Manual de Microbiología General

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
MANUAL DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA GENERAL
Elaborado por:
Dra. Rommy Tern. MSc.
Dra. Ana Poveda. PhD.
Dra. Ins Echeverra. MSc.
Docentes del rea de formacin bsica.
2016
CDIGO: PPL-LAB-01-MG
Versin: 02
GUIA DE PRACTICAS DE
Fecha de vigencia: 03/2016
MICROBIOLOGA
UCE- FAC.CCQQ GENERAL
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GENERAL
CONTENIDO
Contenido ............................................................................................................................................... 2
GENERALIDADES DEL CURSO PRCTICO................................................................................................... 3
PRACTICA N1: Seguridad en el laboratorio.............................................................................................. 5
PRACTICA N 2: Medios de cultivo microbiolgicos y mtodos de siembra. .............................................. 7
PRACTICA N 3: Tcnicas de tincin simple y diferencial. ....................................................................... 14
PRACTICA N 4: Tincin de estructuras microbianas: endoesporas y cpsulas ........................................ 18
PRACTICA N 5: Movilidad bacteriana. ................................................................................................... 21
PRCTICA N6: Medicin del crecimiento microbiano. Recuento directo e indirecto del nmero de
clulas totales de Escherichia coli. ......................................................................................................... 23
PRACTICA N 7: Recuento directo de clulas viables. ............................................................................. 29
PRACTICA N8: Mtodos de determinacin de la sensibilidad bacteriana a los antibiticos. Antibiograma.
.............................................................................................................................................................. 34
Prctica N 9. Metabolismo microbiano I. Pruebas bioqumicas en bacterias Gram negativas. ............... 39
PRACTICA N 10. metabolismo microbiano ii y Mecanismos de patogenicidad microbiana. Cocos Gram
positivos del gnero Staphylococcus ...................................................................................................... 43
Recursos bibliogrficos para la clase. ..................................................................................................... 46
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GENERAL
GENERALIDADES DEL CURSO PRCTICO

Durante este curso el estudiante se entrenar en las tcnicas microbiolgicas bsicas para el
manejo de microorganismos. El estudiante seguir protocolos para el contaje, observacin, aislamiento
e identificacin de microorganismos patgenos y no patgenos.
Objetivos del curso:
- Adquirir destreza en el manejo de cultivos microbiolgicos.

- Aplicar los conocimientos tericos en las sesiones prcticas.
- Comprender el fundamento de las metodologas empleadas en el laboratorio.
- Aprender a trabajar en equipo.
- Incentivar la actitud crtica e investigativa en los alumnos.
Modalidad de la clase:
Los estudiantes asistirn a una sesin de laboratorio semanal, la misma que se desarrollar en
dos partes: la primera ser la explicacin de lo que se va a realizar, para lo cual los alumnos DEBEN leer la
gua, de lo contrario perdern puntos en desempeo, y la segunda parte ser experimental en la que los
alumnos trabajarn en grupos pequeos y les ser asignado un cdigo individual y grupal. Este cdigo ser
usado para ETIQUETAR adecuadamente tubos, cajas y dems material para su fcil identificacin.
En la mayora de las prcticas se requiere que los estudiantes asistan los das anteriores para preparar los
medios de cultivo y tambin los das posteriores a la sesin de laboratorio para leer los resultados de los
cultivos y para lavar el material que utilizaron. El horario de lectura de resultados, preparacin y lavado
de material ser publicado oportunamente por la srta/sr ayudante o el/la docente. Los estudiantes que
no cumplan con las tareas asignadas tendrn puntos menos en desempeo.
Evaluacin: Los alumnos sern evaluados oralmente tanto sobre temas revisados en las prcticas
anteriores, como los que se van a realizar.
La nota de laboratorio es sobre 6 ptos distribuidos de la siguiente manera:

Evaluacin terica de laboratorio (al final de cada hemisemestre): 4 ptos
Cuaderno de laboratorio *: 2 ptos
* El cuaderno es individual y en este se presentarn los resultados de cada prctica y el cuestionario

correspondiente.
En la mayora de los reportes y trabajos de la asignatura, se deben especificar los nombres cientficos de
los microorganismos de la siguiente manera, primero el gnero con la primera letra mayscula y luego la
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especie escrita totalmente en letras minsculas. Tanto el gnero como la especie deben escribirse en
cursiva (en computadora) o subrayado (en el cuaderno). Ejs:
Escherichia coli o Escherichia coli
Escherichia es el gnero y coli es la especie.
Nombres cientficos mal escritos implicarn disminucin en la nota del cuaderno.
Las referencias bibliogrficas utilizadas para los reportes deben ser actualizadas, confiables y en formato
APA. Cuestionarios sin citacin correcta o en los que se evidencia PLAGIO tendrn la nota de CERO.
Polticas y requerimientos de la clase:

CADA estudiante debe utilizar un mandil blanco, cifrado con su nombre, un marcador permanente punta
fina para vidrio (evite el de color rojo), asa y aguja de inoculacin, un cuaderno cocido y el manual de
laboratorio impreso.
Se prohbe el uso de celulares o dispositivos electrnicos.
Se requiere que los estudiantes sean responsables en el manejo de equipos y materiales del
laboratorio. Si no sabe cmo usar un equipo o instrumento debe solicitar ayuda. Cualquier
conducta negligente que implique dao de los bienes del laboratorio ser sancionada y el
estudiante deber hacerse responsable de su arreglo o reposicin.
Si algn estudiante rompe material de vidrio debe NOTIFICAR a la profesora o ayudante y colocar
el material en el sitio destinado para material de vidrio roto.
Los estudiantes deben comprometerse a reponer el material de vidrio roto durante el semestre.
Los estudiantes cuidarn los bienes materiales del Laboratorio de Microbiologa General y
respetarn los de sus compaeros.
NO se aceptar la presentacin de cuadernos fuera de la fecha lmite de entrega.
Los estudiantes que no justifiquen su inasistencia a alguna prctica tendrn la nota de cero en el
reporte correspondiente.
Los estudiantes deben asistir puntualmente a las prcticas y evaluaciones.
Las prcticas de laboratorio y las evaluaciones NO SON RECUPERABLES.
Los estudiantes sern honestos y responsables en su trabajo, todo acto de plagio comprobado
por el docente, ser sancionado con una nota de cero en el reporte o evaluacin.
Los estudiantes mantendrn un trato respetuoso con todo miembro de la comunidad
universitaria.
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PRACTICA N1: Seguridad en el laboratorio.

Los laboratorios microbiolgicos constituyen medios ambientes de trabajo especiales,
generalmente nicos, que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas identificables para las
personas que se encuentran en o cerca de ellos. Se han reportado casos de infecciones adquiridas en el
laboratorio, donde el descuido, la negligencia o las malas tcnicas en la manipulacin de materiales
infecciosos han sido algunas de las causas.
Equipos de seguridad (barreras primarias) incluyen las cabinas de bioseguridad y el equipo de proteccin
personal.
Es obligatorio que cada estudiante lleve su equipo de proteccin personal en todas las prcticas de
laboratorio:
Guantes quirrgicos o de nitrilo de su talla (2 pares por prctica)
Mandil limpio con mangas y con todos los botones.
Zapatos cerrados (no se admite el uso de sandalias o zapatos sin punta).
Toca (opcional) y mascarilla
Normas de bioseguridad para todo el personal del laboratorio:
1. Se prohbe fumar, comer, beber o maquillarse.
2. En caso de que el estudiante tenga alguna herida, esta debe ser cubierta adecuadamente con
curita o gasa antes de iniciar la prctica.
3. Se prohbe el pipeteo con la boca.
4. En caso de derrames de agentes qumicos o biolgicos se debe notificar inmediatamente, de lo
contrario puede ser la causa de lamentables accidentes.
5. Si se producen eventos como cortes, pinchazos o quemaduras deben ser inmediatamente
notificados al docente o ayudante de ctedra.
6. Se designar en cada grupo de trabajo un alumno y un reemplazo que se encargarn de activar el
extintor en caso de ser necesario.
7. Por razones de seguridad no se admite el ingreso de estudiantes que no tomen la asignatura.
8. Todo material cortopunzante (agujas, palillos, hisopos, porta y cubre objetos, tubos rotos) debe
ser colocado en el recipiente destinado para ese fin.
9. Materiales que hayan estado en contacto con cultivos bacterianos o fluidos biolgicos y los
guantes quirrgicos usados, DEBEN desecharse en el tacho con FUNDA ROJA que es SOLAMENTE
PARA DESECHOS INFECCIOSOS, mientras que la basura comn se coloca en los tachos con FUNDA
NEGRA. Los estudiantes que incumplan esta norma sern sancionados.
10. Se debe usar los mecheros y lmparas de alcohol con cuidado, evitando contacto con piel y
cabello.
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11. Se debe limpiar el rea de trabajo con alcohol etlico antes y despus de ser usada.
12. NUNCA abandone el laboratorio sin lavarse bien las manos, su salud est en riesgo sino lo hace.
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GENERAL
PRACTICA N 2: Medios de cultivo microbiolgicos y mtodos de siembra.

