Fundamento de las pruebas bioqumicas

Mac Conkey Agar metabolizados, caractersticas que son

utilizadas para la diferenciacin de estas,
Este medio se utiliza para el principalmente para las enteras bacterias.
aislamiento de bacilos Gram negativos
de fcil desarrollo, aerobios y Este medio contiene lactosa con una
anaerobios facultativos. Permite concentracin de 1% y glucosa 0,1%, lo cual
diferenciar bacterias que utilizan o no, permite la observacin de la fermentacin
lactosa en muestras clnicas, de agua de uno o de ambos carbohidratos por parte
y alimentos. Todas las especies de la familia de las bacterias, adems de la produccin
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo de gas y de cido sulfhdrico.

En el medio de cultivo, las peptonas, La fermentacin es un proceso que se lleva

aportan los nutrientes necesarios para a cabo en condiciones aerbicas (pico de
el desarrollo bacteriano, la lactosa es el flauta) y anaerbicamente (capa inferior).en
hidrato de carbono fermentable, y la mezcla el pico de flauta la glucosa (monosacrido)
de sales biliares y el cristal es catabolizada inicialmente por medio del
violeta son los agentes selectivos ciclo anaerbico de Embden-Meyerhof,
que inhiben el utilizando tanto por los aerobios como por
desarrollo de gran parte de la flora Gram los anaerobios para dar acido pirvico y
posteriormente este ser degradado a
Positiva. Por fermentacin de la lactosa, travs del ciclo de Krebs para dar CO2, H2O
disminuye el pH alrededor de la colonia. y energa.

