Evaluacin de mtodos para la separacin eficiente de leucocitos

Johanna De Castro', Mara Orfa Rojas', Moiss Wasserman2

Resumen
En el uso de mtodos diagnsticos para parsitos de malaria, basados en PCR sobre
sangre completa, la presencia de leucocitos causa frecuentemente interferencias que
pueden llegar a enmascarar completamente los resultados. Para eliminar este
problema, se probaron diferentes metodologias para la remocin de clulas blancas
de la sangre total, basados en las densidades y tamaos de los componentes
sanguneos; par'controlar la remocin, se utiliz la reaccin en cadena de la DNA
polimerasa con!iniciadores arbitrarios, RAPD. La alta sensibilidad de este mtodo nos
permiti definir con una buena precisin que la filtracin de la sangre a travs de una
columna de'celulosa-sephadex G-25 permite las mejores remociones, si se compara
con otras 'matrices o con separaciones a travs de ficoll, dextrn o ficoll-dextrn.
Summary \.

In the use of diagnostic methods for malaria parasites, based on polymerase chain reac-
tion (PCR) in whole blood, leucocyte presence frequently causes interference which can
completely mask resuks.'ln order to avoid this problem, different methods were tested to
eliminate leucocytes from whole blood, based on the density and size of blood compo-
nents. This elimination procedure was controlled by DNA polymerase chain reaction us-
ing arbitraty primers (RAPD). This method's high sensitivity allowed us to accurately de-
fine that whole blood's filtration through a cellulose-sephadex G-25 column allgws the
best elimination, compared to other matrices or separation methods such as ficoll, dext-
ran or ficoll-dextran.

En estudios bioqumicos o moleculares de puede llegar a enmascarar el resultado

parsitos intracelulares es indispensable
distinguir qu actividades corresponden a la
clula husped y cules al parsito. Esta
situacin crea la necesidad de separar los
componentes celulares, pues, de seguir
mezclados se vera afectada la validez de los
datos experimentales.
En el caso de Plasmodium falciparum, por
ejemplo, en cualquier mtodo diagnstico que
utilice tcnicas tan sensibles como la reaccin
en cadena de la DNA polimerasa, la presencia
de contaminaciones traza de DNA humano
constituye una interferencia de tal magnitud que
esperado (1).
Tradicionalmente, se han empleado diversas
estrategias para la separacin de clulas
blancas de la sangre completa; estas
estrategias se basan en la densidad de las
diferentes clulas de la sangre, afinidades
especficas de las clulas por diferentes
soportes, propiedades de adhesin, etc. La
tcnica ms utilizada ha sido la separacin de
clulas en colchones y gradientes de densidad
como el ficoll, el dextrn y el percoll (2-6).
Tambin, con menos xito, se ha utilizado el
fibringeno y las fitohemaglutininas (3). Sin em-

Grupo de B oq-irrra nsi i ~ i hac

o una de Sa ~ dSania
, Te oe Bogoie Co omb 3
Gr.lpo oe B oq.:m ca nsi i.iio hac ona oe Sa JO y Faccliao oe C enc as. J n ver5 dao hac ona de Co oino a. Saliva f:e oe
Bogot, Colombia.

