Técnicas de Identificación (Tinciones)

CAPTULO
Tcnicas de identificacin
J. L. Lpez-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert
1. INTRODUCCIN
El propsito fundamental del diagnstico microbiolgico clnico es optimizar

la asistencia que se presta al paciente. Para alcanzar este objetivo es esen- 3
cial obtener y comunicar, lo antes posible, al mdico responsable del mismo
resultados tiles para su manejo y tratamiento, usando eficientemente los
recursos disponibles. Conjugar estos objetivos, con el mximo rigor cientfico
y una creciente demanda asistencial, es lo que se persigue en los Servicios de
Microbiologa Clnica.
El diagnstico etiolgico directo de las enfermedades infecciosas pretende
demostrar la presencia del microorganismo causal en productos patolgicos ade-
cuados obtenidos del paciente e incluye, entre otros procedimientos, el cultivo,
el cual persigue el aislamiento del microorganismo causante de la infeccin.
Cuando es factible, el cultivo se considera el mtodo diagnstico de eleccin,
porque permite la identificacin del microorganismo implicado, el estudio de su
sensibilidad a los antimicrobianos apropiados y facilita la aplicacin de marcadores
epidemiolgicos.
Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identi-
ficacin, es decir, a clasificarlo dentro de un grupo o taxn ya establecido, con
el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del
nivel de precisin o discriminacin que se pretende conseguir.
Aunque en los ltimos aos se ha asistido a un crecimiento importante en
la oferta de mtodos genotpicos aplicados al diagnstico microbiolgico, en
la mayor parte de los procesos de identificacin se siguen utilizando mtodos
fenotpicos, puesto que su realizacin, lectura y coste los hacen ms asequibles.
En este captulo se revisan las tcnicas de identificacin de las bacterias
patgenas. Los mtodos clsicos para la tipificacin de las bacterias se basan
en sus caractersticas morfolgicas y metablicas. Las pruebas diagnsticas se
seleccionan en una base emprica, con el fin de proporcionar informacin sufi-
03#Tecnicas(Lopez).indd 27 10/10/07 13:27:14

28 Microbiologa aplicada al paciente crtico Tcnica
ciente para hacer posible la discriminacin entre los gneros y especies. Adems,
hoy en da, las tcnicas de biologa molecular (basadas en la caracterizacin de
genes especficos o segmentos de ellos) son cada vez ms comunes y utilizadas
en Microbiologa Clnica.
2. OBJETIVOS Y UTILIDAD DE LAS TCNICAS DE IDENTIFICACIN

La identificacin de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infec-
cin es uno de los instrumentos principales del diagnstico y tratamiento de
las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo patgeno per se,
potencialmente patgeno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos
de resistencia, facilita el tratamiento de la enfermedad infecciosa con la mayor
eficiencia posible. Tambin permite realizar un seguimiento y control de las infec-
ciones hospitalarias, detectar un posible brote infeccioso y establecer una poltica
de antibiticos coherente y apropiada en concordancia con el centro hospitalario
o el rea asistencial, lo que traer consigo una disminucin de las infecciones
nosocomiales y/o comunitarias, y una menor generacin de resistencias en los
microorganismos.
Para poder ser clnicamente til, la identificacin de un microorganismo debe
ser lo ms rpida posible. La economa y la prctica dictan el uso de un nmero
mnimo de pruebas diagnsticas. Por necesidad, la identificacin en Microbiologa
Clnica representar siempre un compromiso entre la exactitud y precisin, por
una parte, y la rapidez y la economa por otra. Cmo se logra este compromiso
es lo que determina la calidad diagnstica en Microbiologa.
3. IDENTIFICACIN BACTERIANA
La taxonoma bacteriana tiene como objetivo la construccin de sistemas
que permitan clasificar a las bacterias. Dentro de la clasificacin taxonmica,
las categoras y definiciones ms utilizadas son familia (un grupo de gneros
relacionados entre s), gnero (un grupo de especies relacionadas entre s),
especie (un grupo de cepas relacionadas entre s), tipo (grupos de cepas in-
terrelacionados dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa
(aislamiento concreto de una especie en particular).
Uno de los factores clave para identificar a las bacterias como agentes
patgenos depende de su aislamiento en cultivo puro. Una colonia en cultivo
puro est compuesta por un solo tipo de microorganismo y procede de una
sola clula original. Las pruebas de identificacin se deben hacer siempre con
colonias nicas procedentes de cultivos puros.