Objetivos:
Describir los diferentes tipos de medios de cultivo y su utilizacin.

Preparar y esterilizar medios de cultivo en caja.
Aislar bacterias en cajas Petri mediante la tcnica de estriamiento, tomando en cuenta las tcnicas
aspticas de siembra.
Diferenciar las caractersticas y morfologa de las colonias bacterianas.
Introduccin:
En el laboratorio los microorganismos crecen en medios de cultivo que cumplen con requisitos
nutricionales para su desarrollo.
Los medios de cultivo contienen una fuente de energa, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo, oxgeno,
soluciones estabilizadoras del pH, trazas de elementos denominados microelementos, factores de
crecimiento, agua y otros ingredientes para permitir el crecimiento del microorganismo deseado. Con
frecuencia se utilizan suplementos como antibiticos o vitaminas.
MEDIOS DE CULTIVO
CLASIFICACIN.
En Microbiologa podemos encontrar varias clasificaciones de los medios de cultivo de acuerdo a lo

siguiente:
Por su composicin qumica.
Se usan dos medios de cultivo, los qumicamente definidos (simples) y los no definidos (complejos). Los
primeros. Sin embargo los medios complejos estn compuestos por sustancias nutritivas, pero no
definidas qumicamente.
Medios qumicamente definidos o simples: se preparan aadiendo cantidades conocidas de

compuestos orgnicos o inorgnicos. Por tanto se sabe la composicin qumica exacta del medio.
Los medios qumicamente definidos a su vez pueden ser medios selectivos, que se caracterizan
por tener compuestos que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos y por
potenciar el crecimiento del microrganismo requerido.
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GENERAL
Medios qumicamente indefinidos o complejos: son medios que emplean lisados de casena, de
carne, de soya, de levadura o cualquier sustancia altamente nutritiva cuya composicin es
qumicamente indefinida.
Por su estado fsico.
Esta clasificacin se basa en la cantidad de agente solidificante que existe. El agar es uno de los agentes
solidificantes ms comnmente utilizados, y es un polisacrido derivado de las algas rojas. Se distinguen
tres tipos de medios:
Medios slidos: agar 1,5%. Se preparan en caja Petri o en tubo (agar inclinado).
Medios semislidos: agar 0,7 %. Se preparan en tubo.
Medios lquidos: no contiene agar. Son los llamados caldos nutritivos y se preparan en tubos o
Erlenmeyers.
Por su selectividad de crecimiento.
Medios no selectivos: son medios en los que crece una amplia variedad de microorganismos sin
restriccin. Ej. Agar nutritivo, agar Mueller Hinton, tripticasa soya agar.
Medios selectivos: son medios que contienen agentes que favorecen el crecimiento de ciertos
microorganismos e inhiben el crecimiento de otros. Ej. Agar manitol contiene altas concentraciones de sal
de manera que solo microorganismos tolerantes a estas altas concentraciones como los estafilococos
pueden crecer.
Medios diferenciales: son medios empleados en la identificacin de diferentes grupos de

microorganismos de acuerdo a sus propiedades metablicas. Ej. En agar MacConkey se puede distinguir
bacterias que fermentan lactosa de las que no tienen esta caracterstica.
Procedimiento:
1ra parte: PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO EN CAJA PETRI.
En esta prctica se van a preparar medios slidos que se distribuyen en cajas Petri. La mayora de los
medios que se utilizan en el laboratorio de Microbiologa se esterilizan por calor hmedo en el autoclave.
Sin embargo, algunos compuestos de los medios de cultivo son termolbiles y se degradan por el calor,
por lo cual no pueden esterilizarse en el autoclave. Es importante que el estudiante lea las etiquetas de
los medios de cultivo cuidadosamente antes de preparar un medio de cultivo pues esta informacin viene
proporcionada en la etiqueta de los envases.
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GENERAL
Un ejemplo tpico son los aminocidos, algunos son termolbiles as que en este caso se puede esterilizar
por filtracin y agregarlos al medio base. Cuando el medio base se enfra hasta aproximadamente 45C,
se adicionan las cantidades requeridas de aminocidos, siempre en condiciones aspticas.
Otros medios, como el Agar SS y el XLDA requieren para su preparacin tener agua destilada previamente
esterilizada a la que se adiciona el medio en polvo, en condiciones de esterilidad.
As pues, dependiendo del medio, su composicin y del experimento a realizar, deberemos considerar el
mtodo ms apropiado para su preparacin. En esta prctica los estudiantes realizarn la preparacin de
un medio que se autoclava y de uno que no se autoclava.
Lo primero que se debe hacer antes de preparar medios, es buscar el nombre del medio en la LISTA DE
MEDIOS DE CULTIVO con que cuenta el laboratorio y determinar si el medio que va a preparar se
AUTOCLAVA o NO (esta informacin est en la etiqueta de cada medio).
Si el medio se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:

1. Se determina el volumen de medio de cultivo a preparar, esto depende del nmero de cajas y del
volumen de medio por caja, por lo general 25 ml. Todos los clculos de cunto debe pesar y del
volumen de medio a preparar, deben hacerse en el cuaderno de laboratorio. NO se aceptar el
uso de hojas sueltas.
Ejemplo:
Preparar 20 cajas de TSA (Tripticasa Soya Agar)
Volumen de medio de cultivo a prepararse = Nmero de cajas Volumen de medio por caja
Volumen de medio de cultivo a prepararse = 20 25 ml

Volumen de medio de cultivo a prepararse = 500 ml
2. Se calcula la cantidad de medio de cultivo a pesar, esto depende del volumen de medio a
prepararse y de la relacin peso-volumen del medio.
La relacin peso-volumen es propia de cada medio de cultivo, est dada por el fabricante y se encuentra
detallada en el frasco. Esta relacin por lo general es a un litro.
Continuando con el ejemplo anterior:
La relacin peso-volumen del medio TSA marca MERCK indicada en el frasco es: 40g/L o 40g/1000
ml.
Clculo (se realiza un regla de tres simple):
1000 ml de medio 40 g medio slido

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500 ml de medio Xg
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GENERAL
500 40
=
1000
= 20
3. Se ETIQUETA con el marcador de punta fina un Matraz de Erlenmeyer con el nombre del medio,
el nmero de cajas a preparar y el cdigo de la persona o grupo que lo prepar. La capacidad del
Matraz de Erlenmeyer debe ser MAYOR al volumen de medio de cultivo a preparar (etiquetar el
matraz es muy importante, si ud no lo etiqueta perder puntos en desempeo).
Disolver los 20g del medio en 250ml de agua destilada en un matraz de 1000 ml, una vez disuelto
completar el volumen con 250 ml ms.
Se tapa el matraz con papel aluminio con pequeos agujeros y se calienta hasta disolucin total
en la cocineta a temperatura baja, para ello se agita repetidamente sin abandonar el medio en la
hornilla. SE DEBE USAR GUANTES DE CALOR y evitar que el medio de cultivo se derrame, lo cual
puede causar QUEMADURAS GRAVES y prdida del material.
4. Para autoclavar el medio, se reemplaza el papel aluminio por un tapn de gasa que se cubre con
papel empaque y se sujeta con piola. Se coloca en el papel del tapn la misma informacin que
se escribi en el matraz.
5. Una vez que el medio sale del autoclave, se procede a la reparticin en cajas, para lo cual se
trabaja en el interior de la cabina, que ha sido previamente desinfectada con alcohol etlico. Se
enciende el mechero y se procede a sacar las cajas Petri estriles de su empaque y etiquetarlas
en la BASE con el nombre del medio.
6. Antes de distribuir el agar en cajas Petri, se debe esperar a que el medio alcance la temperatura
de distribucin que es de 45-50C. Si la temperatura es ms alta, habr excesivo vapor de agua
en las cajas, lo cual puede afectar la calidad de los cultivos, y si es ms baja puede empezar a
solidificarse y no podr ser distribuido.
7. Las cajas tapadas se dejan solidificar a temperatura ambiente (aproximadamente 1 hora), luego
se guardan en refrigeracin con la tapa hacia abajo, en una funda plstica y etiquetada con el
nombre del medio, el nmero de cajas que contiene y el grupo al que pertenecen.
Si el medio NO se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:
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Leer cuidadosamente la PREPARACIN (instrucciones del fabricante) del medio de cultivo, est
informacin se localiza en el frasco que contiene el medio. Identificar la frase: NO AUTOCLAVE. Si no
est seguro de cmo preparar un medio, debe solicitar AYUDA al encargado/a del laboratorio.
1. Se determina el volumen de medio de cultivo a preparar y se manda a autoclavar un matraz con