98
Biorndica 1996:16:98-104
bargo, el principal inconveniente en la aplicacin
de la metodologa tradicional de separacin de
componentes sanguneos radica en que su
enfoque va dirigido a la recuperacin de clulas
blancas y a la eliminacin de clulas rojas, sin
importar si hay lisis de estas ltimas. En
nuestro caso, se necesita conservar la clula
roja intacta -por ser hospedera del parsito en
estudio- y libre de los otros componentes
sanguneos por las razones anotadas
anteriormente.
Se han diseado otras estrategias ms
modernas de separacin mediante cromato-
grafas de afinidad, utilizando diferentes
anticuerpos contra los antgenos de superficie
de las clulas blancas (5-7); sin embargo, estas
tcnicas permiten la separacin de poblaciones
especficas de glbulos blancos y desechan las
clulas rojas.
En 1976, Beutler mencion la utilizacin que,
desde 1928, se haca del algodn para remover
leucocitos de la sangre (8). Esta fue la
metodologa seguida durante muchos aos para
preparar concentrados de clulas rojas con
remocin parcial de clulas blancas para
transfusin y la base para el desarrollo del
mtodo utilizado por ellos. Estos autores
compararon las eficiencias de columnas
empacadas con diferentes tipos de celulosa e
informaron haber obtenido los mejores
resultados con una mezcla de celulosa
microcristalina-sephadex G-25, en relacin 3 : l
(vM.
En este estudio, se probaron varios mtodos de
separacin de clulas blancas de la sangre total
teniendo en cuenta bsicamente las diferencias
de densidades y tamaos de los componentes
de la sangre; la eficiencia de cada proceso se
evalu mediante la reaccin en cadena de la
DNA polimerasa con iniciadores arbitrarios
(RAPD), que e s una tcnica de altsima
sensibilidad y en cuya aplicacin surgi el
problema de interferencia que nos ocupa.
Materiales y mtodos
Remocin de leucocitos de la sangre
1.Centrifugacin en colchones de densidad
constante
EVALUACION DE METODOS PARA LA SEPARACION DE LEUCOCITOS
Se recolect 1 mL de sangre, tipo O Rh+, por
puncin venosa, utilizando CPD-A3, (15 mM
cido ctrico, 90 mM citrato de sodio, 16 mM
fosfato de sodio monobsico, 250 mM
dextrosa, 4 mM adenina, pH 5,9), como
anticoagulante. La sangre fresca se centrifug
a 200 x g (Centrfuga International, modelo
HN, rotor 215), a temperatura ambiente,
durante 10 minutos para eliminar el plasma, y
mediante un conteo en cmara de Neubauer,
se determin el contenido de clulas blancas
totales. Las clulas rojas sedimentadas se
resuspendieron vlv en HBS (160 mM NaCI, 20
mM HEPES cido. pH 7,4) y se adicionaron
suavemente por las paredes de un tubo de 2
mL, sobre un colchn de 1 mL de ficoll
(Pharmacia) (4) o de dextrn (Sigma) (3); se
ensay, adems, un lavado consecutivo con
ficoll-dextrn en las mismas condiciones
mencionadas anteriormente. Despus de
descartar el sobrenadante que contena las
clulas blancas, se lavaron las clulas rojas
dos veces con HBS. Finalmente, se calcul el
porcentaje de remocin por conteo de clulas
en cmara de Neubauer.
2.Filtracin a travs de columnas de algodn en
rama, algodn comercial-Alfitex y celulosa
microcristalina mezclada con sephadex G-25
El algodn se sumergi en NaCl 0,15 M y se
esteriliz en autoclave por 20 minutos a 15
libras de presin por pulgada cuadrada. La
celulosa y el sephadex se hidrataron por
separado en NaCl 0,15 M durante 24 horas a
temperatura ambiente; se mezclaron en relacin
3:l (vlv) y se utilizaron para empacar columnas
con un volumen de matriz de 4 mL en jeringas
de 5 mL (8). Sobre la columna, se agreg 1 mL
de sangre venosa fresca anticoagulada con
CPD-A3, a la cual previamente se le haba
hecho un recuento de glbulos blancos. La
elucin de las clulas se hizo con 10 mL de
NaCl 0,15 M mediante presin ejercida con el
mbolo de la jeringa; este proceso de filtracin
debe durar aproximadamente 10 minutos (8,
10). Finalmente, las clulas eluidas, se
centrifugaron a 200 x g (Centrfuga International,
modelo HN, rotor 215) para eliminar el exceso
de eluyente y mediante un nuevo recuento de
DE CASTRO J., ROJAS M.O.,WASSERMAN M.