e crtico Tcnicas de identificacin 29
La taxonoma bacteriana convencional permite la identificacin de gneros y

especies mediante la aplicacin de diversos criterios, como los que se resumen
a modo de ejemplo en la tabla 1.
3.1. Mtodos rpidos de identificacin bacteriana

El trmino de mtodo rpido en microbiologa engloba una amplia varie-
dad de procedimientos y tcnicas que permiten obtener resultados en menos
tiempo que las pruebas diagnsticas convencionales. Existen mtodos rpidos
aplicables a la microscopa, tcnicas de identificacin bioqumicas, pruebas de
deteccin de antgenos y de anticuerpos. Incluso en las tcnicas de diagnstico
molecular existe una gradacin de celeridad, siendo algunas de estas pruebas
tan rpidas como la PCR a tiempo real.
Los procedimientos microscpicos que utilizan tinciones estndar y/o
anticuerpos fluorescentes para detectar microorganismos especficos se consi-
deran mtodos rpidos y se utilizan para la diferenciacin inicial o la identifica-
cin presuntiva de ciertos grupos de microorganismos. La identificacin rpida
de los cultivos clnicos tambin incluye equipos de identificacin comerciales
e instrumentos o sistemas robticos e informticos completamente automa-
tizados.
Los equipos comercializados son habitualmente sistemas de pruebas mi-
niaturizadas que utilizan sustratos cromognicos o fluorognicos para estudiar
las enzimas preformadas. Las reacciones buscadas pueden ser obtenidas en un
Criterios y ejemplos metodolgicos aplicados a la identificacin

Tabla 1.
bacteriana
Criterio Metodologa de ejemplo
Observacin macroscpica Observacin e inspeccin de colonias: disposicin, tamaos,

textura, formas, pigmentos, etctera
Observacin microscpica Tinciones: formas, agrupacin, esporas, cpsula, flagelos, etctera
Metabolismo Bateras bioqumicas: uso de sustratos (oxidacin/fermentacin),
produccin de metabolitos secundarios, etctera
Otras propiedades Resistencia a antibiticos: antibiograma y antibiotipos, ribotipos,
fagotipos, estudio de las concentraciones mnimas inhibitorias,
estudio de sinergias o antagonismos, etctera

tiempo de 2 a 6 horas de incubacin, aunque algunas de ellas pudieran requerir

una incubacin ampliada hasta el da siguiente. Las capacidades y prestaciones
de estos equipos y sistemas son muy variables y suelen incorporar sistemas
de lectura mecanizada y automatizada mediante espectrofotmetros, cdigos
numricos y bases de datos computarizadas, realizando de forma secuencial la
incubacin, lectura e interpretacin de los resultados de las pruebas.
3.2. Tinciones rpidas
El examen de las muestras debe iniciarse con la inspeccin visual ordinaria

y proceder al nivel de magnificacin necesario para visualizar el patgeno o de-
terminar la ausencia del mismo. En la mayora de los Servicios de Microbiologa
se realiza un examen macroscpico de la muestra mediante la inspeccin visual
en el momento de realizar la extensin sobre el portaobjetos, la preparacin de
los cultivos y, posteriormente, un examen microscpico mediante las tinciones
elegidas (Tabla 2); por lo tanto, el microscopio es el instrumento ms necesario
para un microbilogo, dado que permite la observacin de microorganismos que
no pueden ser apreciados con detalle a simple vista.
Las muestras pueden prepararse de diferentes formas para hacer a los
microorganismos ms fcilmente visibles y mostrar sus caractersticas estruc-
turales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos elementos, como
motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, deteccin de parsitos o protozoos
o visualizacin de estructuras fngicas; por otra parte, las tinciones microbiol-
gicas permiten observar a los microorganismos en funcin de la capacidad de
los mismos para retener, o no, determinados colorantes (Tabla 3).
Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos mtodos, siendo las ms
usadas las tinciones diferenciales, que permiten distinguir a los microorganis-
mos por alguna de sus caractersticas tintoriales peculiares:
t Tincin de Gram: es de gran importancia en Microbiologa, ya que permite

hacer diferenciaciones taxonmicas, separando dos grandes grupos de bac-
terias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gram-negativas, de color
granate o rojo-rosado), segn se comporten ante esta tincin.
t Tincin cido-alcohol resistente: se basa en que ciertos microorganismos
no pierden la coloracin por una mezcla de cido y alcohol si han sido pre-
viamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos
cido-alcohol resistentes.
t Otras: hematoxilina frrica, tricrmica, May Grunwald-Giemsa, Wright-Giemsa.