la cantidad de agua destilada que se calcul.
2. Se calcula la cantidad de medio de cultivo y se pesa en la balanza que est dentro de la cabina
(que ha sido previamente desinfectada) y est con el mechero encendido.
3. Una vez que el agua sale del autoclave es llevada a la cabina donde se procede a colocar
aspticamente, el medio en polvo pesado.
4. Se vuelve a tapar el matraz y se calienta el medio hasta disolucin total, para ello se agita
repetidamente (evitando el sobrecalentamiento) y cuidando que el medio de cultivo no se
derrame. No quite el tapn durante en calentamiento, recuerde que el medio est ESTERIL.
5. Para los pasos finales referirse al numeral 7 y 8 del procedimiento para preparar medios que se
autoclavan que se detall arriba.
2da parte: METODO DE SIEMBRA POR ESTRIA.
En Microbiologa es una tcnica comn el transferir microorganismos de un cultivo a otro, a esto se

denomina subcultivo. La finalidad de usar la tcnica de estriamiento para hacer un subcultivo, es tener
COLONIAS AISLADAS de microorganismos. En esta prctica se pretende que los estudiantes hagan el
subcultivo de microorganismos que estn en un medio lquido (o slido) a otro medio slido en cajas Petri
por medio de estriamiento. La finalidad es que aslen colonias y puedan apreciar el crecimiento de las
bacterias en diferentes medios de cultivo.
Procedimiento:
1. Las cajas que contienen los medios de cultivo deben ambientarse por unos minutos antes de
empezar el trabajo y debe asegurarse que no tengan exceso de agua.
2. Se anota el color del medio antes de sembrar los microorganismos, pues esto ayudar luego en la
interpretacin de los resultados.
3. Se etiquetan las cajas en la BASE con la informacin necesaria. Ej. Cdigo personal, nombre del
microorganismo y la fecha.
4. Se limpia el rea de trabajo con alcohol etlico para lograr un ambiente asptico y evitar la
contaminacin del cultivo.
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GENERAL
5. Se enciende el mechero o la lmpara de alcohol y se esteriliza el asa de atrs hacia adelante en la

zona ms caliente de la llama (la tcnica ser indicada en la prctica).
6. Si el cultivo a partir del cual se har el subcultivo es un caldo, se destapa el tubo con cuidado y se
flamea la boca en el mechero. Se procede a tomar un inculo con el asa fra. Se flamea el tubo
nuevamente y se tapa.
7. Si el cultivo es slido, se destapa cuidadosamente la caja y se procede a tocar una colonia aislada
con el asa fra y luego se estra el material en la nueva caja de cultivo.
8. Se procede a realizar el estriamiento en la caja de cultivo como se observa en la fig 2.1.
9. Se esteriliza el asa cuidando de no generar aerosoles (pequeas gotas que pueden contener
microorganismos).
10. Se coloca la caja en la incubadora con la base hacia ARRIBA por 18 a 24 horas a 37C a este proceso
se denomina INCUBACIN.
11. Al da siguiente se procede a leer los resultados y se anotan en el cuaderno. Se observa si hubo
cambio en el color del medio as como las caractersticas de las colonias (forma, tamao, color y
bordes), como se observa en la fig 2.2.
Fig 2.1. Ejemplo de cmo se puede estriar microorganismos en caja.
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GENERAL
Fig. 2.2. Ejemplos de las caractersticas de las colonias.
Reporte de resultados:
Siembra por estra en medios slidos en caja (hacer un cuadro por cada medio).
Nombre de medio slido:
Utilidad del medio
Color del medio antes del cultivo
Color del medio despus del cultivo
Microorganismo que fue sembrado por estriacin
Crecimiento (si o no)
Colonias aisladas (si o no)
Color de las colonias aisladas
Tamao de las colonias aisladas
Forma de las colonias aisladas
Elevacin de las colonias aisladas
Borde de las colonias aisladas
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GENERAL
PRACTICA N 3: Tcnicas de tincin simple y diferencial.

Objetivos:
Reconocer la diferencia entre una tincin simple y diferencial.

Aprender el procedimiento adecuado para preparar un frotis bacteriano.
Por medio de la tincin distinguir las diferentes morfologas bacterianas.
Introduccin:
Los microorganismos se colorean para aumentar el contraste de las clulas con el medio que las
rodea, lo cual mejora su visualizacin y permite distinguir formas y tamaos. Tambin se pueden
diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes.
Tincin simple
Se refiere al uso de UN SOLO COLORANTE para crear contraste entre el microorganismo y el medio que lo
rodea. Este tipo de tincin es sencilla y aporta informacin de la forma de la clula, el tamao y su manera
de agruparse. Se emplean colorantes bsicos como el cristal violeta, cabolfuscina y azul de metileno.
Tincin diferencial.
En la tincin diferencial se utiliza ms de un colorante. Un ejemplo de tincin diferencial ampliamente

usada en microbiologa, para diferenciar bacterias, es la tincin Gram (llamada as por el cientfico dans
Christian Gram, 1853-1938), en la que a ms de ser til para evidenciar la forma, tamao y la manera de
agruparse de los microorganismos, sirve para distinguirlos entre Gram positivos y Gram negativos
dependiendo del color que adoptan despus de la coloracin, lo cual est relacionado con las
caractersticas de la pared celular bacteriana.
El primer paso consisten en colorear el frotis con un colorante bsico denominado cristal violeta que tie
la pared celular o peptidoglicano de TODAS las bacterias, el lugol (solucin a base de iodo) que es el
segundo colorante es un mordiente cuya funcin es incrementar la interaccin entre la pared bacteriana
y el cristal violeta. El frotis es luego decolorado con una solucin de etanol 95% o isopropanol-acetona
(3:1 v/v). Los microorganismos GRAM POSITIVOS (pared celular gruesa) retienen el complejo cristal
violeta-lugol en el paso de decoloracin, mientras que los GRAM NEGATIVOS (pared celular delgada)
pierden el complejo y se decoloran. Finalmente, al agregar el colorante de contraste, la safranina de color
rojo, las bacterias que dejaron ir al cristal violeta o sea las Gram negativas se tien con este colorante y
muestran una coloracin roja o rosada.
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Procedimiento:
- Se prepara el frotis (fig 3.1), lo cual comprende las siguientes etapas:
1) Extensin de la muestra. Con un lpiz de cera se etiqueta la placa en uno de los bordes con el
nmero de identificacin correspondiente y el nombre del microorganismo. Si se va a realizar la
coloracin a partir de un cultivo en medio lquido, se coloca con el asa (previamente esterilizada)
una gota de cultivo sobre un portaobjetos limpio y se extiende. Si la muestra proviene de un
cultivo en medio slido, se coloca primero una gota de agua estril o solucin fisiolgica estril
sobre el portaobjetos y se toma la muestra con el asa (previamente esterilizada), se homogeniza
bien con el asa y se extiende.
2) Secado. Se deja secar la placa portaobjetos al ambiente.
3) Fijacin. Un vez seco se fija el frotis por calor, para lo cual se pasa la placa portaobjetos tres
veces por la llama del mechero. La fijacin por calor es el mtodo ms utilizado y su propsito es
matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la clula y adherir la preparacin al
portaobjetos. Sin la fijacin se lavara el frotis durante el proceso de tincin.
- Tincin simple:
1. Una vez preparado el frotis se procede a realizar la coloracin.

2. Se coloca la placa en un soporte para tinciones.
3. Se cubre con solucin de azul de metileno y se deja actuar durante 1 min. Si se usa cristal violeta
se deja por 30 segundos.
4. Transcurrido el tiempo se lava con agua, se elimina el exceso de agua de la placa con papel
absorbente y se coloca una pequea gota de aceite de inmersin.
5. Se observa en el microscopio ptico con el lente de 100X.
- Tincin Gram:
1. Una vez preparado el frotis, se procede a su coloracin.

3. Se cubre con solucin de cristal violeta y se deja actuar durante 1 min.
4. Transcurrido el tiempo se lava con agua.
5. Se cubre con lugol y se deja actuar durante 1 min.
6. Transcurrido el tiempo se lava con agua.
7. Se cubre la placa con alcohol-cetona y se deja actuar durante 20 segundos moviendo suavemente
la lmina. Adicionar la solucin decolorante hasta que no quede cristal violeta en la placa. *El paso
de decoloracin es CLAVE para lograr una tincin satisfactoria y no debe sobrepasar el tiempo
recomendado.
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GENERAL
8. Se lava con agua.

