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1 AULA PRTICA
Obteno de soro e plasma
INTRODUO:
O sangue representa o mais importante lquido do organismo e duas
partes o constituem: a slida e a liquida. A primeira formada pelos elementos
figurados, leuccitos, plaquetas e eritrcitos e a segunda pelo plasma, que est
limitado ao sistema vascular.
A obteno do plasma se faz retirando o sangue com anticoagulante e
separando-se os glbulos por centrifugao ou sedimentao.
O plasma uma soluo aquosa contendo protenas plasmticas, sais
inorgnicos, compostos orgnicos diversos, tais como aminocidos, vitaminas,
hormnios, lipoprotenas, etc.
Entre as protenas plasmticas, podemos citar a albumina, as alfa, beta
e gamaglobulinas e o fibrinognio. A albumina, mais abundante, representa um
papel fundamental na manuteno da presso osmtica do sangue, no grupo
das globulinas esto os anticorpos (imunoglobulinas), sendo o fibrinognio
necessrio para a formao da fibrina, componentes final da coagulao
sangunea.
Diversas substncias insolveis ou pouco solveis em gua, como os
lipdios, podem ser transportadas pelo plasma devido ao fato de se cominarem
com as albuminas, alfa e beta globulinas.
O soro se obtm aps coagulao do sangue. O coagulo ao se retrair
prende os glbulos em suas malhas de fibrina e pela retrao deixa sair um
liquido: o soro.
A composio do plasma e soro diferente. Neste inexistem, ou existem
em pequena quantidade, determinadas substancias que foram utilizadas para
coagulao sangunea.
Vrios fatores intervm no fenmeno da coagulao sangunea. Este
fenmeno se daria segundo o mecanismo intrnseco e extrnseco.
O processo de coagulao do sangue pode ser retardado ou evitado
mediante o emprego de anticoagulantes, que podem ser empregados in vitro.
In vivo ou em ambas as situaes que atuam interferindo em algum ponto do
processo de coagulao como por exemplo: os oxalatos que precipitam o on
clcio ou a heparina que impede a ativao da protrombina.
A coletas do sangue para exames hematolgicos, qumicos e para
provas sorolgicas deve ser efetuado em jejum, pela manh e o sangue
empregado nestas pesquisas, geralmente o sangue venoso.
MATERIAL E MTODOS
1) PUNAO VENOSA
- Garrote
- Seringa de 10.0 ml (estril)
- Agulhas de 25 x 8
- Algodo hidrfilo
- lcool
- Tubos de ensaio
- Estantes para tubo
- Canho para tubo vacuo
- Tubos vcuo contendo anticoagulante e sem anticoagulante
- Laminas para esfregao
- Colorao May-Grumwald-Giemsa.
- Microscpio
- leo de imerso
- Descarpak e lixo hospitalar
3) OBTENO DO SORO
MATERIAL:
- Tubo de 16 x 160 contendo sangue sem anticoagulante.
- Centrfuga
- Pipeta Pasteur
- Tubo de hemlise
1) Determinao do Hematcrito
Mtodo: Microcentrifugao
Material:
Sangue total colhido na hora
Tubo capilar
Centrifuga de microhematcrito
Bico de Bunsen
Rgua de leitura de hematcrito
Procedimento:
Encher o tubo capilar com sangue previamente homogeneizado at 2/3 do tubo
Fechar a extremidade sem sangue com massa especifica ou aquecimento em
chama
Centrifugar 3 a 5 minutos (o tempo dever ser determinado atravs da
padronizao para cada centrifuga)
Realizar a leitura em tabela prpria
Fazer o menisco inferior coincidir com a linha zera e o menisco superior com a
linha 100%
Determinar a linha de separao entre a coluna de hemcias sedimentadas e o
plasma, desprezando a fina camada de leuccitos e plaquetas que se formam
nesta regio
O resultado expresso em %, e os valores de referncias variam com o gnero
Valores de Referencias
Hematcrito %
RN at 3m 1 1a3 3a5 5 a 10 10 a 16 Acima de 16
15 dias ano anos anos anos anos Fem Mas
52 33-41 33-41 33-41 33-41 35-52 37-47 40-54
2) Dosagem de hemoglobina
Mtodo: cianometahemoglobina
Material:
Sangue total colhido na hora
Pipeta de 2,5 mL
Micropipeta 0,01mL
Pra
Soluo de Drabkin
Espectofotmetro
Tubos de ensaio 12x75mm
Padro de hemoglobina
Reagentes:
Soluo de Drabkin
Bicardonato de sdio ------ 1 g
Cianeto de potssio -------- 0,05g
Ferrocianeto de potssio 0,20g
Agua destilada qsp --------- 1000mL
Obs: mantes em frasco escuro na geladeira e manipular com cuidado por
conter cianeto (veneno). Aps o preparo possui validade de 1 ms
Procedimento:
Branco Padro Teste
Soluo de Drabkin 2,5 mL 2,5mL 2,5mL
Padro - 0,01mL -
Amostra homogeneizada - - 0,01mL
gua destilada 2,5 mL
Homogeneizar e deixar os tubos em repouso durante 5 minutos
Ler a D.O. no espectrofotmetro em 540nm, zerando com o tubo branco
Valores de referncia
Hemoglobina g/dL
RN 3m 1a3 3a5 5 a 10 10 a 16 Acima de 16
at 15 1 ano anos anos anos anos Fem Mas
dias
17 10,3- 10,6- 11,0- 11,5- 11,5- 11,5- 12,8-
12,7 13,0 14,5 14,0 15,0 16,0 16,9
3) Contagem total de hemcias
Contagem de hemcias
Material:
Sangue total colhido na hora
Pipeta 2,0 mL
Micropipeta 0,01 mL
Pra
Micrscopio
Diluente da Dacie
Cmara de Neubauer
Laminula
Cmara mida
Tubos de ensaios 12x75
Reagentes
Diluente da Dacie: (citrato trissdico)
Citrato trissdico -------- 31,8g
Formol 4% ---------------- 10 mL
gua destilada qsp ----- 1000mL
Procedimento
Em um tubo de ensaio diluir 0,01mL de sangue em 2,0 ml de diluente de Dacie
Homogeneizar e encher a cmara de Neubauer
Repousar durante 5 minutos em cmara mida
Contar em objetiva de 40x 5 dos 25 quadrantes do quadrado central da cmara
de newbauer
Clculo
Hemcias/mm3 = n de hemcias contatas nos 5 quadrantes x fator de diluio
x 10.000
Valores de referencia
Hemcias (milhes/mm3)
VCM= Ht x 10
He
HCM= Hb x 10
He
CHCM= Hb x 100
Ht
Valores de referencia
VCM: 84 a 99mm3.
HCM: 26 a 32 pg.
CHCM: 31 a 36 g/dl.
3 AULA PRTICA
Anlise morfolgica das hemcias
1) Teste de Falcizao
Amostra: Sangue colhido em EDTA
Material: Sangue
Micropipeta 0,1mL
Lminas
Esmalte colorido
Soluo de metabissulfito 2%
Tubos de ensaio 12x75mm
Cmara mida
Lamnula
Procedimento: Misture 0,1mL de sangue em 0,1 mL de Metabissulfito de
Sdio, e coloque uma ou duas gotas da soluo em uma lmina e cubra com
uma lamnula sem deixar bolhas, em seguida vede as bordas da lamnula com
esmalte. Repouso por 30 minutos e examine em microscpio.
Reagente:
Metabissulfito de sdio ---------------- 0,05g
gua destilada --------------------------- 2,5 mL
Soluo deve ser preparada no momento do uso