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SCHULLER, UTILIZACIN DE CEPAS GENTICAMENTE MODIFICADAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, PG.

UTILIZACIN DE CEPAS GENTICAMENTE MODIFICADAS DE


SACCHAROMYCES CEREVISIAE EN ENOLOGA
Dorit Schuller Margarida Casal

Centro de Biologia, Universidade do Minho, 4710-057 Braga, Portugal


Departamento de Biologia, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal

Introduccin
La inoculacin de cultivos puros seleccionados de levaduras en el mosto es una prctica
enolgica nacida en 1970 con el objetivo de producir vinos con determinadas caractersticas
organolpticas y para garantizar una cierta continuidad a lo largo de las sucesivas cosechas.
Actualmente la mayor parte de la produccin del vino se basa en el uso de levaduras starter
que han sido seleccionadas fundamentalmente por su capacidad fermentativa. Estudios
biogeogrficos exhaustivos realizados a lo largo de muchos aos y la evaluacin de la flora
fermentativa de una determinada regin vitcola han sido el punto de partida para la
seleccin de las cepas de levadura y para los programas de mejora. No obstante es muy
poco probable encontrar en la naturaleza cepas de levadura que posean una combinacin
ideal de caractersticas enolgicas. En los aos sucesivos a la publicacin de la secuencia
del genma de Saccharomyces cerevisiae (Goffeau et al. 1996), nuevos instrumentos
genticos consintieron la construccin de cepas de levadura genticamente modificadas.
Actualmente, numerosos laboratorios de investigacin de todo el mundo han obtenido cepas
capaces de mejorar por ejemplo los resultados de la fermentacin, la eficacia del proceso y
la calidad organolptica del vino. Se ha evaluado atentamente sus comportamientos bajo
condiciones enolgicas. La futura introduccin de levaduras GM requiere tambin, de
acuerdo con las leyes actuales, una evaluacin detallada de la seguridad y del impacto
medioambiental, y probablemente las cepas obtenidas mediante autoclonacin, utilizando
material gentico que deriva del huesped, sern aprobadas. Sin embargo, la actitud crtica
de los consumidores hacia el uso de levaduras GM para la produccin del vino no han
cambiado durante los ltimos 10 aos y sta es la razn principal por la cual en la industria
enolgica no se usan cepas recombinantes. Este trabajo realiza un anlisis global de los
recientes progresos relacionados con las implicaciones del uso de cepas GM en la industria
enolgica. Hemos considerado diversos aspectos, como son las estrategias utilizadas para
la construccin de cepas que respeten las leyes en vigor, la evaluacin de los riesgos
medioambientales relacionados con la formacin de cepas GM, los mtodos ms
importantes para la determinacin del DNA recombinante y de las protenas, y las razones
que provocan la actitud crtica de los consumidores hacia el uso de las cepas GM.

Seleccin de cepas comerciales de levaduras


Recientes hallazgos han mostrado que restos contenidos dentro de una de las primeras
tinajas descubiertas en Egipto contenan DNA ribosomal de S. cerevisiae, lo que indica que
ya desde 3150 a.C. esta levadura era la responsable de la fermentacin del vino (Cavalieri
et al. 2003). La seleccin a lo largo de los milenios podra haber creado caractersticas
enolgicas nicas e interesantes, que de todas formas no estaban muy extendidas, y no se
encontraban combinadas dentro de una sla cepa. El punto de partida de un programa de
seleccin de cepas es siempre la seleccin clonal de cepas salvajes de Saccharomyces
aisladas a partir de la naturaleza en zonas vitcolas de inters. El uso de starters de
levaduras seleccionadas se encuentra muy extendido ya que presentan ptimas
caractersticas fermentativas y enolgicas, contribuyendo de este modo tanto a la
estandarizacin del proceso fermentativo como a la calidad del vino. Actualmente se
encuentran disponibles cerca de 150 cepas de levadura diferentes, representadas
principalmente por S. Cerevisiae. Considerando la tendencia actual hacia una produccin de
vinos de alta calidad y con caractersticas particulares, es necesario satisfacer la demanda
de los enlogos que piden levaduras especiales para caractersticas particulares
(Mannazzu et al. 2002; Pretorius 2000; Romano et al. 2003b).

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La definicin de una estrategia de seleccin adecuada debe ser funcin de los rasgos que
una levadura se supone deba presentar y del nmero de cepas que debern ser estudiadas.
Los compuestos sintetizados pueden variar de una cepa a otra, sobre todo entre cepas de
levadura de especies diferentes. Como se puede ver en el sumario presentado en la Tabla
1, se analizaron numerosas caractersticas enolgicas. Las caractersticas de tipo
tecnolgico se pueden obtener con el seguimiento de la evolucin de la fermentacin y los
datos cuantitativos se determinan a travs del anlisis qumico al final de la fermentacin.