9. Se cubre con safranina y se deja actuar durante 30 segundos.
10. Se lava con agua, se elimina el exceso de agua de la placa con papel absorbente y se coloca una
pequea gota de aceite de inmersin.
11. Se observa en el microscopio ptico con el lente de 100X. Las bacterias Gram positivas se vern
de color azul-violeta y las Gram negativas rojas o rosadas.
Tincin simple OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Nombre del microorganismo:
Tipo de cultivo:
Morfologa: (Cocos o Bacilos)
Forma de agrupacin
(cadenas, pares, racimos de
uvas):
Tincin diferencial GRAM POSITIVO GRAM NEGATIVO
Tincin Gram
Tipo de cultivo:
Forma de agrupacin:
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GENERAL
Fig 3.1. Preparacin de un frotis bacteriano a partir de un medio slido y lquido.
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GENERAL
PRACTICA N 4: Tincin de estructuras microbianas: endoesporas y cpsulas

Objetivos:
Seleccionar el tipo de tincin dependiendo de la estructura que se desea observar.

Distinguir y reconocer endosporas y cpsulas al observar al microscopio placas teidas.
Introduccin:
Endosporas bacterianas.
Ciertas especies bacterianas, en particular de los gneros Bacillus y Clostridium, producen elementos de
resistencia denominados endosporas debido a que se forman dentro de la clula.
A diferencia de la clula vegetativa, la endospora es muy resistente a condiciones adversas tales como
alta temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes qumicos. Es una forma de vida latente que puede
permanecer largos perodos como tal y cuando desaparecen las condiciones adversas pueden germinar.
Tambin puede inducirse esa germinacin mediante, por ejemplo, un shock trmico, es decir un
calentamiento a 80C.
Las endosporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las tcnicas de
coloracin comunes aparecern como regiones sin teir dentro de las clulas coloreadas. Por lo tanto,
para teirlas, se deben usar mtodos de coloracin especiales; una vez coloreada, la endospora resiste
fuertemente la decoloracin. La posicin de la endospora dentro de la clula es caracterstica y puede ser
central, subterminal o terminal.
Procedimiento:
- Tincin de endosporas (Mtodo de Schaeffer-Fulton)
1. Se prepara el frotis (referirse a la prctica 3)*.

*Para la observacin de endosporas se partir de un medio slido del que se debe tomar una
cantidad considerable de muestra, de tal manera que el frotis sea grueso y concentrado.
3. Se cubre con solucin de verde de malaquita y se calienta la placa pasndola cuidadosamente
sobre la llama del mechero. Una vez que se observe el desprendimiento de vapores, seguir
calentado la placa por 2 minutos. EVITAR que hierva o que se seque el colorante por
sobrecalentamiento. Se puede aadir ms colorante de ser necesario.
4. Se espera que la placa se enfre y se lava con agua, de lo contrario se puede romper o trizar
por el cambio brusco de temperatura.
5. Se cubre la placa con safranina y se deja actuar por 30 segundos.
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6. Se lava con agua, se seca la placa con papel absorbente y se coloca una pequea gota de
aceite de inmersin.
8. Las endosporas en libertad o en formacin aparecen de color verde, mientras que el resto de
la clula y las formas vegetativas aparecen de color rojo.
Cpsulas.
Muchas bacterias tienen una capa mucosa que las rodea, la cual se denomina comnmente cpsula, su
composicin as como su grosor vara entre especies de bacterias. Estas estructuras estn formadas por
polisacridos, polipptidos y glucoprotenas y sirven para proteger a los microorganismos de la accin
fagoctica de las clulas de defensa del sistema inmune del husped.
Hay dos mtodos para observar la cpsula en el laboratorio: el de Anthony y el de Graham y Evans. En
esta prctica seguiremos el de Graham y Evans.
Procedimiento:
1. En el extremo de la placa portaobjetos se mezcla una pequea asada del cultivo de

Klebsiella pneumoniae con una pequea cantidad de tinta china (2 gotas). No olvide
etiquetar la placa en el extremo donde no est la muestra.
2. Se extiende esta mezcla con la ayuda de una segunda placa.
3. Hay que permitir que la placa se seque al ambiente.
4. GENTILMENTE se enjuaga la placa con agua destilada de manera que el frotis no se pierda
con el lavado.
5. Se cubre la preparacin con cristal violeta por 1 minuto.
6. Se enjuaga con agua.
7. Se tie con safranina por 1 minuto y medio.
8. Se lava con agua, se seca la placa con papel absorbente y se coloca una pequea gota de
aceite de inmersin.
10. Si la cpsula est presente se observarn las bacterias rosadas o rojas rodeadas por una
zona clara y el fondo del campo estar oscuro.
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Tincin para endosporas OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Nombre del
microorganismo:
Tipo de cultivo:

Tincin para cpsula OBSERVACION AL MICROSCOPIO.
Nombre del
microorganismo:
Tipo de cultivo:
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PRACTICA N 5: Movilidad bacteriana.

Objetivo:
Distinguir entre el movimiento bacteriano y el movimiento browniano al observar al microscopio

placas preparadas mediante la tcnica de la gota pendiente.
Introduccin:
Muchos microorganismos son capaces de moverse porque poseen estructuras denominadas flagelos, los
mismos que son apndices largos, delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la clula
por otro.
La clula bacteriana puede tener uno o ms flagelos dispuestos de manera distinta y en base a esa
disposicin la flagelacin puede ser:
- polar: uno solo flagelo en un extremo del cuerpo celular.
- anftrica: un solo flagelo en cada uno de los dos extremos.
- loftrica: penacho de flagelos en un extremo
- pertrica: flagelos alrededor de toda la clula
Procedimiento:
El mtodo de la gota pendiente (fig 5.1) ayuda a observar la movilidad de bacterias vivas, no propiamente
la estructura flagelar de tal manera que no es un mtodo de tincin de flagelos.
1. Con un palillo de dientes se coloca un anillo de vaselina alrededor de la concavidad de una placa
de depresin.
2. Se coloca con el asa de inoculacin una pequea gota del cultivo bacteriano (previamente
homogenizado) en el centro de un cubreobjeto limpio.
3. La placa de depresin se coloca sobre el cubreobjeto de manera que la gota de cultivo protruya
hacia el centro de la concavidad. Se presiona suavemente.
4. Se voltea la placa de manera que el cubreobjetos est ahora encima.
5. Se examina al microscopio. Primero con el lente de menor aumento se localiza la gota y luego
usando aceite de inmersin se procede a observar con el lente de 100X. Se debe cerrar el
diafragma de manera que se incremente el contraste y mejore la visualizacin.
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6. Se observa la forma de moverse de los microorganismos (corridas o tumbos). Hay que ser
cuidadoso para distinguir entre el movimiento Browniano y la movilidad bacteriana propiamente
dicha.
7. Las placas usadas se descartan en una solucin desinfectante pues los microorganismos estn
viables.
Gota pendiente para la observacin de movilidad.
Describa lo que observ en

cuanto al movimiento de los
microorganismos
Fig 5.1 Mtodo de la gota pendiente para la observacin de movilidad bacteriana.
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PRCTICA N6: Medicin del crecimiento microbiano. Recuento directo e

indirecto del nmero de clulas totales de Escherichia coli.
Objetivo:
Medir de la turbidez del cultivo (mtodo indirecto) y comparar estos datos con los del recuento
del n de clulas al microscopio (mtodo directo).
Introduccin:
El crecimiento microbiano se define como un incremento en el n de clulas, es decir, se refiere

al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de cada clula
individual y su divisin celular. El crecimiento de un microorganismo depende de varios factores como:
1. El microorganismo en s. As por ejemplo, en condiciones ptimas E.coli tiene un ciclo de vida de 15-20
minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas.
2. La composicin del medio de cultivo. Las clulas crecern ms lentamente en un medio mnimo (MM)
que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la fuente de carbono y de la facilidad
con que la asimilen crecern ms o menos rpidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc)
como fuente de carbono que con galactosa (Gal).
3. Las condiciones de incubacin. La temperatura de incubacin, la concentracin de CO2 en la atmsfera

de cultivo, la agitacin, etc... son factores importantes.
4. La procedencia y caractersticas del inculo. La curva de crecimiento variar dependiendo de que se

parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento exponencial, que se pase un cultivo crecido en
MM+Glc a MM+Gal o de MR a MM+Glc.
Existen varios mtodos para medir el crecimiento microbiano:
1. MTODOS DIRECTOS: son aquellos en los que se cuenta el n total de clulas en un volumen
conocido y as se estima el n total en la poblacin. Entre ellos:
1.1. Recuento directo del n de clulas al microscopio. Se utilizan portas especialmente diseados para
el recuento celular y denominados cmaras de recuento. Existen varios tipos de cmaras de
recuento, una de ellas es la cmara Thoma que es la que nosotros utilizaremos. Este mtodo tiene
el inconveniente de que no diferencia entre clulas viables y no viables. Es poco preciso.
1.2. Contadores electrnicos o citmetros de flujo. Las clulas son suspendidas en un fluido conductor
que pasa lentamente a travs de una abertura fina por la que pasa una corriente elctrica. Cada
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clula que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos

