DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA HUMANA

MATERIA QUMICA BIOLGICA - CICLO LECTIVO 2016

TRABAJO PRCTICO

Trabajo Prctico de Laboratorio N 2

GLUCEMIA - ORINA - ELISA CHAGATEST

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GLUCEMIA - ORINA - ELISA CHAGATEST

Las semanas del 26/9 al 30/9 y 3/10 al 7/10 se realizar el Trabajo Prctico N2.

Los alumnos debern asistir nicamente en la semana que les corresponda al

AULA de BIOQUIMICA del 4 PISO ASCENSORES DERECHA donde se realizar
primero una breve explicacin de lo que se har durante el prctico.
Se realizarn: Medicin de Glucemia, ELISA y anlisis de orina por tiritas reactivas. Las
determinaciones corresponden a dos pacientes X y Z y se agregan dos casos clnicos
para discutir con los resultados obtenidos.
Habr protocolos resumidos en las mesadas para que los alumnos puedan seguirlos
pero NO deben llevrselas.

DETERMINACIN DE GLUCEMIA

FUNDAMENTO DEL MTODO:

Glu-oxidasa
Glucosa + O2 + H2O cido glucnico + H2O2

peroxidasa
H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato quinonimina roja

PROTOCOLO

TUBO H2O T MUESTRA REACTIVO

(ml) (ml) (ml) (ml)
B 1 - - 1
T1 0,75 0,25 - 1
T2 0,50 0,50 - 1
T3 0,25 0,75 - 1
T4 - 1 - 1
Muestra (X o Z) - 1 1

A) Mezclar el contenido de los tubos sin formar espuma

B) Incubar 15 min a temperatura a 37C
C) Ajustar con el BLANCO el cero del fotocolormetro a 500nm
D) Leer las A500nm de los tubos de la CURVA DE CALIBRACION o de los tubos de
las MUESTRAS INCGNITAS (X o Z).
E) Realizar la curva de calibracin (grfico A vs [glucosa])
F) Interpolar el valor obtenido de la A500nm de las muestras incgnita en dicho
grfico y determinar el valor de glucemia de las muestras. Analizar el resultado del
valor de la muestra, utilizando la curva.

La concentracin del testigo es de 250 mg%. Los alumnos debern calcular la

concentracin de glucosa de cada uno de los puntos que corresponden a:
1
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Tubo blanco
Testigo 1: 60 mg%
Testigo 2: 125 mg%
Testigo 3: 190 mg%
Testigo 4: 250 mg%

Valores obtenidos por los docentes:

0.4

Absorbancia 0.3

0.2

0.1

0.0
0 100 200 300
Concentracin glucosa mg%

Valores obtenidos por cada grupo de alumnos.

Graficar la curva de Absorbancia en funcin de la Concentracin de Glucosa, en hoja
milimetrada, y luego obtener el valor de Glucemia del paciente X o el paciente Z. Informar
este valor a los docentes.

TUBOS Absorbancia
500 nm
Blanco

Testigo 1 (60 mg%)

Testigo 2 (125 mg%)

Testigo 3 (190 mg %)

Testigo 4 (250 mg%)

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ELISA (Chagatest de Wiener lab)
Fundamento:
1- La muestra se coloca en el soporte (cubeta o pocillo) en el que se encuentra
inmovilizado el antgeno (antgenos citoplasmticos y de membrana de Trypanosoma
cruzi). Si la muestra contiene el anticuerpo especfico se formar un complejo antgeno-
anticuerpo que quedar unido a la cubeta. Luego de la incubacin la fraccin no unida se
elimina por lavado.
2- Se agrega el segundo anticuerpo (conjugado), que es un anticuerpo anti-
inmunoglobulina humana conjugado con la enzima peroxidasa. Si la muestra contena
anticuerpos especficos que formaron complejo con el antgeno y quedaron adheridos a la
cubeta, entonces el anticuerpo conjugado se unir a los anticuerpos especficos. Luego
de la incubacin, el exceso de conjugado se elimina por lavado.
3- Se agrega el sustrato enzimtico. Si se uni el conjugado, entonces la
peroxidasa producir la reaccin enzimtica dando un color celeste. El sustrato es el
Revelador. La reaccin se detiene con el stopper (cido sulfrico) con lo que el color
celeste vira a amarillo.

Protocolo:
1. Por grupo se utilizan dos pocillos para procesar:
una Muestra X (paciente X)
una Muestra Z (paciente Z)

Rotular los pocillos con Nmero de GRUPO y Nmero de Muestra. Mantener cubiertos
con cinta los pocillos sin usar y solo descubrir los que se vayan a usar en esa
determinacin. Si el pocillo est rotulado, significa que ya ha sido usado.

2. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA X en uno de los pocillos

previamente rotulado como (1).

3. Con el frasco gotero agregar 1 gota de MUESTRA Z en uno de los pocillos

previamente rotulado como (2).

4. Cubrir con cinta los pocillos para evitar la evaporacin e incubar durante 30
minutos a 37C en bao termosttico. Fijarse que los pocillos estn en contacto con el
agua, pero que no se hundan por completo. Se pueden colocar sobre una placa de Petri
plstica que flota en el lquido del bao.

5. Descartar el lquido de los pocillos en el recipiente de descarte. Lavar con BUFFER

DE LAVADO. Para ello, colocar un poco de este buffer en cada pocillo y despus
descartar con firmeza el lquido en el recipiente. Repetir este lavado 4 veces ms (5
lavados en total). Despus del ltimo lavado, eliminar por completo el lquido residual
invirtiendo los pocillos y golpendolos varias veces sobre papel absorbente.