Caractersticas enolgicas Comentario


Vigor fermentativo Concentracin mxima de etanol (%, v/v) producida al
final de la fermentacin
Deseable: buena produccin de etanol
Velocidad de fermentacin Gramos de CO2 producidos durante las primeras 48 h
de fermentacin
Deseable: rpido inicio de la fermentacin
Tipo de crecimiento en medio lquido Crecimiento disperso o floculante, velocidad de
sedimentacin Deseable: levaduras dispersas durante
el crecimiento, pero sedimentacin al final de la
fermentacin
Produccin de espuma Altura de la espuma producida durante la fermentacin
No Deseable: incremento de la produccin de espuma
Temperatura ptima de fermentacin Termotolerancia y criotolerancia estn relacionadas
con las propiedades enolgicas Temperatura ptima
de fermentacin entre 18 y 28C
Produccin de acidez voltil, cido actico Levaduras seleccionadas no deberan formar ms de
100400 mg/l durante la fermentacin
No Deseable: incremento de la produccin de acidez
voltil/cido actico
Degradacin o produccin de cido mlico Tanto la degradacin como la produccin son
deseables en funcin de las caractersticas del mosto.
La degradacin del cido mlico vara entre el 0 y el
20% dependiendo de la cepa de S. cerevisiae
Produccin de glicerol Deseable subproducto principal de la fermentacin (5
8 g/l) contribuye a la dulzura, cuerpo y redondez
Produccin de acetaldehdo Metabolito deseable en vinos de jerez, dulces y oporto
siendo un importante carcter aplicable en la seleccin
de cepas para vinos con crianza
Esteres, alcoholes superiores y compuestod voltiles Metabolitos deseables, influyen marcadamente en el
flavor del vino y dependen de la presencia de
precursores que derivan de la variedad y de la
madurez de la uva.
Cantidades limitadas participan positivamente en las
caractersticas sensoriales generales
Produccin y tolerancia al SO2 Agente antioxidante y antimicrobiano Deseable:
elevadas velocidad y vigor fermentativo en presencia
de las concentraciones de SO2 normalmente aplicadas
en vinificacin. Indeseable: excesiva produccin de
SO2
Produccin de H2S Determinado con el color de la colonia de las cepas en
un medio con indicador bismuto,ej. BIGGY Agar
H2S es perjudicial para la calidad del vino, considerado
olor desagradable a valores muy bajos (5080 g/l)
Resistencia al estrs Tolerancia a estrs cido/osmtico combinado
Resistencia al cobre Elevadas concentraciones de rame pueden provocar
paradas de fermentacin
Deseable: resistencia a la elevada presencia de cobre
y capacidad para reducir el contenido de cobre
Tabla 1: Caractersticas enolgicas consideradas en la seleccin de cepas de
Saccharomyces cerevisiae del vino

Encontrar cepas que posean una combinacin ideal de caractersticas enolgicas es muy
poco probable que ocurra; por tanto la seleccin de cepas se extiende tambin a las
levaduras no-Saccharomyces, por ejemplo Candida, Kloeckera, Debaryomyces,

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Hanseniaspora, Hansenula, Pichia, Metschnikowia, Schizosaccharomyces,


Saccharomycodes o Rhodotorula. Aunque las especies no-Saccharomyces no sean
competitivas en condiciones enolgicas, sobre todo porque no tienen una elevada energa
de fermentacin y presentan una menor resistencia al estrs comparadas con S. cerevisiae,
el uso de cultivos starter mezclados o de fermentaciones secuenciales (por ejemplo Candida
cantarellii/S. cerevisiae) han dado muy buenos resultados a la hora de conducir
fermentaciones con una mayor formacin de glicerol y menor produccin de cido actico
(Toro y Vazquez 2002). Las levaduras Torulaspora delbrueckii y Candida stellata se
considera que aportan propiedades positivas a las caractersticas sensoriales finales del
vino, mientras que las levaduras apiculadas como Kloeckera apiculata tienen un efecto
negativo sobre la calidad del vino a causa de la formacin de cido actico y de acetato de
etilo, asociadas a una baja produccin de etanol (Ciani y Maccarelli 1998).
Muchos estudios hacen referencia a la influencia beneficiosa y perjudicial de las levaduras
no -Saccharomyces sobre los compuestos voltiles del mosto si se consideran variedades
de uva diferentes (Ciani y Maccarelli 1998; Clemente-Jimenez et al. 2004; Granchi et al.
2002; Mingorance-Cazorla et al. 2003; Plata et al. 2003; Romano et al. 2003c), y tambin se
han encontrado diferencias importantes en estos compuestos entre cepas comerciales o
autctonas de S. cerevisiae (Patel y Shibamoto 2003; Romano et al. 2003a; Steger y
Lambrechts 2000).
Las cepas no-Saccharomyces producen y liberan numerosas enzimas como la pectinasa
(que aumenta la extraccin del zumo, mejora la clarificacin y facilita la filtracin del vino), -
glicosidasa (que hidroliza los precursores no voltiles glicosdicos de la uva), la proteasa
(que mejora la clarificacin), la esterasa (que contribuyen a la formacin del aroma) y la
lipasa ( que degrada los lpidos de la uva o los que derivan de las reacciones de autolisis de
las levaduras), que al interaccionar con los compuestos precursores presentes en la uva
ayudan a extraer los aromas varietales y a mejorar la vinificacin (Esteve-Zarzoso et al.
1998; Fernandez et al. 2000; Fleet y Heard 1993; Otero et al. 2003). S. cerevisiae no
produce muchas enzimas durante la vinificacin; su contribucin se limita a la produccin de
la -glicosidasa (Restuccia et al. 2002; Rodriguez et al. 2004). Las levaduras no-
Saccharomyces son comercialmente disponibles, por ejemplo las clulas inmovilizadas de
Schizosaccharomyces pombe (ProMalic, comercializadas por PROENOL) para la
desacidificacin del mosto a travs de la metabolizacin del cido mlico (Silva et al. 2003).

La ingeniera gentica aplicada a las cepas de S. cerevisiae


La contnua demanda de modernas practicas enolgicas determinan una necesidad cada
vez mayor de cepas de S. cerevisiae especializadas con una gama amplia de propiedades
ptimas y novedosas. La mejora gentica de cepas industriales a travs de la ingeniera
gentica clsica (por ejemplo, la mutagnesis o la fusin del protoplasto) ha cedido el paso
en los ltimos 20 aos a la tecnologa del DNA recombinante.
La publicacin del genoma completo de S. cerevisiae (Goffeau et al. 1996), junto con la
tecnologa del DNA recombinante, han dado un importante impulso a la gentica molecular,
a la fisiologa y biotecnologa y ha hecho posible la construccin de cepas comerciales
especializadas, principalmente a travs de la expresin de genes heterlogos o a travs de
la medida de los genes alterados (sobreexpresin delecin).
Los objetivos ms importantes de la mejora de las cepas implican la mejora de las
tecnologas y de la calidad de la vinificacin, como por ejemplo una buena evolucin de la
fermentacin, una mayor tolerancia al etanol, una mejor utilizacin de los azcares y
asimilacin del nitrgeno y la mejora de las caractersticas organolpticas (Blondin y Dequin
1998; Dequin 2001; Dequin et al. 2003; Pretorius 2000; Pretorius y Bauer 2002; Pretorius et
al. 2003) (Tabla 2).