leucocitos (cmara de Neubauer) se calcul el
porcentaje de remocin.
Ensayo de RAPD para confirmar la remocin
de leucocitos
Para confirmar la remocin efectiva de
leucocitos, se tomaron las clulas rojas
empacadas, obtenidas por centrifugacin o
filtracin, y se lisaron con saponina 0,15% en
HBS, por 10 minutos a 37C (11); los lisados se
lavaron dos veces con HBS y se trataron por 24
horas a 60C con 0,01 M EDTA, pH 8, 0,01 M
tris HCI, pH 8, 0,1% tritn X-100 y 0,2 mg/mL
proteinasa K, para permitir la digestin de
protenas, la lisis de los glbulos blancos y la
liberacin del DNA humano, en el caso de la
permanencia de clulas leucocitarias despus
del tratamiento aplicado. Como control poSitivo
en la reaccin de amplificacin, se utiliz
sangre anticoagulada con CPD-A3 sin ningn
tratamiento previo y, como control negativo, una
muestra sin DNA. Con los extractos crudos, se
llevaron a cabo ensayos de RAPD, de acuerdo
con el mtodo estandarizado previamente (1);
brevemente, los perfiles de temperatura
incluyeron una denaturacin inicial a 95"C/5min,
10 ciclos de denaturacin a 95"C/lmin, anillaje
a 2O0C/lmin con un incremento de la
temperatura de l0C/min hasta alcanzar la
temperatura de extensin de 5O0C/min;
posteriormente, se hicieron 20 ciclos en los
cuales el anillaje se hizo a 25"Cimin con un
incremento de temperatura de 6"CI min hasta
alcanzar la de extensin. Finalmente, se
termin con una extensin a 72"CilO min.
Como iniciador en la reaccin de amplificacin,
se utiliz un oligonucletido de 10 bases (R3)
previamente diseado por nosotros (5'-
GGCTACATCA-3')(1). Las muestras amplifi-
cadas se corrieron en geles de poliacrilamida
4%-rea 7 M a 100 V por 4 horas y se tieron
con plata de acuerdo con el protocolo
previamente descrito (1).
Resultados
Centrifugacin en medios de densidad
constante
LOS resultados para 10s dos colchones de
densidad constante utilizados fueron muy
similares; microscpicamente, se detect la
presencia de clulas polimorfonucleares y una
remocin mxima del 81%. Al utilizar la
secuencia ficoll-dextrn, la eficiencia de
remocin no aument significativamente y el
mximo de remocin alcanzado fue de 82%. La
deteccin de las clulas blancas que
permanecieron despus del ensayo, mediante el
RAPD, se muestra en la figura 1. En los carriles
3-8, se amplificaron los lisados de las muestras
provenientes de los diferentes tratamientos y, en
los carriles 1 y 2, la sangre que no fue sometida
a ningn tratamiento; en todos los casos, la
amplificacin fue similar y permiti detectar el
DNA contaminante.
Filtracin a travs de diferentes matrices
En el caso de la filtracin en columnas de
algodn comercial, algodn en rama y la mezcla
celulosa microcristalina-sephadex G-25, los
porcentajes de remocin varan entre 80 y,
aproximadamente, 100%, respectivamente. El
resultado con el algodn fue similar al obtenido
con los colchones de densidad constante; sin
embargo, el algodn en rama mostr una mayor
retencin de clulas blancas. De manera simi-
lar, la celulosa utilizada como matriz permiti
remociones cercanas al 100%. Para corroborar
los resultados microscpicos o, en otras
palabras, detectar con una mxima sensibilidad
la permanencia del DNA proveniente de clulas
blancas en los eritrocitos despus de cada
tratamiento, se realiz el ensayo de RAPD. En
la figura 2, se observa el resultado de la
amplificacin de los lisados de la sangre filtrada
en columnas de algodn; como se puede
observar, el patrn de amplificacin generado
por estas muestras corresponde al del DNA
humano. Comparando los resultados del RAPD
para las muestras provenientes de los
colchones y para las muestras provenientes de
las columnas de algodn se estableci que la
contaminacin con DNA humano persiste y que
todos los resultados muestran un patrn similar
de amplificacin entre s y con la sangre
com~leta(sin ninan tratamiento) usada como
control positivo. Al amplificar ei lisado de la
Sangre filtrada a travs de C O I U ~de~ C~~SI U I O S ~
microcristalina-sephadex G-25, no se pudo
 EVALUACIONDE METODOS PARA LA SEPARACION DE LEUCOCITOS