Tabla 2. Sistemas de observacin de los microorganismos patgenos

Herramienta Magnificacin (x) Aplicacin
Ojo humano 0 Examen visual ordinario
Lupa o gafa-lupa 5 Examen visual ordinario con precisin
Examen y manipulacin visual precisa y
Microscopio de diseccin 2,5-30
detallada
Microscopio ptico:
De campo claro 100-1.000 Clulas teidas
Clulas no fcilmente teidas para visua-
De campo oscuro 100-400
lizacin en campo claro
Contraste de fases 100-400 Clulas vivas y/o no teidas
Preparaciones usando tinciones con fluo-
rocromos, los cuales pueden teir direc-
Microscopio de fluorescencia 100-1.000
tamente las clulas o pueden acoplarse a
anticuerpos que se fijan a las clulas
Microscopio electrnico:
Determina la ultraestructura de los org-
De transmisin 150 a 100 millones
nulos celulares
Determina las formas y estructuras de la
De barrido 20-10.000
superficie celular
La tincin ms utilizada en microbiologa es, sin lugar a dudas, la tincin

de Gram, que proporciona informacin sobre los siguientes aspectos:
t 5BYPONJDPQFSNJUFMBDMBTJmDBDJOJOJDJBMEFMBTCBDUFSJBTVTBOEPDSJUF-
rios morfolgicos (tamao, forma, agrupacin, carcter tintorial).
t $MOJDP QFSNJUF VO EJBHOTUJDP QSFTVOUJWP EF CBDUFSJVSJB TJHOJmDBUJWB
tambin un diagnstico etiolgico orientativo del lquido cefalorraqudeo
(LCR) de un paciente con sospecha de meningitis, etctera.
t $POUSPMEFDBMJEBEZWBMJEF[EFMBNVFTUSBSFNJUJEBQBSBDVMUJWP DPNP
sucede con los esputos y otras muestras del tracto respiratorio.
t (VB QBSB FM QSPDFTBNJFOUP EF MB NVFTUSB PSJFOUB TPCSF MB FMFDDJO
de los medios de cultivo, temperaturas y atmsferas de incubacin,
requerimientos nutricionales adicionales, etc. ms apropiados segn los
microorganismos observados en la tincin.