En general, el material gentico utilizado para la construccin de microorganismos


implicados en la fermentacin de los alimentos debera provenir de las mismas especies
(autoclonacin) o de especies GRAS (generalmente considerados seguros) con una historia
de uso seguro en los alimentos, mientras que es necesario evitar la utilizacin de las

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secuencias de DNA que derivan de especies taxonmicamente cercanas pero


emparentadas con especies patgenas. En muchos casos se ha usado la expresin de
genes heterlogos, dado que los genes de inters se aislaban por ejemplo a partir de
Lactobacillus casei (LDH), Lactobacillus plantarum (pdc), Bacillus subtilis (padc),
Pediococcus acidilactici (pedA), Schizosaccharomyces pombe (mae1 y mae2), lamo
hbrido (4CL216), vid (vst1), Aspergillus sp. (egl1, abfB, xlnA, rhaA) o Fusarium solani (pelA),
y otros como ATF1, GPD1 o PGU1 que derivan de S. cerevisiae (Tabla 2).
En la mayor parte de nuestros ensayos utilizamos promotores y terminadores fuertes, que
derivaban de enzimas glicolticos que constitutivamente se expresan en condiciones
fermentativas (ADH1, ADH2, PGK) pero tambin del gen de la actina (ACT). Las levaduras
industriales en general no tienen marcadores auxotrficos (LEU2, URA2), por tanto se utiliz
el gen de la resistencia a la cicloheximida CYH2 o los marcadores heterlogos de la
resistencia a la fleomicina o a la geneticina ble (Tn5) o G418 (Tn903). No es aconsejable
construir cepas industriales con vectores transportadores de copias mltiples de las
secuencias de inters transportadores de la resistencia a la ampicilina de Escherichia coli y
marcador de la resistencia a sustancias medicinales porque se considera que existe la
posibilidad, aunque muy remota, del transferimento del DNA a la microflora del intestino.
Para las cepas de levaduras enolgicas esto no debera ser importante, porque las clulas
vienen eliminadas al final de la fermentacin. Los genes de los plsmidos deberan estar
integrados, ya que los elementos insertados tienen que ser estables en el nuevo organismo
construido; Estos mtodos los hemos utilizado en muy pocos casos (Lilly et al. 2000;
Malherbe et al. 2003; Volschenk et al. 2001). La interrupcin gnica simultnea a la
insercin de marcadores auxotrficos da lugar a la obtencin de cepas de autoclonacin
(ILSI 1999), como ocurri con el gen GPD (Michnick et al. 1997), el ILSI 1999 es un criterio
menos problemtico por lo que respecta la evaluacin de la aceptabilidad. La secrecin de
protenas extracelulares, como la pediocina o la glucosa oxidasa normalmente se control
con la seal de la secrecin del factor . del feromone del apareamiento (MFa1s) (Malherbe
et al. 2003; Schoeman et al. 1999).
Las modificaciones introducidas no deberan cambiar las caractersticas fundamentales del
huesped durante el proceso fermentativo. En la mayor parte de las modificaciones
genticas se mostr que, aparte del cambio metablico introducido, no se encontraron
diferencias significativas por lo que respecta las caractersticas enolgicas de los vinos
producidos con cepas comerciales y los obtenidos con cepas modificadas.
Por el contrario, la mayor produccin de glicerol debida a la modulacin de la expresin de
GPD llev a una menor produccin de etanol (1%, v/v) y a la acumulacin de productos
intermedios tales como el piruvato, el acetato, la acetoina y el 2,3-butanodiol como
consecuencia del cambio del flujo del carbono (Michnick et al. 1997). La supresin del ALD6
provoc una menor produccin de cido actico (del 40 al 70% menos) y dirigi el flujo del
carbono hacia el glicerol, el succinato y el butandiol (Remize et al. 2000). Se observ
tambin que la acidificacin del mosto a causa de la mayor expresin del LDH y la
consiguiente produccin de cido L(+)lctico depende tanto del genoma de S. cerevisiae
como de la variedad de uva (Dequin et al. 1999).
Los vinos que contenan un 1.82.0% menos de alcohol fueron obtenidos con cepas que
presentaban una sobreexpresin de la glucosa oxidasa , ya que esta enzima produjo
tambin la L-glucano-/-lactona y el cido glucnico a partir de la glucosa (Malherbe et al.
2003).
Recientemente, una cepa de levadura del sake ha sido aprobada como levadura obtenida
mediante autoclonacin por el gobierno japons y no viene considerada levadura GM
(Akada 2002). Una sustitucin gnica en dos fases fue usada para la construccin de una
cepa desprovista de secuencias bacterianas marcadoras y resistentes a medicinales. Una
mutacin puntiforme (Gly1250Ser) de la sintetasa de los cido grasos de las levaduras
FAS2 aporta resistencia a la cerulenina y est asociada a una mayor produccin de
caproato de etilo en el sake japons. Se uso un nuevo marcador para la contra-seleccin,
constituido por un promotor para la sobreexpresin inducible por el galactosio y por la
secuencia inhibidora del crecimiento (GALpGIN11). Las clulas con el marcador no crecen