6. Luego, agregar 1 gota de CONJUGADO en cada pocillo.

7. Mezclar con golpes laterales suaves. Cubrir los pocillos e incubar 30 minutos a
37C en bao termosttico.

8. Descartar el lquido de los pocillos y lavar 5 veces con BUFFER DE LAVADO,

como se realiz anteriormente.

3
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9. Agregar en cada pocillo 1 gota de REVELADOR . Mezclar con golpes laterales

suaves. Puede llevarse a 37C y esperar hasta el desarrollo de color celeste en la
Muestra X (de 15 a 30 min).

10. Detener la reaccin con 1 gota de STOPPER. El color celeste vira a amarillo.
Evaluar a simple vista los resultados. El color es estable durante 30 minutos.

TIRILLAS REACTIVAS DE ORINA

Se colocar una gradilla con dos tubos, uno de orina del paciente X y otro de orina del
paciente Z en las puntas de cada mesada . Cada grupo de alumnos usar la orina
correspondiente a la muestra del paciente que le toc de la glucemia.

Protocolo:

1- Familiarizarse con la forma y la direccin de cmo debe sumergirse la tirilla reactiva

dentro de la orina (NO DEBEN APOYARSE LOS DEDOS SOBRE LAS
ALMOHADILLAS !!).
2- Sumergir la tirilla dentro del tubo con la orina, retirndola a los pocos segundos.
3- Esperar un minuto, apoyando la tirilla sobre un papel absorbente sobre la mesada.
4- Comparar los colores de la tirilla reactiva con los resultados de la fotocopia del kit
comercial.
5- Anotar los resultados en el cuaderno y en el informe.

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CASOS CLNICOS DE LOS PACIENTES ANALIZADOS EN EL TRABAJO PRCTICO

PACIENTE X
El seor O.G. de 35 aos nacido en la provincia de Chaco concurre al servicio de Clnica Mdica a fin de
realizarse un examen de rutina y serologa para Chagas por un estudio catastral que estn realizando en la
fbrica donde trabaja.
Antecedentes personales: fumador de 30 cigarrillos diarios desde hace 15 aos. Peso: 95 kg, talla: 1, 67 m.
Sin antecedentes familiares de importancia.
Al interrogatorio refiere conocer la vinchuca y provenir de un rea rural del norte de la
provincia.
En la consulta se le detecta TA: 160/95.

Examen de laboratorio
Sangre Valores de Referencia
Glucemia: ______ 70-110 mg%
Proteinemia total: 7 g% 6-8 g%
Colesterol total: 260 mg% <200 mg%
Col HDL: 30 >40 mg%
Col LDL: 200 <100 mg%
TAG: 180 mg % <150 mg%
Bilirrubina total : 1 mg% 0.8-1 mg%
Bilirrubina Directa 0.15 mg % <0.2 mg%
GOAT: normal
GPT: normal
Creatininemia: 1mg % 0.6-1.4 mg%
Uremia: 25 mg% 15-45 mg%
Uricemia: 6.5 mg % <8 mg%

Chagatest por ELISA: _____

Orina:

CUESTIONARIO:
- En base a los valores indicados ms arriba y los obtenidos en el trabajo prctico,
indique posibles alteraciones metablicas presentes en este paciente.
1.- Qu caractersticas considera presentar la orina de este paciente a nivel de:
a) examen fsico, b) qumico y c) microscpico.
2.- Si el anlisis de Chagatest por ELISA diera positivo, que otra tcnica que conoce
podra ser utilizada para confirmar el diagnstico?

PACIENTE Z
Un paciente de 18 aos de edad acude al servicio de urgencias con alteracin del estado
de conciencia. Sus padres refieren que el paciente fue diagnosticado de diabetes hace 3
aos y est siendo tratado con insulina, manteniendo un aceptable control glucmico.
Cinco das antes del ingreso haba comenzado con diarrea y malestar general, pese a lo
cual fue a pasar unos das a la costa con amigos. Durante los ltimos dos das, adems
de la diarrea, present vmitos y en el ltimo da haba dejado de ponerse la dosis de
insulina de la noche.

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Examen Fsico
Impresin de enfermedad aguda grave. Presenta signos de deshidratacin con mucosas
secas y signo del pliegue. Aliento cetnico. Responde a estmulos dolorosos.
Temperatura: 38C; TA: 100/60; pulso: 94/min. Pupilas normales y normorreactivas.
Auscultacin cardiopulmonar normal. Abdomen distendido, doloroso a la palpacin, sin
visceromegalias, ruidos intestinales aumentados. Peso aproximado: 60 kg

Datos Complementarios

Sangre: Valores de Referencia

Glucemia: -------- 70-110 mg %
Proteinemia total: 9,5 g% 6-8 g %
Na: 132 mEq/l 135-155 mEq/l
K: 3.0 mEq/l 3,5- 5,5 mEq/l
Cl: 95 mEq/l 98-107 mEq/l
pH: 7.10 7,38-7,42
pCO2: 30 mmHg 32-48 mmHg
% Sat O2: 95 95-98%
CO3H: 10 mEq/l 2028 mM
leucocitos: 12500/mm3 5000-10000/mm3

Chagatest por ELISA:

Orina:

CUESTIONARIO:
1- Qu enfermedad tiene este paciente?
2- Analice las alteraciones metablicas presentes en sangre y orina.
3- Qu tratamiento en lneas generales le dara a este paciente?

LOS ALUMNOS DEBEN ENTREGAR UN INFORME CON LOS RESULTADOS del

ELISA, ORINA y de la GLUCEMIA TANTO DE LA MUESTRA X COMO DE LA
MUESTRA Z y la discusin de los casos clnicos