Figura l. Un mL de sangre
completa y fresca se prepar
como se describe en materiales
v mtodos. Se oas a travs de
os diferentes 'colchones y se
lis con saponina. Un microlitro
de este lisado se someti a
amplificacin por RAPD (1-2),
sangre completa sin pasar por el
colchn, utilizada como control
(3-4), sangre pasada por
colchn de ficoll (5-6),sangre
pasada por dextrn (7-E),
sangre pasada por ficall-
dextrn (9), 3,5 k g DNA
humano usado control positivo
(lo),500 ng DNA Ladder 1 kb
usado como marcador de
tamatio.

-~
Fiours 2.
~ - .
Dos mL de sanore m m ~ .., . .
l e t a ~ sDreDararon
e como se describe en materiales v mtodos: 1 mLse pas a travs
oe jna columna de 4 m~-oeagodoh'en rama y el otro por una a>lumna.de 4 ml oe algodon comercial. Despus de la
f.lrracin. os er trocios se saron con saponina y de este lisaao sc lomaron a ic~otaspara la amplilicacion. Cada punto
se hizo par duplicado. (1-6),sangre fipaba,a travs de algodn en rama; (1-2),1 $-del l i d o ; (54),5 @del lisado y
(5-6)lo pL del Iisado, (7) 3,5 pg DNA humano usado control positivo; (9-12),sangre filtrada a travs de algodn
comercial, (9-lo), 5 WLdel lisado y (11-12),1 @Ldel lisado. (8) y (13)500 ng DNA Ladder 1 kb utilizado como marcador
de tamao
f
DE CASTROJ.,ROJAS M.O., WASSERMAN M.

detectar la presencia de DNA humano En estas condiciones, el colchn de ficoll nos

contaminante, resultado concordante con la
observacin microscpica. Estos resultados se
observan en la figura 3, en la cual las muestras
no generaron ningn patrn de amplificacin.
Discusin
Como se plante inicialmente, en trabajos
moleculares o enzimticos con microorganis-
mos intraeritrocitarios, la presencia de
leucocitos representa una fuerte interferencia
debido a su contenido de DNA y a su actividad
bioqumica. Con el fin de superar este
inconveniente, probamos diferentes tcnicas
clsicas descritas en la literatura para la
remocin de leucocitos de la sangre completa y
comprobamos su eliminacin mediante un
ensavo altamente sensible como lo es la
ampliicacin en cadena de la DNA polimerasa
con iniciadores arbitrarios, RAPD. La sangre
completa extraida de un paciente est
constituida por una poblacin heterognea de
clulas blancas desde el punto de vista de sus
caractersticas fsicas como la morfologa y la
densidad. En la primera estrategia empleada,
aprovechamos la diferencia de densidad de las
clulas blancas. Los dos colchones utilizados
nos permitieron contar con medios de
separacin de densidades diferentes (1,077 g/
mL para el ficoll y 1,113 g/mL para el dextrn).
permiti la separacin de mononucleares
(d=1,06 glmL) y plaquetas (d=1,04 g/mL),
mientras que los polimorfonucleares(1,O9 g/mL)
precipitan con los eritrocitos que son agregados
por el ficoll. Esta situacin se reflej claramente
mediante el ensayo de RAPD, donde el patrn
obtenido con el DNA humano usado como con-
trol positivo es similar al patrn de las muestras
despus del tratamiento (figura 1, carriles 1-4).
Por microscopa, se pudo determinar que la
remocin no super nunca el 80% (el ensayo se
repiti, por lo menos, 7 veces) y, por tanto, el
20% restante fue suficiente para mostrar un
patrn de amplificacin o, en otras palabras, la
presencia de DNA humano contaminante en las
clulas rojas procesadas.
El dextrn funciona bajo el mismo principio o
fundamento que el ficoll, pero con otra densidad,
que cubre la poblacin celular que escapa al
ficoll. Sin embargo, aunque comparativamente
disminua la poblacin de polimorfonucleares, la
remocin no super el 80% por lo cual se
continuaba observando un patrn de
amplificacin similar al obtenido con el ficoll y
con la sangre completa utilizada como control;
este ensayo se repiti cinco veces (figura 1,
carriles 5 y 6).