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en galactosio a causa del efecto inhibidor sobre el crecimiento mediado por la


sobreexpresin GIN11. Un plsmido que contena el gen mutado FAS2, un marcador
resistente a sustancias medicinales y el marcador para la contra-seleccin fueron integrados
en el locus original FAS2, y la prdida de la secuencia del plsmido permiti el crecimiento
en galactosio, que es posible gracias a la prdida del GALpGIN11. Las cepas contra-
seleccionadas contenan o el alelo original o el mutado, pero no las secuencias plasmdicas,
y la diferencia que se obtuvo entre la cepa mutante y la original era una sola base (Akada et
al. 1999; Aritomi et al. 2004).
Este tipo de contra-seleccin puede ser tambin utilizada para la introduccin de genes
mltiples, por ejemplo para intervenir en las vas metablicas. Otras estrategias, por ejemplo
la mutagnesis sitio dirigida del gen de la sulfito reductasa MET10 fueron usadas para
construir una levadura que produjese una menor cantidad de anhdrido sulfuroso
(Sutherland et al. 2003). El alelo LEU4-1 aporta resistencia a la 5,5,5-trifluor-DL-leucina y las
cepas correspondientes producen una cantidad doble de alcohol isoamlico en
fermentaciones a escala de laboratorio respecto a las cepas originales (Bendoni et al. 1999).
El genoma de S. cerevisiae ha sido el primer genoma eucariota secuenciado y seguramente
ser el primer organismo en el que la complejidad de sus transcriptoma, proteoma y
metaboloma ser descifrada. Considerando que muchos rasgos fisiolgicos son
consecuencia de una complicada regulacin multignica, la comprensin del modo en el que
los genes son expresados a lo largo de la fermentacin ayudar de forma importante al
conocimiento de la gentica de las levaduras comerciales e influir en la mejora de las
levaduras a travs de la ingeniera gentica. El mismo tipo de enfoque es el ms apropiado
a la hora de demostrar que las modificaciones introducidas no estn asociadas a efectos
colaterales negativos, como puede ser la produccin de sustancias txicas.
En el futuro, cepas especficas podran servir como reserva de genes naturales para los
programas de mejora, ya que relacionar los fenotipos observados con un anlisis de
expresin global ofrece sucesivas informaciones que podran ser tiles para la construccin
de cepas de levadura obtenidas mediante autoclonacin. Los genes podran ser separados
de sus sistemas de control de regulacin e inducidos slo en condiciones de fermentacin
particulares. Tales cepas de S. cerevisiae podran, por ejemplo, ser cepas que poseeran la
actividad -glicosidasa (Rodriguez et al. 2004) o la capacidad de reducir la concentracin de
cobre en el medio a travs de una mayor acumulacin intracelular (Brandolini et al. 2002),
cepas desprovistas de la actividad sulfito reductasa (Mendes-Ferreira et al. 2002;
Spiropoulos et al. 2000), o cepas que producen poca cantidad de cido actico (Romano et
al. 2003a).

Reglamentos concernientes los organismos genticamente modificados para uso


alimentario
En mayo de 1997 entr en vigor el reglamento europeo EC258/97 relativo a los nuevos
alimentos y a los nuevos ingredientes (EC 1997) e incluye los alimentos y los ingredientes
que contienen o que estn constituidos por organismos genticamente modificados (OGM) o
producidos por organismos genticamente modificados, siempre que estos no estn
presentes en el alimento. La seguridad de un alimento que deriva de un organismo
genticamente modificado tena que ser comparada con el alimento ms parecido que
tuviese una historia de uso seguro. Esto significa que si un alimento que deriva de un OGM
es fundamentalmente equivalente al original, entonces es tan seguro como el
correspondiente alimento tradicional y debera ser considerado como tal, mientras que
eventuales diferencias deben ser analizadas desde un punto de vista toxicolgico, anlitico y
nutricional.
Un conocimiento detallado tanto de las caractersticas generales como de la gentica de los
organismos, la fuente de los genes transferidos y la funcin de los genes modificados es
fundamental para esta evaluacin. Considerando que el resultado final de una modificacin
gentica est basado en procesos controlados por numerosos genes y la funcin de muchos
genes es todava poco conocida, se estn evaluando mtodos para la identificacin y la

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caracterizacin de efectos no buscados a nivel genmico, protemico y metabolmico para


