodefasedeestilodevida,arelaodefasefoibasicamente
mantidaantesedepoisdamudanadefase,oquesugerequeestestrsgenessotambmmarcadoresfiveisda
maquinariadoncleorelgio.Onvelmximodeamplitudeecircadianodaexpressodogenedorelgiono
foramclaramenteafectadapelaformaonoturno(Figura2).Ns,portanto,confirmouqueoexercciointenso

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afetadosfaseapenasentreosparmetrosdeformadeondadaexpressodogenecircadiano.Emborapreliminares,
estasobservaesilustramapossibilidadedequeoexercciofsicointensonoitepodeafetarfasescircadianosde
expressodogenedorelgio.Almdisso,elessugeremqueosatletaspodemprecisaragendarexercciofsico
intensocomcuidado,afimdemanterafunorelgiocircadianonormalegarantirodesempenhoatlticoideal.

Figura1
Efeitosdoexerccionoturnaexcessivasobreafasedaexpressodo
genecircadiano.Emumatletaqueexecutouregularmenteexerccio
vigoroso20:0022:00,oritmoaexpressodogenedorelgiodasclulas
folicularescabelofacialfoimedidacomoramificado...

Figura2
Efeitosdoexerccionoturnaexcessivasobreaamplitudeeosnveis
mximosdeexpressodogenecircadiano.Asamplitudesrelativas(topo)
eosnveismximos(parteinferior)deritmosdeexpressodegenesdo
relgioforamcalculados,easmudanasaolongodotemposomostrados.
Depoisde...

Ospresentesdadosfornecemevidnciaspreliminares,maspromissores,indicandoqueoexercciointensohabitual
afetafasecircadiana.Estamospresentementeincapazdeexplicaromecanismodemudanadefaseinduzidapelo
exercciovistoaqui.Noentanto,combaseemrelatriosanteriores,especulaseduasexplicaespossveis.Em
primeirolugar,oexerccioaumentaatemperaturadocorpo,oquepoderia,porsuavezphaseshiftexpressodo
genecircadiano.Comefeito,foirelatadoqueatemperaturadoambientepoderiaalterarfasecircadianada
temperaturacorporalcentralededeslocamentodefaseaexpressodogenecircadianonosfgadosdosratos[14].
Emsegundolugar,oexercciointensoestimulaasecreodecortisol,queinduzseriadirectamenteou
indirectamentedeslocamentodefasecircadiana.Glucocorticideatuafortementeemrelgiosperifricosemratos[
15].Emadioaestasexplicaes,oexercciopodetambmafectarasconcentraesdeoutrosfactores
transmitidaspelosangue,que,emseguida,provocaroarrastamentocircadiano.

Opresenteestudopodeindicarque,umavezmomentoerradocircadianodeexercciointensopodeserumfator
perturbadorcontraomecanismodorelgiocircadiano,aintroduodoconceitodetemporizaocircadianana
formaoeexerccioregimestalvezdeimportnciaparaosatletas.Almdisso,oexercciointensopodeserum
fatorpromissornotratamentoclnicodedesordenscircadianasejetlag.

concluso Vamospara:

Apesardeaindapreliminar,opresenteensaiosugereapossibilidadedequeoexercciofsicointensopodeafetar
fortementeafasecircadianadaexpressodogenedorelgio.regimesdeexercciopode,portanto,sertilparao
tratamentoclnicodedistrbioscircadianos.Poroutrolado,osdadoslevantampreocupaesqueosatletaspodem
exigirprogramaocuidadosadeexercciofsicointensoparaassegurarfasecircadianonormaleodesempenho
atlticoptima.

Interessescompetitivos Vamospara:

Osautoresdeclaramquenotminteressesconflitantes.

Contribuiesdosautores Vamospara:

AOrealizadosensaiosdeexpressognica.TYrecolhidoseanalisadosdados.RMassistidacomrecolhaeanlise
dedados.KNassistidacomaelaboraodomanuscrito.MAconcebeuoprojeto,supervisionadoensaiosde
expressognicaeelaborouomanuscrito.Todososautoresaprovaramomanuscritofinal.

Agradecimentos Vamospara:

AgradecemosShikoYamashita,HaruhikoSoma,AkioYasuda,RieIchiyamaeRumikoImaizumiporsua
assistnciatcnicaespecializada.EsteestudofoiapoiadoporbolsasdaSociedadeJaponesaparaaPromooda
Cincia.

Referncias
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