convenientemente amplificados son registrados electrnicamente dando una medida directa del
n de clulas en el medio. No diferencia entre clulas viables y no viables ni entre clulas o
partculas inertes.
1.3. Recuento de clulas viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre placas
Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una nica
clula. Si se multiplica por el factor de dilucin tendremos el n de clulas en cultivo. Slo detecta
viables pero es un mtodo lento y caro por el elevado nmero de placas que hay que utilizar para
que los resultados sean significativos.
2. MTODOS INDIRECTOS: son aquellos que utilizan parmetros distintos del n de clulas, pero que
pueden relacionarse de forma directa con ste (masa celular, actividad metablica, etc).
Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos los
constituyentes celulares y as la velocidad de crecimiento de la poblacin puede estimarse por la velocidad
del incremento de cualquiera de estos parmetros. Entre los mtodos indirectos se encuentran:
2.1. Determinacin del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y estimar
el n de clulas proporcional a sta.
2.2. Determinacin del nitrgeno celular. Medir el contenido proteico del cultivo.
2.3. Determinacin del DNA
2.4. Determinacin de una actividad metablica segn el tipo de microorganismo: consumo de

oxgeno (en aerobios), liberacin de CO2 u otro producto de fermentacin, aumento de la
concentracin de alguna enzima constitutiva, incorporacin en la clula de algn material
radiactivo, etc.
2.5. Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las clulas y partculas en general de
absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece turbio porque las
clulas dispersan la luz que atraviesa la suspensin. La turbidez es proporcional al nmero de
clulas y puede medirse utilizando un espectrofotmetro. El espectrofotmetro es un aparato
que hace pasar la luz a travs de una suspensin celular y detecta la luz no dispersada. Este
instrumento mide la relacin de intensidad entre la luz incidente y la emergente despus de
atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el n de clulas mayor es la turbidez del cultivo o densidad
ptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la muestra. Por
tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo, esto es as dentro
de ciertos lmites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse agregados celulares
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y producirse un efecto pantalla de unas clulas sobre otras. Por tanto, en algunos casos ser
necesario diluir la muestra antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilucin 1/10 se
mezclara 1 ml de cultivo con 9 ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilucin sea alta (mayor
de 1/10) conviene hacer diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilucin 1/50
primero se hace una dilucin 1/10 y despus se hace una dilucin 1/5 de la dilucin 1/10). Este
mtodo no diferencia entre clulas vivas y muertas. Cuando seguimos el crecimiento de una
poblacin microbiana, midiendo por ejemplo su DO en funcin del tiempo, obtenemos su curva
de crecimiento, que nos viene dada por una grfica del tipo:
El incremento en el nmero de clulas es lento al principio y despus llega a ser de forma exponencial.
Esta grfica es caracterstica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados.
En la curva se distinguen cuatro fases:
Fase de latencia. Fase de adaptacin de las clulas a las nuevas condiciones del medio de incubacin al
que han sido transferidas. Las clulas no crecen inmediatamente sino despus de este tiempo de latencia.
Las clulas son metablicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un
mismo inculo, esta fase de latencia vara dependiendo del medio al que se transfieren y de las
condiciones de incubacin.
Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las clulas se estn dividiendo regularmente a ritmo
constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es mximo. Es en este
periodo donde puede calcularse el tiempo de generacin de un microorganismo.
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Fase estacionaria. El n de clulas no se incrementa ms porque los nutrientes del medio se van agotando
y posibles sustancias txicas pueden ir acumulndose. No hay incremento neto del n de clulas, el n de
clulas que se originan es igual al n de las que mueren.
Fase de muerte celular. Las clulas mueren a una velocidad mayor a la que se originan debido al
agotamiento total de algn nutriente y/o excesiva acumulacin de sustancias txicas.
A veces la muerte va acompaada de lisis celular y esto disminuye la absorbancia del cultivo.
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GENERAL
a) Empezando con una clula, si cada producto de la reproduccin se divide por fisin binaria, la
poblacin se doblar con cada nueva generacin. Este proceso puede ser representado con
logaritmos (2 elevado a un exponente).
b) Al dibujar el log de las clulas se produce una lnea que indica el crecimiento exponencial: si se
dibuja el nmero de clulas aritmticamente, se obtiene una lnea curva.
Materiales
Precultivo de E. coli (50 mL)

Medio LB (Luria Bertani) 1L/curva de crecimiento
Pipetas estriles (10 mL, 5 mL, 2 mL, 1 mL)x15 (por cada curva de crecimiento)
Matraces de 1L (3/curva de crecimiento)
Puntas azules y amarillas estriles
cmara de recuento (Cmara Thoma o Neubauer)
microscopio ptico
espectrofotmetro
Mecheros de alcohol o cmara de esterilidad
incubadores a 37 C con agitacin
Procedimiento:
1. Da -2. Sembrar la cepa en placa.
2. Da -1. Poner un precultivo de 50 mL de LB.
3. Da 0. Medir la A600 del precultivo y determinar el volumen de inculo para tener 250 mL de
cultivo a A600inicial=0.050 (t0).
Seguiremos la evolucin de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. en el espectrofotmetro cada 30 min
mientras dura la prctica.
Al mismo tiempo contaremos los microorganismos usando la cmara de recuento o cmara Thoma. Esta
cmara de recuento consiste en un porta modificado con una hendidura de 0,1 mm de profundidad. Est
dividida en 16 cuadrados y stos a su vez divididos en 16 25 celdillas. Cada celdilla tiene una superficie
de 0,0025 mm2 y una profundidad de 0,1 mm. Por tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de 0,00025
mm3. Como hay 16 celdillas por cuadrado, el volumen total de una celda (VT) es de
Vc 16 = 0,004 mm3. Como 1 mm3 = 10-3 mL
V = 4 10-6 mL (volumen de una celda)
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GENERAL
Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (X) de clulas por celda y se expresa la concentracin en
clulas por ml:
X cel / 4 10-6 ml = X 25 104 clulas/ml
Hora de Densidad ptica (OD600) Nmero de clulas/ml

lectura (cmara de Thoma)
Realizar una grfica OD vs tiempo.
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PRACTICA N 7: Recuento directo de clulas viables.

Objetivos:
Comparar los resultaos obtenidos en las tcnicas de siembra por extensin y vertido en medios
slidos utilizados para el recuento de microorganismos a partir de muestras de alimentos.
Determinar las diferencias entre estos dos mtodos de contaje de clulas viables.
Introduccin:
Las tcnicas de siembra por vertido en placa y por extensin se emplean para obtener colonias
aisladas de microorganismos a partir de muestras lquidas. El paso previo en ambas tcnicas es la dilucin
de la muestra original para reducir la poblacin microbiana lo suficiente como para obtener colonias
separadas que se puedan contar en placas de medios. El nmero de colonias por placa debe oscilar entre
30 y 300 para que el clculo del nmero de colonias en la muestra sea estadsticamente significativo.
En la siembra por vertido, pequeos volmenes de las muestras diluidas se colocan en cajas Petri estriles
y se mezclan con TSA (Tripticasa soya agar) lquido y que ha sido enfriado a 45 a 55 C (temperatura de
distribucin). Despus de que el agar se ha solidificado, cada clula es inmovilizada y formar una colonia.
Las colonias se forman tanto en la superficie como en el entramado del agar.
En la siembra por extensin las muestras diluidas se esparcen en la superficie del agar con ayuda del asa
de Digralsky de manera que las bacterias se multiplican y forman colonias solo en la superficie de la placa.
Mediante los dos mtodos se establece que el nmero total de colonias es equivalente al nmero de
microorganismos viables en la muestra diluida.
Procedimiento:
Diluciones sucesivas decimales (paso previo tanto para la siembra por extensin como por vertido)
figura 7.1:
1. Para obtener la dilucin 1/10 o 10-1 se toma 1 ml de la muestra a analizar y se coloca en un tubo que
contenga 9 ml de agua peptonada (AP) o TSB y se homogeniza bien la mezcla. O se toman 10 g o 10
ml de la muestra de alimento y se la colocan en un recipiente que contiene 90 ml de AP o TSB.
2. Para obtener la dilucin 1/100 o 10-2 se toma 1ml de la dilucin 10-1 y se coloca en un tubo que
contenga 9 ml de AP o TSB y se homogeniza bien la mezcla.
3. Para obtener la dilucin 1/1000 o 10-3 se toma 1ml de la dilucin 10-2 y se coloca en un tubo que
contenga 9 ml de AP o TSB.
4. Se puede continuar diluyendo la muestra si se sospecha que la carga microbiana que contiene es alta,
para de esta manera asegurar que se puedan contar las colonias de microorganismos.
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Tcnica de siembra por extensin:

1. Se etiquetan 2 cajas de TSA por cada dilucin realizada.
2. Para esterilizar el asa de Digralsky, esta se humedece con alcohol potable y se procede a flamear
en la llama del mechero.
3. Se coloca en el centro de cada caja 0.1 ml de cada dilucin (usar una pipeta estril para cada
dilucin).
4. Se extiende la muestra en toda la superficie del agar con el asa de Digralsky con movimientos
hacia a delante y hacia atrs a la vez que se rota la caja.
5. Las cajas se incuban durante 24 horas a 37 C.
6. Se cuenta el nmero de colonias en todas las diluciones.
7. Se calcula el promedio del nmero de colonias en cada dilucin y se reporta el nmero de
microorganismos encontrados en la muestra original en ufc/ml o ufc/g
Tcnica de siembra por vertido:
1. Se etiquetan 2 cajas de TSA por cada dilucin realizada.