un uso rutinario (Corpillo et al. 2004; Kuiper y Kleter 2003; Kuiper et al. 2002).
La Novel Food Regulation ha sido enmendada recientemente con tres nuevos
reglamentos concernientes los organismos genticamente modificados: EC1829/2003 (EC
2003a), 1830/2003 (EC 2003b) y 65/2004 (EC 2004), que definen los procedimientos para la
autorizacin, etiquetado y trazabilidad. El reglamento 1829/2003 describe la informacin que
tienen que proporcionar aquellos que desean poner a la venta un producto. El solicitante
tiene que demostrar que (1) el alimento no tiene efectos negativos sobre la salud humana y
de los animales y sobre el ambiente, (2) no engaa al consumidor (3) la diferencia con el
alimento que pretende sustituir no representa una desventaja nutricional para el consumidor.
Tales productos deben ser controlados antes de su puesta en venta, y es necesario adems
elaborar un informe tcnico que ofrezca una informacin detallada sobre los resultados de
las investigaciones realizadas para evaluar el impacto de los OGM sobre la salud humana y
sobre el ambiente. sto est definido en el Anexo III de la Directiva 2001/18/EC (EC 2001)
concerniente el deliberado abandono en el ambiente de organismos genticamente
modificados para ponerlos a la venta o por cualquier otro motivo, que retoma el anterior
Council Directive 90/220/EC (EC 1990). Dado que la introduccin de un producto en el
mercado equivale a su introduccin en el ambiente, es necesario efectuar tambin una
evaluacin del riesgo medioambiental de acuerdo con el Anexo II de la Directiva 2001/18/EC
(EC 2002). A continuacin el producto es sometido al procedimiento de aprobacin por parte
de la European Food Safety Agency (EFSA) de Bruselas, de la Comisin Europea y de los
estados miembros. El etiquetado es obligatorio, incluso si el DNA recombinante o la
protena correspondiente no se encuentran presentes en el producto final. Los alimentos que
contienen OGM tienen que incluir en la etiqueta la mencin modificado genticamente o
producido a partir de - nombre del ingrediente - modificado genticamente .
El etiquetado no es requerido en aquellos alimentos que contienen restos de OGM,
tcnicamente inevitables, en una proporcin menor del umbral del 0.9% de los ingredientes
del alimento (relacin entre ingrediente recombinante y no recombinante). La Novel Food
Regulation se basaba en el principio de evidencia, con un etiquetado obligatorio para los
alimentos que contenan ms del 1% de OGM, sin embargo el reglamento EC1829/2003 se
basa en el principio del uso, haciendo que sea obligatoria la declaracin del uso de OGM en
la produccin del alimento, pero la declaracin no se basa en evidenciar el DNA
recombinante o protenas en el producto final.
De acuerdo con los reglamentos No. 1830/2003 (EC 2003b) y 65/2004 (EC 2004), los OGM
y los productos derivados deben ser trazables a lo largo de todos los estadios, desde la
produccin hasta la puesta en venta, para facilitar un eventual retiro del producto si fuese
necesario.
Los reglamentos americanos no preven el etiquetado obligatorio de los OGM, porque no se
considera que sean significativamente diferentes a los dems alimentos o que den lugar a
mayores problemas de seguridad alimentaria que los alimentos que derivan de cruces
tradicionales (Federal Register of May 29, 1992 57 FR 22984). La FDA utiliza el trmino
alimento bioingenierizado para indicar aquellos productos derivados de la tecnologa GM.
Se solicita la evaluacin y la aprobacin antes de la venta cuando el gen introducido codifica
un producto que no se encuentra presente en otro alimento, como por ejemplo los nuevos
agentes dulcificantes. Las normas de etiquetado de los alimentos en general se aplican
tambin a los alimentos que provienen de la aplicacin de las biotecnologas. Un etiquetado
tiene que mostrar todos los hechos materiales de un alimento, por ejemplo si el alimento
bioingenierizado es significativamente diferente respecto a su correspondiente alimento
natural, si tiene propiedades nutritivas significativamente diferentes o si se encuentra
presente un potencial alrgeno.
Los vinos producidos con las levaduras GM deberan ser considerados
fundamentalmente equivalentes a los vino tradicionales. Compuestos como el glicerol, el
cido mlico y lctico son sustancias naturales y sus concentraciones en el vino seran
simplemente optimizadas desde el punto de vista de las propiedades organolpticas. Por
otra parte, el uso de cepas que expresan las enzimas pectolticas representa una vinificacin

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menos costosa y ms fcil sin que se alteren las caractersticas del producto final, ya que la
adicin de enzimas comerciales en una prctica enolgica normal. De cualquier modo es
necesario analizar cada caso por separado.

La evaluacin de los riesgos medioambientales que derivan del uso de levaduras


genticamente modificadas
El uso futuro de levaduras genticamente modificadas depender de la posibilidad de
evaluar los riesgos potenciales asociados a su introduccin en el ecosistema.
El control de la difusin de las cepas industriales en los viedos cercanos a la bodega donde
tales cepas han sido utilizadas a lo largo de los ltimos 5-10 aos fue utilizado en un modelo
experimental para determinar el destino de las levaduras genticamente modificadas en el
ambiente natural. Estos estudios efectuados durante un perodo de 3 aos en algunos
viedos situados en el norte de Portugal y en el sur de Francia, han evidenciado que la
difusin de las levaduras comerciales est limitada a una distancia y a un perodo reducidos
y est favorecida por la presencia de regueros de agua. En las muestras tomadas
considerando distancias a la bodega superiores a los 100 metros, menos del 2% de la
microflora tena un perfil gentico idntico al de las levaduras comerciales. En las muestras
tomadas cerca de la bodega y en regueros de agua, el porcentaje de levaduras comerciales
era del 10-43%. La mayor parte (94%) de las levaduras comerciales fueron encontradas a
una distancia de la bodega comprendida entre los 10 y los 200 metros.
Las levaduras comerciales, a pesar de su uso anual intensivo, no son capaces de crecer
bien en los viedos y no son predominantes entre la flora indgena, caracterizndose su
presencia en los viedos por unas fluctuaciones naturales de aparicin y desaparicin
peridica (Valero, comunicacin personal).
Se evalu tambin el comportamiento de las levaduras genticamente modificadas dentro
de las poblaciones microbianas en una bodega determinada y en un viedo en invernadero.
A partir de la levadura comercial VIN13 se construyeron diversas cepas genticamente
modificadas que contenan genes heterlogos que codificaban la .-amilasa (LKA1), la endo-
-1,4-glucanasa (end1), la xilanasa (XYN4) o la pectato liasa (peh1) bajo el control de
fuertes promotores y terminadores y utilizando marcador de la resistencia kanMX o SMR-
410. Despus de una caracterizacin inicial de la flora de levaduras autctonas en una
nueva intalacin de viados en invernadero, las plantas de cuatro bloques (cada uno de los
cuales constituido por 20 plantas) fueron rociadas con una solucin de levaduras que
contena 2.510 UFC/ml segn un esquema definido con anterioridad. A pesar de que la
6