32
Tabla 3. Tinciones y mtodos microscpicos para la deteccin rpida de microorganismos en muestras y materiales
infectados
Tincin o mtodo Aplicacin Resultados esperados Comentarios
03#Tecnicas(Lopez).indd 32
-#" QSFQBSBDJPOFTEF5[BODL NVFTUSBT Morfologa general de las estructuras Permite visualizar bacterias, levaduras,
Wright-Giemsa
con fondo celular complejo celulares parsitos e inclusiones virales
(SOVMPT NFUBDSPNUJDPT EF DPSJOFCBD Morfologa general y seleccionada Corynebacterium diphteriae
Azul de metileno
terias
Permite hacer diagnstico presuntivo, Deteccin de leucocitos, reconocimiento Requiere experiencia para valoracin
sobre todo, en neumona y meningitis de la morfologa de bacterias comunes adecuada; no incluye otros agentes in-
Gram
bacteriana fecciosos, pero puede diferenciar leva-
duras
5JODJPOFT EF NVFTUSBT FTQVUPT -#" Los microorganismos AAR muestran un Las micobacterias son bacilos rectos,
LCR, orina, etc.) para identificar bacterias color rojo granate, contrastado sobre cortos o largos y las nocardias, bacilos
Ziehl-Neelsen, Kinyoun cido-alcohol resistentes (AAR) y para un fondo azulado; permite detectar arboriformes y ramificados
diferenciacin de micobacterias y algunos tambin parsitos como Cryptosporidium
actinomicetales aerobios (AAR parcial) y Cyclospora
Microscopa de campo Examen directo de lesiones con sospecha Se ven espiroquetas mviles Requiere experiencia
oscuro de sfilis primaria
Examen directo de la extensin de LCR, Los criptococos poseen una cpsula de 5JODJO JOWFSTB MB DQTVMB OP TF UJF
Tinta china sangre y orina para Cryptococcus polisacridos que aparece como un halo requiere experiencia para diferenciar
sobre un fondo oscuro leucocitos de levaduras
Examen directo de las extensiones de piel, Visualiza elementos fngicos Digiere las protenas de las muestras y
KOH 10%
pelos y uas para ver dermatofitos facilita la visualizacin
Microbiologa aplicada al paciente crtico
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Tcnica
e crtico
Tabla 3. Tinciones y mtodos microscpicos para la deteccin rpida de microorganismos en muestras y materiales
infectados (continuacin)
Tincin o mtodo Aplicacin Resultados esperados Comentarios
03#Tecnicas(Lopez).indd 33
Tcnicas de identificacin
Es eficaz para diferenciar verdaderos mi- 5JODJO EF GMVPSPDSPNP GJKBEB B MPT Requiere el uso de microscopio de fluo-
croorganismos de artefactos, especialmen- ncleos de las bacterias, que muestran rescencia
Naranja de acridina te en hemocultivos fluorescencia naranja sobre un fondo
oscuro; fluorescen tanto bacterias viables
como no viables
Examen directo de LCR, LBA y otros Las levaduras y mohos muestran una 5JODJOGMVPSFTDFOUFRVFTFGJKBBMBQBSFE
lquidos corporales para detectar estruc- fluorescencia blanquecina suave celular de hongos y levaduras, pero no
turas fngicas y algunos quistes parasi- a bacterias o clulas inflamatorias; se
Blanco calcoflor tarios prefiere a la tinta china y a preparaciones
de KOH
Requiere el uso de microscopio de fluo-
rescencia
Es til para bsqueda de AAR en una Extensiones concentradas de sedimentos 5JODJO QSFGFSJEB QBSB NJDSPPSHBOJTNPT
variedad de muestras clnicas, especial- de micobacterias AAR, por su rendimiento en el cribado
Auramina-rodamina mente, las ms contaminadas con flora de gran nmero de muestras
normal Requiere el uso de microscopio de fluo-
rescencia
33
10/10/07 13:27:21
t 1VFEF JOEJDBS MB DPOWFOJFODJB EF BQMJDBS PUSBT UDOJDBT EF EJBHOTUJDP
rpido (deteccin de antgenos o de anticuerpos, tcnicas de biologa
molecular).
t (VB MB DBMJEBE EFM QSPDFTP RVF FYJHF DPODPSEBODJB FOUSF MPT NJDSPPS-
ganismos que se observan en la visin directa y los que se obtienen,
recuperan o aislan por cultivo.
t 1VFEF QSPQPSDJPOBS BZVEB QBSB PSJFOUBS MB BTJTUFODJB UBOUP FO QBVUBT
teraputicas empricas de antimicrobianos, como en la adopcin precoz
de medidas preventivas y de control epidemiolgico.
El aspecto de las bacterias en el microscopio permite plantear las siguientes

cuestiones clave para el diagnstico microbiolgico:
t Qu caractersticas tintoriales presentan las imgenes o elementos vi-
sualizados en las preparaciones?: se trata de bacterias gram-positivas o
gram-negativas?, son bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR), o no, o slo
parcialmente?
t Cul es la morfologa de las clulas bacterianas visualizadas?: bastones o
bacilos, cocos, cocobacilos, difteromorfos o corinebacteriformes, espirales o
helicoidales, pleomrficas (forma variable),
t Cul es su disposicin y estructura individual o integrada?, aparecen las
clulas en forma separada o configurando cadenas, parejas, ttradas, racimos,
agrupamientos ordenados o desordenados, etc.? y
t De qu tamao son las clulas?: grandes, pequeas, de dimensiones bac-
terianas o de aspecto fngico (levaduriforme o filamentoso micelial)?
3.3. Identificacin presuntiva por la morfologa de las colonias