2. Se coloca en cada caja 1 ml de cada dilucin (usar una pipeta estril para cada dilucin).
3. Se disuelve el medio TSA (previamente esterilizado) en un bao de agua.
4. Se deja enfriar el medio hasta que alcance la temperatura de distribucin de 45 a 55C y se vierte
sobre la muestra en cada caja.
5. La muestra se distribuye en el agar fundido realizando movimientos circulares en sentido de las
manecillas del reloj y en sentido contrario.
6. Se espera que el agar se solidifique y se incuban las cajas durante 24 horas a 37 C.
7. Se cuenta el nmero de colonias en todas las diluciones (tomar en cuenta tanto las colonias de la
superficie como las que crecen dentro del medio).
8. Se calcula el promedio del nmero de colonias en cada dilucin y se reporta el nmero de
microorganismos encontrados en la muestra original en ufc/ml o ufc/g
En la figura 7.2 se pueden observar las dos tcnicas.
Identificacin de la muestra
Muestra
Apariencia (color, olor)
Procedencia
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Resultados. Tcnica Vertido: Contaje Total de Mesfilos aerobios (Resultados Intermedios)
Dilucin Ufc/caja 1 Ufc/caja 2 Promedio Factor de Ufc/mL

Ufc/caja Dilucin
Resultados. Tcnica por extensin: Contaje Total de Mesfilos aerobios (Resultados Intermedios)
Dilucin Ufc/caja 1 Ufc/caja 2 Promedio Factor de Ufc/mL

Ufc/caja Dilucin
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Fig 7.1. Tcnica de diluciones sucesivas.
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Fig 7.2 Tcnicas de siembra: extensin y vertido.
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PRACTICA N8: Mtodos de determinacin de la sensibilidad bacteriana a los

antibiticos. Antibiograma.
Objetivo:
- Determinar la sensibilidad o resistencia de una cepa bacteriana frente a distintos antibiticos.
Introduccin:
Conocer la sensibilidad bacteriana a los antibiticos tiene varias aplicaciones, como por ejemplo
dirigir el tratamiento frente a una infeccin causada por un agente conocido, generar una base de datos
para determinar la presencia de cepas resistentes y su seguimiento.
Los mtodos para determinar la sensibilidad frente a antimicrobianos pueden ser cualitativos o
cuantitativos.
Los mtodos cualitativos son aquellos que permiten clasificar a los microorganismos en sensibles,
moderadamente sensibles o resistentes frente a los antibiticos en estudio, para lo cual se sigue la tcnica
de difusin en agar, antibiograma o mtodo de Kirby-Bauer. En la cual un inculo microbiano de
concentracin conocida, se siembra por hisopado en una placa de agar Mueller-Hinton*. sobre la que se
depositan discos de papel filtro (tambin llamados discos de antibiograma) impregnados con el antibitico
(fig 8.1). El antibitico difunde en el agar y puede o no formarse a su alrededor un halo de inhibicin de
crecimiento. Dependiendo del dimetro del halo de inhibicin se puede establecer si el microorganismo
es sensible, moderadamente sensible o resistente al antibitico.
Los mtodos cuantitativos son aquellos que permiten calcular la concentracin inhibitoria mnima (CIM)
y la concentracin mnima bactericida (CMB). La CMI es la mnima concentracin del antibitico capaz de
inhibir el crecimiento de un inculo bacteriano previamente estandarizado. Mientras que la CMB es la
mnima concentracin del antibitico capaz de matar al 99.99% de una poblacin bacteriana previamente
estandarizada. La determinacin de la CMI se realiza por la tcnica de dilucin en tubo que consiste en
exponer a las cepas de microorganismos a estudiar, a diferentes concentraciones del antimicrobiano, en
diluciones a la mitad y observar el crecimiento o no de los microorganismos en los tubos.
Tcnica para el mtodo de difusin en agar o antibiograma
a) Preparacin del inculo.
- Mtodo de suspensin directa de colonias.- a partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas tomar
varias colonias con un asa o hisopo y ajustar el inculo a una turbidez equivalente a 0.5 McFarland que
equivale a 1.5 x 108 ufc/ml, en suero fisiolgico o agua destilada estril. Agitar en "vortex" durante 15-20
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segundos. El control del inculo se realiza con un estandar de 0.5 McFarland que se puede preparar o
comprar.
b) Inoculacin de placas.
Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inculo, introducir un hisopo estril dentro
de la suspensin y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo para eliminar cualquier exceso.
Inocular completamente el medio mediante la tcnica de hisopado y dejar secar por 5 minutos antes de
depositar los discos. El medio ms comnmente usado en esta tcnica es el Agar Mueller-Hinton que es
un medio nutritivo no selectivo que por su composicin ha sido recomendado por el CLSI para ser
utilizado de forma rutinaria en la realizacin del antibiograma en medio slido. Este medio presenta
buena reproducibilidad en las pruebas de sensibilidad, bajo contenido en inhibidores de sulfonamidas,
trimetoprima y tetraciclina y, la mayora de los patgenos microbianos crecen satisfactoriamente.
El medio Agar Mueller -Hinton debe cumplir con los siguientes parmetros antes de su utilizacin:
- Cationes divalentes.- este medio posee una concentracin baja de iones divalentes y debe ser
suplementado para obtener concentraciones fisiolgicas adecuadas. (20 a 35ug/L de Mg2+ y 50 a 100ug/L
de Ca2+). Las variacin en cationes divalentes, principalmente Mg y Ca afecta los resultados de ensayo de
aminoglucsidos y tetraciclinas con cepas de Pseudomonas aeruginosa. Para ello se debe probar con la
cepa P. aeruginosa ATCC (American Type Culture Collection) 27853 con gentamicina 10ug y debe dar una
lectura de 16-21mm.
-pH.- el pH del medio debe ajustarse entre 7.2 - 7.4 Si el pH es muy bajo, ciertas drogas pareceran
perder potencia (ej. aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos), mientras que otras drogas pueden
presentar excesiva actividad (ej. tetraciclinas). Si el pH es muy alto se esperan efectos opuestos. El pH se
ajusta con HCl o NaCl 0.1N estriles.
-Timina y Timidina.- el medio debe contener bajo contenido de Timidina o Timina para evitar
invertir los efectos inhibitorios de sulfonamidas y trimetoprim, dando zonas ms pequeas, menos ntidas
o ninguna zona lo que podra resultar en un falso informe de resistencia. Para evaluar el medio se utiliza
la cepa Enterococcus faecalis ATCC 33186 con discos de trimetoprim/sulfametoxazole y debe dar una
lectura de 20mm.
-Espesor.- debe ser de 4mm es decir se debe colocar una cantidad de medio entre 25 a 30ml en
placas de 85-100mm de dimetro interno. Cuando existe un espesor mayor a 4mm, se genera un dimetro
de halo de inhibicin menor (falsa resistencia), mientras que un espesor menor a 4mm se genera un
dimetro de halo de inhibicin mayor (falsa sensibilidad).
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-Humedad.- El medio debe dejarse a temperatura ambiente unas dos horas antes de utilizarlo. Si
existe agua en la superficie del agar, las placas pueden colocarse en el incubador a 35C por 30minutos
con la tapa ligeramente abierta.
-Temperatura de incubacin.-colocar entre un rango de 35 a 37C. Tener en cuenta que ciertas