concentracin inicial de clulas era muy alta, durante los controles semanales de las
poblaciones de levadura en las uvas, las hojas y los sarmientos se aislaron slo pocas
cepas de S. Cerevisiae. Los resultados (1) no han evidenciado una diferencia significativa
entre la presencia de levaduras modificadas y la presencia de levaduras comerciales
parentales, incluso para aquellas levaduras GM que se crea podan tener una ventaja
selectiva con respecto a las cepas parentales (secretaban glucanasa y pectinasa), lo que
demuestra que aquellas modificaciones no aportaban ninguna ventaja para la adaptacin;
(2) en general la poblacin en las plantas rociadas era muy parecida a las de las vides no
tratadas, concluyendo por tanto que el equilibrio ecolgico de la flora de un viedo en un
sistema confinado no se encuentra influido ni por las levaduras comerciales ni por las
levaduras GM: (3) no se evidenciaron diferencias significativas entre las cepas implicadas en
las fermentaciones de microvinificaciones espontneas (Bauer et al. 2003).
La transferencia horizontal de DNA puede tener lugar entre las especies de levadura,
generando hbridos que poseen los dos bagajes cromosmicos parentales (Marinoni et al.
1999). Se observ la transformacin natural de la levadura de la panificacin con el DNA
plasmdico en condiciones de deterioro no artificiales, cuando las clulas que no estn en
fase de crecimiento metabolizan los azcares en ausencia de otros nutrientes. Se propuso
que se trataba de un mecanismo evolutivo que contribuye a la diversidad gentica, siendo
un escenario plausible en los ambientes naturales (Nevoigt et al. 2000). En este momento se
estn llevando a cabo estudios para evaluar la probabilidad, en las condiciones de

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vinificacin, de las dos transferencias de genes horizontal y vertical entre cepas comerciales
modificadas (Bauer et al. 2003).
Otro objetivo, igualmente importante para la evaluacin de la seguridad del uso de las
levaduras GM en la produccin de vino, es la evaluacin de la potencial liberacin y de la
estabilidad del DNA recombinante y de la protena correspondiente durante la fermentacin
alcohlica y durante la crianza del vino sobre las levaduras. La autolisis de las clulas de
levadura se caracteriza por la prdida de permeabilidad de la membrana, por la hidrlisis de
macromalculas celulares como el DNA y las protenas, y la sucesiva difusin de estos
compuestos en le ambiente. Los experimentos de autolisis fueron llevados a cabo en medios
de cultivo de laboratorio y mostraron que la incubacin a 40C durante 10-14 das a un pH
entre 4.07.0 conduca a una degradacin del 55% del DNA total, asociada a una prdida de
desoxirribonucletidos y de pocos polinucletidos en el ambiente extracelular (Zhao y Fleet
2003).

Mtodos para la determinacin del DNA genticamente modificado o de las protenas


Todava no se dispone de datos sobre la presencia o concentracin de las clulas
recombinantes en los vinos producidos de forma experimental con levaduras GM. Se estima
que el nmero de clulas recombinantes por botella ser bastante bajo (de 1 a 10 clulas),
ya que vienen eliminadas con la filtracin o inactivadas con tratamientos trmicos. Esto
implica la necesidad de utilizar tcnicas muy sensibles para identificar el DNA recombinante
durante la vinificacin o en el producto final. En funcin de los recientes Reglamentos
Europeos No. 1829/2003 y 1830/2003, son necesarios mtodos analticos fiables y precisos
para aquellos alimentos que contienen OGM o producidos por OGM. A lo largo de los
ltimos aos los mtodos basados en el DNA o en las protenas han sido desarrollados y
aplicados sobre todo para la determinacin de la soja transgnica y del maiz transgnico y
de sus derivados.
Para el anlisis de las protenas se han desarrollado anticuerpos monoclonales y
policlonales especficos para la determinacin inmunoqumica, el anlisis Western blot y la
tcnica ELISA. Los anlisis inmunocromatogrficos, Reveal CP4 y Reveal Cry9C determinan
la 5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS), que deriva de la cepa Agrobacterium
sp. CP4 que aporta a la soja y al maiz resistencia al herbicida glifosato, la protena Cry
Bacillus thuringiensis que protege las plantas, las semillas y los granillos de maiz de los
insectos. Los dos kit, comercializados por Neogen (http://www.neogen.com), determinan la
presencia de OGM en 520 minutos con un precio bajo y con una sensibilidad elevada
(<0.125% de la fraccin de OGM); los dos son test afidables para el control de la distribucin
de los productos derivados de las biotecnologas (Ahmed 2002; Auer 2003; Brett et al. 1999;
Rogan et al. 1999; Stave 1999; van Duijn et al. 1999, 2002).
Los mtodos basados en la PCR pueden ser aplicados para la determinacin de los OGM
gracias a la amplificacin de elementos genticos presentes en los OGM ms comunes en
Europa. Los lmites de deteccin estn comprendidos entre 20 pg y 10 ng de DNA, que
corresponden a 0.00011% de la masa de OGM (Ahmed 2002; Auer 2003; ILSI 1998, 2001;
Meyer 1999; van Duijn et al. 1999, 2002). La PCR cuantitativa-competitiva (QC-PCR)
depende de la amplificacin paralela del transgen y del gen endgeno correspondiente que
controla tanto la ausencia de inhibicin como la amplificabilidad del DNA objetivo en la
muestra. La cuantificacin es posible si se comparan las concentraciones del producto PCR
derivadas de las amplificaciones con proporciones variables del DNA objetivo/DNA
estndard.
Este criterio fue probado con xito en unos estudios realizados por 12 laboratorios europeos
y permiti la determinacin del 0.1% de DNA de OGM (Hbner et al. 1999; Lthy 1999). Con
un mtodo hbrido que prev el uso de la PCR cuantitativa asociada a la tecnologa del DNA
array technology (MQDA-PCR) se pudieron analizar numerosos alimentos con niveles de
GM del 0.1% (Rudi et al. 2003). Las tecnologas PCR en tiempo real son muy sensibles y
adecuadas para la cuantificacin precisa del DNA a concentraciones mnimas, midiendo las
produccin de los amplicones durante la fase log-linea de la amplificacin del PCR (Ronning
et al. 2003; Vaitilingom et al. 1999). La cuantificacin de los productos PCR a travs de la