Gracias al cultivo microbiolgico se obtiene informacin adicional que es muy
valiosa para aislar e identificar a los microorganismos. Los medios de cultivo
slidos pueden clasificarse en:
1. Medios no selectivos (agar sangre y agar chocolate): posibilitan el cre-
cimiento de muchas especies diferentes de bacterias, pero no permiten el
aislamiento de una sola especie bacteriana a partir de muestras propensas a
la contaminacin con un gran nmero de microorganismos comensales.
2. Medios selectivos: ayudan en el aislamiento de especies de importan-
cia mdica en presencia de especies comensales, mediante la adicin de
sustancias inhibidoras, sistemas indicadores y tampones que ayudan a la

deteccin diferencial (agar MacConkey, agar CLED, agar XLD, agar VCAT o
VCN). Se utilizan para sembrar diferentes tipos de muestras contaminadas
(intraabdominales, heces, orina o exudados genitourinarios).
Es posible hacer una identificacin preliminar de muchas bacterias impor-
tantes en la clnica, basndose en unas pocas y sencillas caractersticas ma-
croscpicas de las clulas apreciables en su disposicin en forma de colonias
sobre los medios de cultivos en que crecen y se aislan. La interpretacin de los
cultivos primarios, despus de 24-48 h de incubacin, requiere una evaluacin
de las colonias con una sistemtica bien estructurada.
Caractersticas macroscpicas de las colonias:
Despus de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas
de agar, se deben apreciar las principales caractersticas de las colonias: tamao
(en general, las bacterias gram-positivas producen colonias algo ms pequeas
que las gram-negativas), forma, grado de elevacin, borde, color, superficie,
densidad, consistencia y olor.
Reacciones en el medio de agar usadas para la identificacin de bacterias:
1. Tipo de hemlisis en el medio de agar sangre. La hemlisis es una reaccin
observada en el medio circundante o subyacente a la colonia; sirve de ayuda
para la identificacin presuntiva, particularmente, de los estreptococos, y
debe valorarse frontalmente y por transiluminacin.
t a-hemlisis: eliminacin parcial de la sangre en torno a la colonia, ori-
ginando una decoloracin verduzca en el medio (ej.: S. pneumoniae,
estreptococos del grupo viridans).
t b-hemlisis: eliminacin completa de la sangre circundante o subyacente
a las colonias por lisis completa de los hemates (ej.: Streptococcus pyo-
genes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes).
2. Produccin de pigmentos en medio de agar: es una de las caractersticas
inherentes de cada microorganismo especfico y pueden estar confinados
a la propia colonia o colorear el medio: verde, a veces, con brillo metlico
(P. aeruginosa), rojo-rosado (Serratia marcescens), azul (Kluyvera spp.), pr-
pura (Chromobacterium violaceum) o marrn negruzco (Prevotella melanino-
genica).
Cambios en medios diferenciales: en los medios de cultivo diferenciales
se incluyen diversos colorantes, indicadores de pH y otros componentes meta-

blicos, que actan como indicadores de las actividades enzimticas y ayudan a

identificar a las bacterias aisladas, muy tiles en determinados tipos de muestras,
como los coprocultivos y urocultivos.
Crecimiento en medios lquidos: hay claves importantes para la identi-
ficacin de los microorganismos que pueden ser detectadas observando el
crecimiento en los medios lquidos, especialmente, en el caldo de tioglicolato o
en otros como el Brain-Heart-Infusion (BHI).
La capacidad de la morfologa colonial QBSB IBDFS VOB JEFOUJmDBDJO

presuntiva permite:
t 3FBMJ[BSVOEJBHOTUJDPQSFTVOUJWPSQJEPFOVONPNFOUPEFOFDFTJEBE
crtica basado en el juicio razonado del microbilogo.
t *ODSFNFOUBS MB DBMJEBE EF MPT DVJEBEPT EFM QBDJFOUF B USBWT EF MB DP-
municacin rpida de los resultados, aumentando el coste-efectividad
de las pruebas microbiolgicas (diferenciacin de patgenos potenciales
de la flora normal).
t 5FOFSVOQBQFMTJHOJmDBUJWPFOFMDPOUSPMEFDBMJEBE FTQFDJBMNFOUF EF
MPTQSPDFEJNJFOUPTBVUPNBUJ[BEPTZEFPUSPTTJTUFNBTEFJEFOUJmDBDJO
comercial disponibles (evitar interpretaciones errneas, debidas a inculos
NJYUPTRVFBMUFSBSBOMBJEFOUJmDBDJO
WBMPSBOEPMBDPSSFMBDJOEFMPT
SFTVMUBEPTHFOFSBEPTDPOMBJEFOUJmDBDJOFTQFSBEB
3.4. Pruebas bioqumicas rpidas