especies requieren condiciones de anaerobiosis, si fuere el caso deber generar el ambiente anaerbico.
c) Dispensacin de los discos.
Colocar los discos manualmente con pinzas estriles y presionarlos ligeramente sobre la superficie del
agar. No deben situarse discos a menos 15 mm del borde de la placa y han de estar distribuidos de forma
que no se produzca superposicin de los halos de inhibicin (20 mm de borde a borde de cada disco).
Nota: Para placas de 150 mm de dimetro interno no se emplearn ms de 12 discos y para las de 100
mm de dimetro interno no ms de 6 discos.
d) Lectura e interpretacin de resultados.
- Lectura de los halos de inhibicin.
Despus de 18 horas de incubacin leer el dimetro de las zonas con una regla estandarizada. Si el
organismo es un estafilococo o un enterococo debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a
oxacilina y vancomicina.
Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y en los medios que contienen
sangre sobre la superficie del agar.
Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibicin, puede tratarse de mutantes resistentes,
contaminaciones, poblaciones heterogneas o cultivos mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar
otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana.
- Interpretacin de resultados.
La lectura de los resultados se realiza en funcin de las normas CLSI (Clinical and laboratory standars
institute). De esta forma se han fijado 3 categoras: sensible (S), intermedia (I), y resistente (R).
Sensible.- indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que se ha determinado el halo de
inhibicin puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano.
Intermedio.- indica que el halo de inhibicin se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano

alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en las que
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se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (ej. orina) o cuando se emplean dosis ms elevadas
de lo habitual.
Resistente.- se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habituales
alcanzadas en sangre y tejidos del correspondiente antimicrobiano. Tambin se refiere a microorganismos
en los que existe algn mecanismo de resistencia.
Los dimetros de los halos de inhibicin en mm se comparan con datos publicados en tablas en las que se
determinar si el microorganismo es sensible, moderadamente sensible o resistente al antibitico.
NOTAS: Los discos de antibiticos se conservan en refrigeracin o congelacin y deben ser sacados una
hora antes de su uso. Cada disco tiene inscritas las iniciales del antibitico y la concentracin. Se DEBE
copiar esta informacin para luego compararla con la de las tablas de referencia.
Fig 8.1 Antibiograma.
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
Complete la siguiente tabla para el microorganismo con el que realiz el antibiograma:

ANTIBIOTICO CODIGO NOMBRE DEL DIAMETRO DEL SENSIBLE, MODERADAMENTE SENSIBLE
DEL DISCO MICROORGANISMO HALO (mm) O RESISTENTE
1
2
3
4
5
38
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
PRCTICA N 9. Metabolismo microbiano I. Pruebas bioqumicas en bacterias

Gram negativas.
Objetivos:
- Comprender el fundamento de las pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de
bacterias Gram negativas.
- Identificar la cepa asignada por su gnero y especie mediante pruebas bioqumicas.
Da 1:
Se dar a cada grupo dos cepas aisladas en Agar Nutritivo o TSA a las que debe identificar y reportar su
gnero y especie. Para lo cual debe realizar:
a) Tincin Gram.
Referirse a la prctica No. 3
b) Prueba de la Oxidasa
Una vez identificada la bacteria como Gram negativa al ser observada al microscopio, se procede a realizar
la prueba de Oxidasa.
Procedimiento:
-Se coloca un disco de Oxidasa en una caja petri o portaobjetos.
- Se humedece el disco de Oxidasa con UNA gota de agua destilada estril.
- Se toma con un palillo de dientes una colonia del Agar nutritivo o un agar que sea NO selectivo
y se procede a colocar la colonia en el disco de Oxidasa previamente humedecido.
- Al cabo de 10 segundos se cataloga la prueba como positiva o negativa. Recuerde que a
medida que pasa el tiempo toda prueba de Oxidasa tiende a ser positiva.
Prueba positiva (coloracin morada oscura en el disco): bacterias Gram negativas que NO pertenecen a la
familia Enterobacteriaceae.
Prueba negativa (el disco no cambia de coloracin): bacterias Gram negativas que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae.
c) Identificacin de Enterobacterias:
Siembra en un medio selectivo MacConkey.
Las cepas oxidasa negativas se siembran por agotamiento o "estrias" en el medio selectivo MacConkey
que se incuba a 37C por aproximadamente 18 horas.
Pruebas bioqumicas para enterobacterias.
Una batera simple de 6 pruebas bioqumicas permite identificar el gnero y la especie de las cepas
proporcionadas. Estas pruebas son:
39
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
- Simmons Citrato
- TSI
- SIM
- UREA
- Fenilalanina
- LIA
d) Identificacin de Gram negativas no enterobacterias:

Siembra en un medio selectivo.
Las cepas oxidasa positivas se siembran por agotamiento o "estrias" en el medio selectivo agar Cetrimida
para observar la produccin de pigmentos.
Pruebas Bioqumicas NO enterobacterias.
Para bacterias no pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae como son las Pseudomonas spp., se
utilizan nicamente las siguientes pruebas:
- TSI o algn medio para observar fermentacin de carbohidratos, el ms utilizado es el medio OF
- SIM o algn medio para observar movilidad.
E) Incubacin
Despus de sembrar en cada tubo, NO cerrar hermticamente las tapas e incubarlos a 37C por
aproximadamente 18 horas.
Da 2
Al da siguiente se deben observar el crecimiento en las cajas y leer los resultados de las pruebas
bioqumicas. Lo cual significa identificar si ha habido algn cambio de color en los tubos o alguna otra
caracterstica como la formacin de precipitados o la produccin de gas a partir de carbohidratos, etc.
Algunas pruebas como la deteccin de indol en el tubo SIM, requieren de un revelador. En este caso
debe destapar el tubo SIM y colocar dos gotas del reactivo Kovacs indol. Si se forma un anillo rojo la
prueba es positiva y si el anillo queda del color del reactivo, la prueba es negativa.
Resultados para enterobacterias:
Nombre de la bacteria (gnero y especie)
Morfologa y coloracin Gram

Color del medio MacConkey antes y despus de sembrar.
Forma, tamao y color de las colonias en MacConkey
Sustancia Inhibidora del crecimiento en el agar
MacConkey.
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
CEPA PRUEBAS BIOQUIMICAS

Nmero Oxidasa TSI SIM CIT Urea LIA Fenil
H2S I M Pico/Base Gas H2S
Pico/Base Gas H2S
Resultados para no enterobacterias:

Color del medio Cetrimida antes y despus de sembrar.
Forma, tamao y color de las colonias en Cetrimida
Sustancia Inhibidora del crecimiento en agar Cetrimida
CEPA PRUEBAS BIOQUIMICAS

Nmero Oxidasa TSI SIM
H2S I M
Pico/Base Gas H2S
Los resultados se deben comparar con los establecidos en la literatura y consultar el manual de Pruebas
Bioqumicas de Jean F. MacFaddin (2003) y as determinar el microorganismo que le fue asignado.
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
BACILOS O COCOBACILOS
GRAM NEGATIVOS
OXIDASA
NEGATIVO
POSITIVO
Pseudomonas spp. Enterobacterias

Haemophilus spp. E. coli
Eikenella spp. Klebsiella spp.
Pasteurella spp. Proteus spp.
Vibrio spp. Salmonella spp.
Etc Acinetobacter spp.
Enterobacter spp.
Citrobacter spp.
PRUEBAS BIOQUIMICAS Serratia spp.
ESPECFICAS Morganella spp.
"Directamente sin INDOL" Shigella spp.
Providencia spp.
Yersinia spp.
o con INDOL
INDOL
POSITIVO NEGATIVO
POSITIVO NEGATIVO
Enterobacteria Enterobacterias
Haemophilus spp. Pseudomonas spp.
s Klebsiella spp.
Pasteurella spp. Eikenella spp.
E. coli (K. pneumoniae)
Vibrio spp. Etc
Proteus Proteus mirabilis
Etc
vulgaris Salmonella spp.
Acinetobacter Acinetobacter
spp. spp.
Enterobacter spp.
Citrobacter spp.
Serratia spp..
PRUEBAS BIOQUIMICAS
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
PRACTICA N 10. Metabolismo microbiano II y Mecanismos de patogenicidad