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tcnica de inmunoanlisis enzimtico (PCR-ELISA) ha sido recientemente descrito como


una alternativa a la PCR en tiempo real muy sensible y poco costosa (Liu et al. 2004; Petit et
al. 2003).
As como los alimentos no elaborados son fciles de identificar como OGM, cuando el
alimento viene elaborado la identificacn resulta ms difcil: el DNA puede ser degradado y
pueden encontrarse presentes sustancias que interfieren incluso con las reacciones de la
PCR. Se hizo necesario realizar una evaluacin de las proceduras entre laboratorios
diferentes y sto dio lugar al desarrollo de los estndares internacionales ( DIN, ISO, EN)
relativos al muestreo
(DIN 2003), a la extraccin del DNA (DIN 2002b), a la determinacin del DNA de OGM (DIN
2002a) y de las protenas de OGM (DIN 2002c).
La evolucin tecnolgica en el diseo de los OGM, las modificaciones de los reglamento de
los diversos pases y la eleccin de unas directrices para la evaluacin del riesgo seguirn
guiando el desarrollo de tcnicas analticas aplicables a los OGM. Nuevos mtodos para la
caracterizacin basados en la transcriptmica, protemica y metabolmica han sido
indicados como los mtodos ms adecuados para el estudio de los efectos secundarios
(Kuiper y Kleter 2003), y el anlisis del proteoma demostr un equivalencia sustancial entre
un tomate genticamente modificado virus-resistente y los hbridos no modificados (Corpillo
et al. 2004).

La actitud del consumidor


En 1988, la Gist-Brocade obtuvo una cepas en la que los genes codificaban la permeasa del
maltosio y las maltasas eran sustituidas con una coleccin de genes derivados de otra cepa
mucho ms eficaz. Visto que no se encontraba presente ningn DNA no-Saccharomyces,
las autoridades inglesas dieron la autorizacin en 1989. Algunos aos despus, una cepa
recombinante de la cerveza, obtenida en 1993 por la Brewing Research International,
tambin fue aprobada. Esta cepa de S. cerevisiae contena un gen de la amilasa que
derivaba de Saccharomyces diastaticus junto con un gen para la resistencia al cobre. Al no
querer la industria enfrentarse a una posible reaccin negativa por parte de los
consumidores, no se ha producido industrialmente ninguna cepa enolgica (Moseley 1999).
Por las mismas razones, en los ltimos aos no se ha usado ninguna cepa enolgica
genticamente modificada, a pesar de que se han desarrollado numerosas cepas, como se
muestra en la tabla 2, como respuesta a la creciente demanda de innovacin y diversidad
por parte de la industria de la bebidas fermentadas.
La encuesta Eurobarometer, iniciada en los primeros aos 90, es uno de los anlisis de
opinin pblica europeo ms importantes (en trminos de nmero de personas
encuestadas) que monitoriza los cambios en las actitudes de los consumidores hacia las
biotecnologas en diversos pases europeos. La ltima encuesta realizada en 2001
(Anonymous 2001) entrevistando 16.000 europeos ha evidenciado una actitud positiva ante
la ciencia y la tecnologa, mientras que el progreso cientfico no viene considerado como la
panacea universal de todos los problemas. Practicamente todos los encuestados (95%)
indicaron que la propia actitud negativa hacia el consumo de alimentos genticamente
modificados se deba a la imposibilidad de elegir productos alternativos y segn el 60% de
los encuestados los OGM son potencialmente dainos para el medio ambiente. Teniendo en
cuenta que muchos conceptos cientficos no son conocidos por el pblico, la consideracin
que el consumidor tiene del riesgo es muy diferente de la de los expertos que al plantear el
debate sobre las tecnologas de forma compleja, hacen crecer la desconfianza hacia las
biotecnologas y hacia los OGM. Los temores de aquellos que tienen una actitud crtica
tienen que ver con los cambios de las cualidades nutritivas de los alimentos, la potencial
toxicidad, la resistencia a los antibiticos, la potencial alergenicidad y cancerogenicidad del
consumo de OGM, la contaminacin medioambiental, la transferencia involuntaria de genes,
la posible creacin de nuevos virus y toxinas, preocupaciones religiosas, culturales y ticas,
pero tambin el miedo a lo desconocido (Uzogara 2000).
Como se puede observar en Fig. 1, las preocupaciones de los consumidores por las
modificaciones genticas dependan de muchos factores. Por lo que respecta los OGM, los

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beneficios fueron percibidos como marginales o abstractos, como ocurri con la cerveza, los
tomates, las fresas y el salmn. Cualquier modificacin relacionada con los animales o el
hombre provocaba grandes preocupaciones ticas, mientras que las aplicaciones mdicas
en campo farmacutico o en el campo de las enfermedades hereditarias fueron
consideradas las ms importantes y necesarias (Frewer 2003; Frewer et al. 1997).

Beer

Cheese
Strawberries

Tomatoes
Low fat meat
Salmon

Risk Unethical - Unnatural (71%)


Herbicide resistant crops

Pest resistant crops Human growth Animal transplants


hormone
High yield crops

Advantage
Benefit
Pharmaceuticals Need
Hereditary illness

(27%)
Fig. 1 Percepcin en la opinin pblica de la relacin riesgo/beneficio en los alimentos
genticamente modificados (extraido de Frewer 2003)

En conclusin, la reciente disponibilidad de reglamentos que definen los requisitos para la


construccin y la evaluacin de la seguridad de los organismos genticamente modificados,
pero tambin el etiquetado de los productos que derivan de OGM representa un paso crucial
para una eleccin consciente e informada por parte del consumidor, y el futuro inmediato
indicar la validez o no de esta estrategia para cambiar la actitud negativa del consumidor
con respecto a los OGM. La construccin de organismos genticamente modificados
debera ser realizada con estrategias basadas en la autoclonacin. En este contexto, cepas
especficas en ambientes de vinificacin, con caractersticas enolgicas positivas, podran
actuar como reserva de genes naturales para la construccin de cepas, dando una nueva
dimensin a la investigacin sobre diversidad de cepas.