Existen varias pruebas bioqumicas de realizacin fcil y rpida sobre colonias
aisladas a partir de medios de cultivo que permiten la diferenciacin presuntiva
rpida entre grupos de microorganismos o entre especies bacterianas. Adems,
estas pruebas pueden orientar sobre las tcnicas adicionales necesarias para
hacer una identificacin definitiva. En la tabla 4 se resumen los principios, los
modos de accin y las aplicaciones de algunos de estos procedimientos.
3.5. Bateras y pruebas adicionales

En la prctica, la identificacin bacteriana se puede realizar con mtodos
convencionales o con mtodos semi o totalmente automatizados. Los mtodos
convencionales se suelen llevar a cabo en forma de cascada decisoria, con un
algoritmo de identificacin consensuado o estandarizado (Fig. 1) o usando una
batera de pruebas simultneas que permita la identificacin aproximada o defi-

Principios, modos de accin y aplicaciones de algunas pruebas

Tabla 4.
bioqumicas rpidas
Prueba Enzima bacteriana Aplicaciones
*OEPM 5SJQUPGBOBTB Reaccin positiva (color rojo) identifica a E. coli,

Proteus vulgaris
0/1( b-galactosidasa Determina la fermentacin de lactosa (color
amarillo) en fermentadores lentos de la lactosa.
Diferencia, por ej., Neisseria lactamica de especies
patgenas de Neisseria
Oxidasa Citocromo C oxi- Diferenciacin entre los no-fermentadores
dasa (reaccin +, color azul-morado); tambin ayuda
a la identificacin de Neisseria, Aeromonas, Vibrio
y Campylobacter
Catalasa Catalasa Diferenciacin de estafilococos (reaccin + con
burbujeo) de estreptococos (reaccin -) y de
Listeria de los estreptococos
Solubilidad en bilis *EFOUJGJDBDJO QSFTVOUJWB EF Streptococcus
pneumoniae (colonias lisadas) en cultivos de
esputo, sangre o LCR
PYR (L-pirrolidonil-B- L-pirroglutamil- *EFOUJGJDBDJO EF FTUSFQUPDPDPT EFM HSVQP " EF
naftilamida) amino-peptidasa Lancefield. Diferencia Enterococcus de los es-
treptococos del grupo D (reaccin +, color rojo
brillante)
Ureasa (rpida) Ureasa Prueba de cribado (positiva, color rojo) para
Cryptococcus, Proteus, Klebsiella y Yersinia ente-
rocolitica
Hipurato (rpido) Especiacin de Streptococcus agalactiae, Campy-
lobacter jejuni y Listeria
Plasmocoagulasa Diferencia S. aureus de estafilococos coagulasa
negativos
nitiva. Siempre se parte de una identificacin preliminar (basada en la tincin de

Gram, morfologa colonial, etc.) que permite simplificar la batera a un mnimo
de pruebas necesarias y apropiadas.

Gram y morfologa
Coco gram-positivo No coco gram-positivo
Catalasa
Negativa
Positiva
Coagulasa
Negativa
ECN
Positiva
Staphylococcus aureus
Figura 1. Ejemplo de identificacin por algoritmo en cascada. ECN: estafilococos negativos para
la coagulasa.
Para la identificacin de los bacilos gram-negativos (BGN) aerobios, del

tipo de las enterobacterias, se realiza una batera de pruebas bioqumicas con
la que se identifica a los que se aslan ms frecuentemente en nuestro medio.
Adems, conocer el fenotipo de sensibilidad antibitica de una determinada
especie ayuda de forma determinante a la identificacin final.
En la identificacin de los cocos gram-positivos catalasa positivos es muy
importante diferenciar a Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de
los estafilococos coagulasa negativos (ECN).
Por otra parte, para la identificacin de los cocos gram-positivos catalasa
negativos, la identificacin preliminar es esencial, ya que existe una gran varie-
dad de gneros. Por ello, se aconseja una identificacin en cascada con unas
pocas pruebas convencionales, que permitan identificar el gnero, y en algn
caso, la especie (patrn hemoltico, crecimiento en forma de satlite con una
cepa de S. aureus hemoltica, piracinamidasa, hidrlisis del hipurato, prueba del
CAMP, solubilidad en bilis y optocina). Si interesa la identificacin de la especie,
lo ms habitual es utilizar galeras comerciales (API rapid ID 32 STREP, Vitek2,
MicroScan Walk-Away, Phoenix o Wider).