microbiana. Cocos Gram positivos del gnero Staphylococcus
Objetivos:
- Comprender el fundamento de las pruebas bioqumicas utilizadas para la identificacin de
bacterias Gram positivas del gnero Staphylococcus.
- Identificar la cepa asignada por su gnero y especie mediante pruebas bioqumicas y
caractersticas de crecimiento en medios slidos.
- Realizar pruebas para determinar la produccin de enzimas vinculadas con la patogenicidad de
microorganismos del gnero Staphylococcus.
Da 1:
Se dar a cada grupo una cepa aislada en Agar Nutritivo a la cual debe identificar y reportar gnero y
especie. Para lo cual debe realizar:
a) Tincin Gram
Referirse a la prctica No. 3
b) Prueba de la Catalasa
Una vez identificada la bacteria como Gram positiva al ser observada al microscopio, se procede a realizar
la prueba de Catalasa.
Procedimiento:
- En una placa portaobjetos, se coloca una gota de agua oxigenada de 30 volmenes.
- Con un palillo se toman colonias del medio Agar Nutritivo y se mezclan con el agua oxigenada.
- El resultado positivo ser evidente a los pocos segundos por el aparecimiento de burbujas.
- Colocar las placas portaobjetos en una solucin desinfectante ya que contienen bacterias
viables.
Una vez realizada la prueba las bacterias pueden ser clasificadas como cocos Gram positivos catalasa
positivo pertenecientes al gnero Staphylococcus spp., y cocos Gram positivos catalasa negativa
pertenecientes a los gneros Streptococcus o Enterococcus spp.
c) Prueba de coagulasa
La prueba de coagulasa se debe realizar a las bacterias catalasa positivas. Esto nos permitir clasificar las
bacterias como Staphylococcus coagulasa positivos (SCP) o Staphylococcus coagulasa negativos (SCN).
Procedimiento de coagulasa en Tubo:
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Versin: 02
MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
- En 0.5ml de plasma citratado se realiza una emulsin densa de colonias con ayuda de un asa
estril.
- Se coloca el tubo a bao mara a 37C durante 2 horas y se revisa cada 30 minutos la formacin
de un cogulo.
- Se considera positiva cuando hay formacin total o parcial de un cogulo.
Una prueba positiva al test en tubo de coagulasa en una prueba confirmatoria de Staphylococcus aureus.
d) Crecimiento del gnero Staphylococcus en medio Manitol Salado.

Se procede a sembrar las bacterias por estriacin en el medio Manitol y se incuba a 37C por
aproximadamente 18 horas.
e) Produccin de hemlisis en Agar Sangre

Algunas cepas de cocos Gram positivos pueden distinguirse inicialmente por el tipo de hemlisis que
producen. As tenemos:
hemolticos: son aquellos que producen una hemlisis total de los glbulos rojos,
observndose como un halo transparente alrededor de las colonias.
hemolticos: son aquellos que producen hemlisis parcial, la cual se observa como un halo con
tonalidad verdosa alrededor de las colonias.
Gamma hemolticos: son aquellos que no producen hemlisis sobre el agar sangre.
Para observar el tipo de hemlisis de los Staphylococcus se procede a sembrar por estriacin en agar
sangre humana. Este agar se prepara colocando a un medio base como por ejemplo TSA una cantidad de
sangre desfibrinada al 5%.
Da 2:
Se leen los resultados del crecimiento en manitol y Agar sangre.
Color del medio manitol antes y despus de

sembrar.
Forma, tamao y color de las colonias en manitol
Sustancia Inhibidora del crecimiento en agar
manitol
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Versin: 02
MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
Prueba Resultado
CATALASA
COAGULASA
Produccin de hemolisinas en agar sangre (describir

las caractersticas de las colonias y el tipo de
hemlisis)
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
Recursos bibliogrficos para la clase.
1. Baron E. et al.A Guide to Utilization of the Microbiology Laboratory for Diagnosis of Infectious
Diseases: 2013 Recommendations by the Infectious Diseases Society of America (IDSA) and the
American Society for Microbiology (ASM), Clinical Infectious Diseases Access published July
10,2013.
2. CDC NIH. Bioseguridad en laboratorios de Microbiologa y Biomedicina. 4ta edicin.
3. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial
disk susceptibility tests. Approved standard M2-A6. Wayne, Pa: National Committee for Clinical
Laboratory Standards; 1997.
4. HarleyPrescott: Laboratory Exercises in Microbiology, Fifth Edition. The McGrawHill
Companies, 2002
5. Merck Microbiology Manual, 12 ed, Germany.
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO
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DE MICROBIOLOGA
GENERAL
Elaborado Revisado Aprobado
Cargo: DOCENTE Cargo: Cargo:
Firma Firma Firma
Nombre y Apellido: Rommy Tern Nombre y Apellido Nombre y Apellido
Fecha: 28/03/2016 Fecha: Fecha:
CONTROL DE CAMBIOS
Revisin N Fecha Razn de la modificacin

Versin 01 Septiembre 2015 Versin Inicial
Versin 02 Marzo 2016 Incorporacin y/o modificacin de prcticas
LISTA DE DISTRIBUCIN
Copia N de Documento Cdigo rea Cargo del

copias responsable
Original 3 Instructivo de prctica IPL-LAB-01 Laboratorio Docentes
impresa de laboratorio Asignatura
Original 3 Instructivo de prctica IPL-LAB-01 Archivo Docente

digital de laboratorio maestro Asignatura
Copia 1 Instructivo de prctica IPL-LAB-01 Laboratorio Ayudante

Controlada de laboratorio
Copia Instructivo de prctica IPL-LAB-01 Laboratorio Estudiantes

Controlada de laboratorio
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

Docentes del rea de formacin bsica.

GENERALIDADES DEL CURSO PRCTICO

Objetivos del curso:

- Adquirir destreza en el manejo de cultivos microbiolgicos.

La nota de laboratorio es sobre 6 ptos distribuidos de la siguiente manera:

* El cuaderno es individual y en este se presentarn los resultados de cada prctica y el cuestionario

Polticas y requerimientos de la clase:

PRACTICA N1: Seguridad en el laboratorio.

PRACTICA N 2: Medios de cultivo microbiolgicos y mtodos de siembra.

Describir los diferentes tipos de medios de cultivo y su utilizacin.

En Microbiologa podemos encontrar varias clasificaciones de los medios de cultivo de acuerdo a lo

Por su composicin qumica.

Medios qumicamente definidos o simples: se preparan aadiendo cantidades conocidas de

Medios semislidos: agar 0,7 %. Se preparan en tubo.

Por su selectividad de crecimiento.

Medios diferenciales: son medios empleados en la identificacin de diferentes grupos de

Si el medio se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:

Preparar 20 cajas de TSA (Tripticasa Soya Agar)

Volumen de medio de cultivo a prepararse = 20 25 ml

Continuando con el ejemplo anterior:

1000 ml de medio 40 g medio slido

Si el medio NO se autoclava el procedimiento que debe seguir es el siguiente:

1. Se determina el volumen de medio de cultivo a preparar y se manda a autoclavar un matraz con

2da parte: METODO DE SIEMBRA POR ESTRIA.

En Microbiologa es una tcnica comn el transferir microorganismos de un cultivo a otro, a esto se

5. Se enciende el mechero o la lmpara de alcohol y se esteriliza el asa de atrs hacia adelante en la

Fig 2.1. Ejemplo de cmo se puede estriar microorganismos en caja.

Fig. 2.2. Ejemplos de las caractersticas de las colonias.

Utilidad del medio

Color del medio antes del cultivo

Color del medio despus del cultivo

Microorganismo que fue sembrado por estriacin

Crecimiento (si o no)

Colonias aisladas (si o no)

Color de las colonias aisladas

Tamao de las colonias aisladas

Forma de las colonias aisladas

Elevacin de las colonias aisladas

Borde de las colonias aisladas

PRACTICA N 3: Tcnicas de tincin simple y diferencial.

Reconocer la diferencia entre una tincin simple y diferencial.

En la tincin diferencial se utiliza ms de un colorante. Un ejemplo de tincin diferencial ampliamente

- Se prepara el frotis (fig 3.1), lo cual comprende las siguientes etapas:

1. Una vez preparado el frotis se procede a realizar la coloracin.

1. Una vez preparado el frotis, se procede a su coloracin.

8. Se lava con agua.

Tincin simple OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Morfologa: (Cocos o Bacilos)

Nombre del microorganismo:

Morfologa: (Cocos o Bacilos)

Fig 3.1. Preparacin de un frotis bacteriano a partir de un medio slido y lquido.

PRACTICA N 4: Tincin de estructuras microbianas: endoesporas y cpsulas

Seleccionar el tipo de tincin dependiendo de la estructura que se desea observar.

- Tincin de endosporas (Mtodo de Schaeffer-Fulton)

1. Se prepara el frotis (referirse a la prctica 3)*.

1. En el extremo de la placa portaobjetos se mezcla una pequea asada del cultivo de

Tincin para endosporas OBSERVACION AL MICROSCOPIO.

Morfologa: (Cocos o Bacilos)

Morfologa: (Cocos o Bacilos)

PRACTICA N 5: Movilidad bacteriana.

Distinguir entre el movimiento bacteriano y el movimiento browniano al observar al microscopio

- polar: uno solo flagelo en un extremo del cuerpo celular.