Figura 3. Un mL de sangre completa,

anticoagulada con CPD-A3, se pas a travs de
una columna de 4 mL de celulosa
microcristalina-sephadex 6-25, en relacin 3:l
(v/v) como se describe en materiales y
mtodos. El filtrado se centrifug y el
precipitado se lis con saponina. Se
amplificaron diferentes volmenes del lisado
por duplicado. (1-4), sangre filtrada a travs de
celulosa-sephadex; (1-2), 1 KL del lisado y (3-
4), 5 WLdel lisado; (5-6), sangre completa sin
filtrar, utilizada como control positivo. (7)
muestra sin DNA utilizado como control
negativo, (8) 500 ng DNA Ladder.1 kb utilizado
como marcador de tamao.
Biorndica1996;16:98-104
Finalmente, la utilizacin ficoll-dextrn, con
miras a una separacin secuencia1 mono-
nucleares-po1imorfonucleares no aument la
remocin y, microscpicamente, se pudo
establecer que muchos ms polimorfonucleares
escaparon al colchn, posiblemente porque este
tipo de clulas, a la presin osmtica ligera-
mente aumentada del ficoll, pierden agua y
aumentan su densidad lo que les permite migrar
a travs de l y, tal vez, tambin a travs del
dextrn (figura 1, carriles 7 y 8) (12).
Para la segunda estrategia de filtracin en
columna, empacada con celulosa de diferente
concentracin y pureza, el fundamento se basa
en que este material es capaz de unir las
clulas blancas mediante interaccin dbil,
mecanismos de adhesin e impedimento
mecnico. Los mecanismos pueden combinar-
se y clulas como los polimorfonucleares
pueden adherirse indirectamente por agregacin
entre ellas o por unin a factores plaquetarios.
Como factor importante en estas conside-
raciones, se tom la diferencia en dimetro de
las poblaciones celulares sanguneas que,
exceptuando los basfilos y los eritrocitos,
estn entre 10-20 mm. Para evitar que algunos
eritrocitos se queden atrapados en la columna,
se aument el volumen de elucin de glbulos
rojos utilizando 10 mL de NaCl 0,15M por cada
mililitro de sangre. Por otra parte, es posible
que algunos basfilos escapen a la retencin
por parte de la columna, pero, tanto las
interacciones indirectas como su escasa
presencia en la sangre total (0-1%) permiten
despreciar la contaminacin que puedan
generar.
Las columnas de algodn, que en su forma ms
pura contiene 90% de celulosa, mostraron una
remocin semejante a la obtenida con el ficoll y
el dextrn. Al realizar la amplificacin de estos
lisados, se 0 b s e ~ cmo la contaminacin con
DNA humano era detectada como un patrn de
bandas similar al control positivo (figura 2,
carriles 1-6 y 9-12).
Se utiliz, adems, la celulosa microcristalina
comercial, sustancia blanca, insoluble en agua
u otros solventes usuales, segn el mtodo
descrito en (8). Esta celulosa tiene forma de
barras rgidas que se hidratan en agua y se usa
comnmente en cromatografa en columna y en
EVALUACION DE METOOOS PARA LASEPARACION DE LEUCOCITOS
capa fina. La celulosa microcristalina se mezcl
en proporcin 3 : l v/v con sephadex G-25 cuyo
dimetro de partcula oscila entre 20 y 50 mm
cuando est hidratado y cuya finalidad es
funcionar como espaciadorde las partculas de
celulosa. Con esta columna, la remocin
alcanz valores de 100% por examen
microscpico. Aunque en el ensayo micros-
cpico puede haber subjetividad, los ensayos de
amplificacin por RAPD no mostraron el patrn
correspondiente a la presencia de DNA humano;
el ensayo fue repetido, por lo menos, 20 veces
(figura 3, carriles 1-4). Es muy importante
controlar el tiempo de filtracin ya que la
interaccin celulosa-glbulos blancos es dbil y
los tiempos prolongados de filtracin facilitan la
liberacin de las clulas unidas a la matriz. La
literatura informa la utilizacin de diversos filtros
que, bajo el mismo principio, remueven glbulos
blancos de la sangre completa para evitar
complicaciones transfusionales (9); este tipo de
material posiblemente permite eficiencias
mayores; sin embargo, en este estudio no
disponamos de estos materiales para efectuar
el ensayo.
En este estudio, el mtodo de remocin de
leucocitos de la sangre a travs de columnas de
celulosa-sephadex mostr los mejores
resultados y ha sido ensayado hasta ahora con
muestras simuladas en el laboratorio para
detectar polimorfismo genmico en Plasmodium
falciparum. Posteriormente, se probar con
muestras clnicas de pacientes malricos, en
las cuales se pretende estudiar la hetero-
geneidad de la poblacin circulante de parsitos
en reas endmicas.
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