Para la identificacin de los bacilos gram-positivos de los gneros Coryne-

bacterium y Bacillus, la diferenciacin preliminar debe hacerse por la morfologa
de la colonia, color, hemlisis, caractersticas al microscopio, presencia de espo-
ras, etc. Aunque para una mayor seguridad en la identificacin se puede utilizar
tambin un sistema de galeras para los bacilos corineformes (API Coryne), o
el API 50 CHB para el gnero Bacillus o mediante mtodos automticos, como
el sistema Phoenix.
Para la identificacin de bacterias anaerobias es importante realizar una
identificacin preliminar, que permite, en algunos casos, conocer el gnero, en
funcin de la morfologa, tincin de Gram, disposicin y patrn de hemlisis.
Una identificacin definitiva se puede realizar con galera de pruebas como el
API rapid ID 32 A.
3.6. Mtodos semi o completamente automatizados
En el mercado existen varios mtodos de identificacin semiautomticos y

automticos que superan a los mtodos convencionales por su fcil realizacin
y el menor tiempo que requieren para alcanzar una identificacin definitiva de la
especie. Adems, muchos de estos sistemas permiten realizar las pruebas de
sensibilidad a los antimicrobianos al mismo tiempo. En general, los mtodos auto-
mticos se deberan utilizar para la identificacin sistemtica en el laboratorio de
microbiologa; pero estos mtodos no permiten siempre la identificacin de todas
las bacterias. Por lo tanto, el microbilogo debe comprobar que los resultados de
los mtodos automticos se corresponden con los de otras pruebas y con su sospe-
cha diagnstica; adems, estos sistemas requieren controles de calidad estrictos.
Entre los mtodos de identificacin automticos comercializados se en-
cuentran Vitek2 (bio-Mrieux), MicroScan Walk-Away (Dade), Phoenix
(Becton-Dickinson) y Wider (Soria Melguizo). La principal caracterstica de estos
mtodos es su fcil y cmoda realizacin, permitiendo conseguir la identificacin
de la especie, dado que en su base de datos incluyen a la gran mayora de las
bacterias clnicamente importantes. En general, identifican bien a los BGN del
tipo de las enterobacterias y a los BGN no fermentadores, a los estreptococos
beta-hemolticos, a los enterococos, a algunos estreptococos alfa-hemolticos
y a los estafilococos. Algunos sistemas disponen de paneles especiales para
Streptococcus pneumoniae, BGP (como los de los gneros Listeria, Corynebac-
terium y Bacillus) y levaduras.
Todos los sistemas automticos actuales son parecidos en cuanto a rendi-
miento de porcentajes de identificacin. La diferencia fundamental se encuentra

en las pruebas de sensibilidad y en el sistema experto que utilizan. Unos emplean

simples reglas que aplican a los resultados y otros, como el Vitek2, utiliza el
AES (sistema experto avanzado) que est basado en el reconocimiento fenot-
pico del mecanismo de resistencia de la bacteria deducido a partir de la CMI y
aplicando la comparacin con una base de datos que incorpora los resultados
de las CMI publicadas en la bibliografa, o en documentos de consenso, y que
son actualizadas peridicamente.
Resumen
t &MBJTMBNJFOUP JEFOUJmDBDJOZBOMJTJTEFMBTCBDUFSJBTRVFDBVTBOFO-
fermedades en los seres humanos es una de las principales funciones
EFMNJDSPCJPMHPDMOJDP&MDPOPDJNJFOUPEFMBFTUSVDUVSB mTJPMPHBZ
metabolismo bacteriano es muy importante, al menos, para tres de las
reas fundamentales de la microbiologa mdica:
Cultivo de los microorganismos a partir de las muestras de los pa-

cientes.
o $MBTJmDBDJOFJEFOUJmDBDJOEFMPTNJDSPPSHBOJTNPTEFTQVTEFIBCFS
sido aislados.
Prediccin e interpretacin de su posible papel patgeno, colonizante
o contaminante, as como de sus fenotipos, patrones y mecanismos
de resistencia.
t &M DPOPDJNJFOUP EF MPT SFRVFSJNJFOUPT OVUSJDJPOBMFT EF VOB CBDUFSJB