Agradecimientos
Este estudio ha sido financiado por los proyectos ENOSAFE (No. 762, Programa
AGRO, medida 8) Instituto Nacional de Investigao Agrria y LeVini
(POCTI/AGR/56102/2004) Fundao para a Cincia e Tecnologia, Portugal.

Bibliografa disponible bajo solicitud

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Improvement Metabolism / protein(s) Gene(s) Source Construction Reference

P T Pla M Chr

Sensory quality Aroma-liberating Endoglucanase egl1 Trichoderma ACT - 2 CYH2 - (Prez-Gonzlez et al.
(Background enzymes longibrachiatum 1993)
flavor complexity Arabinofuranosidase abfB Aspergillus niger ACT - 2 CYH2 - (Sanchez-Torres et al.
and intensity) 1996)
Endoxylanase xlnA Aspergillus nidulans ACT - 2 CYH2 - (Ganga et al. 1999)

Rhamnosidase rhaA Aspergillus aculeatus GPD PGK TRP - (Manzanares et al.


2003)
Acidity Malate permease mae1 Schizosaccharomyces PGK1 PGK1 2 SMR1- + (Volschenk et al.
adjustment pombe 140 2001)
Malic enzyme mae2

Malolactic enzyme mleS Lactococcus lactis PGK1 PGK1 2 URA3 (Volschenk et al.
1997)
Acetaldehyde ALD6 (deletion) Saccharomyces cerevisiae kanMX (Remize et al. 2000)
dehydrogenase 4

Lactate LDH Lactobacillus casei ADH1 ADH1 2 G418 - (Dequin et al. 1999)
dehydrogenase (Tn903)
Glycerol Glycerol-3- GPD1 Saccharomyces cerevisiae ADH1 ADH1 2 ble - (Michnick et al. 1997,
production phosphate (Tn5)
Remize et al. 1999)
dehydrogenase
Volatile phenol Phenolic acid Ppdc padc Lactobacillus plantarum PGK1 PGK1 2 URA3 (Smit et al. 2003)
formation decarboxylase Bacillus subtilis
Acetate ester Alcohol ATF1 Saccharomyces cerevisiae PGK1 PGK1 2 LEU2 + (Lilly et al. 2000)
production acetyltransferase
Hydrogen Sulphite reductase MET10 Saccharomyces cerevisiae (Sutherland et al.
sulphide 2003)
production
Safety and health Resveratrol -glucosidase bglN Candida molischiana ACT ACT 2 CYH2 - (Gonzalez-Candelas
aspects production et al. 2000)
Resveratrol 4CL216 Hybrid poplar ADH2 ADH2 2 URA3 - (Becker et al. 2003)
synthase

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Coenzyme-A ligase vst1 Grapevine ENO2 ENO2 2 LEU2 -

Ethyl carbamate Blocking urea CAR1 (deletion) Saccharomyces cerevisiae (Pretorius et al. 2003)
elimination secretion
Spoilage Production of Pediocin pedA Pediococcus acidilactici ADH1 ADH1 2 URA3 - (Schoeman et al.
microorganism antimicrobial 1999)
control enzymes Chitinase CTS1-2 Saccharomyces cerevisiae PGK1 PGK1 2 - (Carstens et al. 2003)

Leucocin lcaB Leuconostoc carnosum ADH1 ADH1 2 URA3 - (du Toit and Pretorius
2000)
Glucose oxidase gox Aspergillus niger PGH1 PGK1 URA3 + (Malherbe et al.
2003)
Fermentation Stress tolerance Trehalose TPS1,TPS2, SSaccharomyces cerevisiae (Pretorius et al.
performance ATH1 2003)
(Achieving a Glycogen GSY1, GSY2
complete
conversion of Sterols SUT1, SUT2
sugar to alcohol
and CO2 without Sugar uptake and Hexose transporters HXT1-18 SSaccharomyces cerevisiae (Pretorius et al.
the development assimilation 2003)
of off-flavors) Hexose kinases HXK1, HXK2

Nitrogen Proline oxidase PUT1 SSaccharomyces cerevisiae (Pretorius et al.


assimilation 2003)
Pyrroline-5- PUT2
carboxylate
dehydrogenase
PUT1 and PUT2 ure2 SSaccharomyces cerevisiae (Salmon and Barre
repressor 1998)
Ethanol tolerance Sterol accumulation SUT1, SUT2, SSaccharomyces cerevisiae (Pretorius et al.
2003)
Membrane ATPase PMA1, PMA2
activity
Agrochemicals Copper chelatin CUP1 SSaccharomyces cerevisiae (Pretorius et al.
resistance 2003)

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Processing Removal of filter- Endopolygalacturo PGU1 SSaccharomyces cerevisiae PGK1 PGK1 LEU2 - (Vilanova et al. 2000)
efficiency clogging nase
Fining and polysaccharides
clarification Pectate Lyase pelA FFusarium solani ACT - CYH 2 - (Gonzalez-Candelas
et al. 1995)
Flocculation Flocculin FLO1, FLO11 SSaccharomyces cerevisiae HSP30 (Pretorius et al.
timing 2003)

Tabla 2 Objetivos en las mejoras de cepas de S. cerevisiae (extraido de Pretorius 2000 y Pretorius et al. 2003), dando en algunos casos ejemplos
de las estrategias utilizadas para las modificaciones genticas

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