concreta permite al microbilogo seleccionar los medios apropiados
de cultivo primario y optimizar las posibilidades de aislamiento del
patgeno.
t -B EFUFSNJOBDJO EF MBT DBSBDUFSTUJDBT UJOUPSJBMFT CBTBEBT FO MBT EJGF-
rencias de la estructura de la pared celular, es el primer paso hacia la
DMBTJmDBDJOUBYPONJDBEFMBCBDUFSJB
t -BT EJGFSFODJBT CJPRVNJDBT Z NFUBCMJDBT FOUSF NJDSPPSHBOJTNPT DPO-
GPSNBOMBCBTFEFMBNBZPSBEFMPTTJTUFNBTEFJEFOUJmDBDJOCBDUFSJBOB
actualmente en uso.
t -BDBQBDJEBEEFMBTCBDUFSJBTQBSBDBNCJBSSQJEBNFOUF BERVJSJSOVF-
vos genes y sufrir mutaciones plantea continuos retos diagnsticos al
microbilogo en relacin con el aislamiento y caracterizacin de los
microorganismos asociados a las infecciones en humanos.

4. BIBLIOGRAFA
1. Gobernado M, Lpez-Hontangas JL. Identificacin bacteriana. Enferm Infecc Microbiol Clin.
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2. Gobernado S, Lpez Hontangas JL, Crdoba J. Mtodos microbiolgicos en el diagnstico de
infecciones. En: Enfoque clnico de los grandes sndromes infecciosos, 2 ed. Madrid; 2006.
3. Koneman EW, Allen SD, Janda EM. Diagnstico Microbiolgico. Texto y Atlas Color, 5 ed. Edito-
rial Mdica Panamericana; 1999.
4. Mahon CR, Manuselis G Jr. Textbook of diagnostic microbiology. Philadelphia, Pennsylvania,
USA: W.B. Saunders Company; 1995.
5. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, et al., editors. Manual of Clinical Microbiology. 8 ed.
Washington: ASM Press; 2003.

Técnicas de Identificación (Tinciones)

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CAPTULO

J. L. Lpez-Hontangas, F. J. Castillo y M. Salavert

El propsito fundamental del diagnstico microbiolgico clnico es optimizar

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2. OBJETIVOS Y UTILIDAD DE LAS TCNICAS DE IDENTIFICACIN

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La taxonoma bacteriana convencional permite la identificacin de gneros y

3.1. Mtodos rpidos de identificacin bacteriana

Criterios y ejemplos metodolgicos aplicados a la identificacin

Observacin macroscpica Observacin e inspeccin de colonias: disposicin, tamaos,

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tiempo de 2 a 6 horas de incubacin, aunque algunas de ellas pudieran requerir

3.2. Tinciones rpidas

El examen de las muestras debe iniciarse con la inspeccin visual ordinaria

t Tincin de Gram: es de gran importancia en Microbiologa, ya que permite

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Tabla 2. Sistemas de observacin de los microorganismos patgenos

La tincin ms utilizada en microbiologa es, sin lugar a dudas, la tincin

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El aspecto de las bacterias en el microscopio permite plantear las siguientes

3.3. Identificacin presuntiva por la morfologa de las colonias

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blicos, que actan como indicadores de las actividades enzimticas y ayudan a

La capacidad de la morfologa colonial QBSB IBDFS VOB JEFOUJmDBDJO

3.4. Pruebas bioqumicas rpidas

3.5. Bateras y pruebas adicionales

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Principios, modos de accin y aplicaciones de algunas pruebas

*OEPM 5SJQUPGBOBTB Reaccin positiva (color rojo) identifica a E. coli,

nitiva. Siempre se parte de una identificacin preliminar (basada en la tincin de

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Coco gram-positivo No coco gram-positivo

Para la identificacin de los bacilos gram-negativos (BGN) aerobios, del

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Para la identificacin de los bacilos gram-positivos de los gneros Coryne-

3.6. Mtodos semi o completamente automatizados

En el mercado existen varios mtodos de identificacin semiautomticos y

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en las pruebas de sensibilidad y en el sistema experto que utilizan. Unos emplean

Cultivo de los microorganismos a partir de las muestras de los pa-

t &M DPOPDJNJFOUP EF MPT SFRVFSJNJFOUPT OVUSJDJPOBMFT EF VOB CBDUFSJB

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