Por otra parte la lactosa (disacrido) ser

Esto produce un viraje del color del primero degradada a sus monosacridos
indicador de pH (rojo neutro), la absorcin correspondientes (glucosa y galactosa).
en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares
Los microorganismos no fermentadores de Este medio contiene una cantidad pequea
lactosa producen colonias incoloras. de glucosa y una concentracin 10 veces
mayor de lactosa. Las enteras bacterias y
Composicin:
los fermentadores de glucosa comienzan
Digerido pancretico de gelatina 17,0 g metabolizando este azcar, ya que las
Digerido pancretico de casena 1,5 g enzimas que utilizan la glucosa estn
Digerido pptico de tejido animal 1,5 g presentes como constituyentes de las
Lactosa 10,0 g Mezcla de sales biliares 1,5 g bacterias y estas pueden obtener mayor
Cloruro de sodio 5,0 g Agar 13,5 g Rojo energa por utilizacin del azcar ms
neutro 30,0 mg Cristal violeta 1,0 mg Agua simple.
destilada 1.000 mL
Todos los carbohidratos deben ser
PH final 7,1 0,2 convertidos en glucosa para entrar en el
ciclo de Embden-meyerhof. La estra, donde
Agar triple azcar hierro: TSI el oxgeno presente acta como aceptor
terminal de electrones y en la parte terminal
Determina la capacidad de un de la columna en condiciones de
microorganismo de atacar un hidrato de anaerobiosis. Una vez que una bacteria
carbono especifico incorporando en un fermentadora de glucosa ha reducido toda
medio de crecimiento bsico, con la glucosa disponible a piruvato,comenzara
produccin o no de gases, junto con la a metabolizar el piruvato a travs del ciclo
determinacin de posible cido sulfhdrico. aerbico de Krebs (sobre la estra),formando
Agar AHK es un medio diferencial que productos finales cidos .el cido en el
determina tanto la fermentacin de los medio hace virar el amarillo del indicador de
hidratos de carbono y la produccin de pH ,rojo fenol .entonces, luego de 6 horas de
cido sulfhdrico. Las bacterias pueden incubacin ,la zona de la estra y el fondo
utilizar cualquiera de los sustratos permanecer rojo (indicando que no hay
incorporados en el medio y ser variacin del pH ) o se alcalinizara
(visualizando el color rojo ms intenso que
el original ),demostrando que la bacteria no
es miembro de la familia
enterobacteriaceae.
Despus de haber agotado la cantidad
limitada de glucosa, una bacteria con
capacidad para utilizar la lactosa o sacarosa
comenzara a degradarlas. Como el medio
contiene 10 veces ms lactosa que glucosa,
las bacterias encontraran sustrato suficiente
para continuar la formacin de productos
finales cidos .Luego 18-24 horas de
incubacin todo el medio TSI permanecer
de color amarillo. Esta reaccin se denomina
acido sobre acido (A/A) y el organismo se
identifica como un fermentador de lactosa.
La produccin de gas provocara la ruptura
de la columna de agar o la empujara hacia
la parte superior, de modo que un
fermentador de lactosa que produce gas
dar una reaccin A/A ms gas.
Si el organismo en estudio no es capaz de
usar la lactosa del medio, debe producir
energa en forma menos eficiente al utilizar
las protenas y aminocidos del medio como
fuentes nutritivas.
El metabolismo proteico se produce en la
superficie de la zona inclinada donde el
oxgeno es abundante. Los productos de la
degradacin de la peptona (como el
amoniaco) son alcalinos y provocan el viraje
del indicador rojo de fenol a su color rojo
original. Un TSI inoculado con una bacteria
que no fermenta la lactosa al Cabo de 18-24
horas de incubacin presentara la zona
inclinada roja y el fondo del agar
permanecer amarillo debido al
metabolismo anaerbico de la glucosa
durante la primera etapa. Esta reaccin se
denomina alcalina sobre acido (k/a)
Las bacterias que fermentan la glucosa
tambin pueden formar productos alcalinos
a partir de la utilizacin de la peptona, sobre
la zona inclinada. Estas reacciones sern
K/K.
Condiciones de incubacin
Tiempo 18-24 h temperatura 35-37 C
PH final: 7.3 0,2
Composicin: A)Extracto de carne b)Extracto
de levadura c) Peptona d) Proteasa e)
Lactosa f) Dextrosa g) Sulfato ferroso h)
Cloruro de sodio i) Tiosulfato de sodio j) Agar
k) Agua destilada m) Indicador: Rojo de fenol
-cido: amarillo Alcalino: rojo,
Citrato
Esta prueba sirve para determinar si un
organismo es capaz de utilizar citrato como
nica fuente de carbono y compuestos
amoniacales como nica fuente de
nitrgeno en su metabolismo, provocando
una alcalinizacin del medio. Entre las
enteras bacterias estas caractersticas se
dan en los siguientes gneros:
Enterobacter, Klebsiella, Serratia,
Citrobacter y algunas especies de
Salmonella. Sin
embargo, Escherichia,Shigella,Salmonella
typhi
Y Salmonella paratyphi son incapaces de
crecer con esos nutrientes. Se cultiva el
microorganismo en agar citrato de
Simmons. Este medio contiene citrato de
sodio y fosfato de amonio como fuentes de
carbono y de nitrgeno respectivamente y
azul de bromo timol como indicador de pH.
Slo las bacterias capaces de metabolizar el
citrato podrn multiplicarse en este medio y
liberarn iones amonio lo que, junto con la
eliminacin del citrato (cido), generar una
fuerte basificacin del medio que ser
aparente por un cambio de color del
indicador de pH, de verde a azul.
Composicin: a) Sulfato de magnesio b)
Mono fosfato de amonio c) Fosfato di
potsico d) Citrato de sodio e) Cloruro de
sodio f) Agar g) Agua destilada h) Indicador
de pH: Azul de bromo timol (pH= 6) Alcalino:
color azul de Prusia intenso (pH = 7.6)
Medio no inoculado: Color verde (pH = 6.9)
Rojo de metilo y Voges-Proskauer
Estas dos pruebas forman parte del IMVIC
de las colimetras y permiten la
diferenciacin dentro de las enteras
bacterias del grupo coli y aergenes. Las
entero bacterias son anaerobios facultativos
que utilizarn la glucosa en dos fases:
primero la metabolizarn aerobiamente
(respiracin oxibintica) consumiendo
rpidamente el oxgeno del medio, para, en
segundo lugar, continuar metabolizndola
por va anaerobia (fermentacin). sta
puede ser de dos tipos:
Fermentacin cido mixta:
La realizan las bacterias del grupo de E.coli
y los productos finales son cidos orgnicos
(cidos frmico, actico, lctico y succnico) que
provocan un fuerte descenso del pH inicial del
medio. Puede detectarse por el viraje del indicador
de rojo de metilo que permanece amarillo por
encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.
Fermentacin butiln gliclica:
La realizan las bacterias del grupo
Klebsiella-Enterobacter
(Antiguo aergenes). Los productos finales
son compuestos neutros como el butanodiol y el
etanol, producindose acetona como intermediario
que podr ser detectada aadiendo al medio KOH
(reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol
(reactivo Bde Voges-Proskauer) que
reaccionarn con este
compuesto produciendo un color rojo
caracterstico
Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el
microorganismo en caldo RMVP (medio de Clark
y Lubs) y se incuba a 30C durante un
periodo de 3 das como mnimo y 5
como mximo. Al revelar las pruebas, se
separa el cultivo en dos porciones de unos
2,5ml que servirn para cada uno de los
ensayos.
Rojo de Metilo:
A uno de los tubos se le aade unas gotas
(4-5) de solucin indicadora de Rojo de
Metilo. Se agita para homogeneizar y se
observa la coloracin. Se considera positiva
si vira al rojo y negativa si permanece
amarillo.
Voges-Proskauer:
A la otra porcin de cultivo se le aade:
0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer
(alfa-naftol5% en etlico absoluto). El medio
adquiere un aspecto lechoso. O 0,2ml del
Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH40%).
Desaparece el aspecto lechoso y se agita
fuertemente. Si la prueba es positiva, antes de cinco
minutos aparece un color rosado-violceo, ms o
menos intenso, que se inicia en la parte superior del
tubo. Si la prueba es negativa no aparece coloracin
alguna.
Composicin
Poli peptona 7,0 g Glucosa 5,0 g Fosfato di
potsico 5,0 g Agua destilada
PH 6,9
Urea
Composicin: a) Peptona b) Cloruro de sodio
c) Fosfato mono potsico c) Glucosa d) Urea
e) Agar f) Agua destilada g) Indicador de pH:
Rojo de fenol -cido: Amarillo (pH = 6.8)
-Alcalino : Rojo rosado (pH = 8.4) !"Medio no
inoculado: Amarillo (pH = 6.8)
Determina la capacidad de un organismo de
desdoblar la urea formando dos molculas
de amoniaco por accin del enzima ureasa.
Esta actividad enzimtica es caracterstica
de todas las especies de Proteus y se usa
sobre todo para diferenciar este gnero
de otras enterobacterias que dan negativo
o positivo retardado. Se cultiva el
microorganismo en slant en agar urea de
Christensen. Este medio se complementa
despus del auto clavado con 50ml/l de
urea. sta ser degradada por aquellos
microorganismos capaces de producir el
enzima ureasa. Esta degradacin produce
amoniaco que har variar el color del
indicador de amarillo a rojo, ponindose as
de manifiesto la actividad ureasa. Para
revelar el resultado de esta prueba es
importante tener en cuenta el tiempo de
incubacin ya que especies de Proteus
vuelven alcalino el medio poco despus de
la inoculacin y sus resultados deben ser
ledos en las primeras 2-6 horas, mientras
que Citrobacter freundii
y Klebsiella pneumoniae tienen actividad
ureasa dentro de las 24-48 horas de
incubacin.
Prueba de sulfuro indol movilidad (SIM)
Composicin:-extracto de carne,-peptona,-
hierro peptonizado (indicador de SH 2),-
tiosulfato de sodio (indicador de SH 2),-agar,-
agua destilada,-pH 7,3
Determinar si un microrganismo es mvil o
inmvil ,si es capaz de liberar cido
sulfhdrico por accin enzimtica de los
aminocidos que contienen azufre
produciendo una reaccin visible de color
negro y por ltimo la capacidad de
desdoblar el indol de la molcula triptfano,
adems que la consistencia del medio
permite la observacin de la movilidad de
algunas bacterias.
a. Produccin de cido sulfhdrico
b) produccin de indol
c) movilidad
a) prueba de cido sulfhdrico
La protelisis de las protenas en
aminocidos (aa) individuales, algunas
especies bacterianas son capaces de liberar
azufre enzimticamente de los diferentes
aa. Que las contienen, produciendo el gas
acido sulfhdrico. La peptona, cistena y
tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero La formacin de indol se produce solamente
las diferentes especies utilizan distintos en aquellos organismos capaces de
compuestos o aa, que contienen azufre para fermentar los hidratos de carbono. La
producir SH2.la enzima responsable de esta elevada acidez producida por la
actividad es la cisteinasa. fermentacin de la glucosa puede impedir el
crecimiento del organismo o inhibir la
1 etapa: la bacteria con el tiosulfato de enzima.
sodio por medio de una reaccin de
reduccin que da un sulfito y un sulfato. El agregado de triptfano estimula la
Este es un proceso de respiracin produccin de indol mientras que la glucosa
anaerbica donde el tomo de azufre sirve la inhibe
como aceptor de electrones para la
oxidacin de los sustratos organicos. el
tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor
de electrones y es una fuente de azufre para
el organismo.

2. etapa

El gas incoloro SH2 reacciona con una sal

pesada, citrato frrico de amonio para
producir un precipitado negro insoluble,
sulfuro ferroso.
Bacteria (medio acido) + tiosulfato de sodio
= gas SH2
SH2 + iones frricos = sulfuro ferroso (pp.
Negro)
b) prueba de la produccin de indol
El triptfano es un aminocido que puede
ser oxidado por ciertas bacterias para
formar tres metabolitos principales: indol,
escatol e indolacetico.diversas enzimas
intracelulares que intervienen en este
proceso reciben el nombre de triptofanasa,
lo que implica el sistema completo de
enzimas vinculadas con la produccin del
indol. El principal intermediario en la
degradacin del triptfano es el cido indol
pirvico.
c) movilidad: determina si un organismo es
mvil o inmvil. Las bacterias tienen
movilidad por medio de sus flagelos, que se
encuentran principalmente entre los bacilos,
sin embargo algunas formas de cocos son
inmviles.
Las bacterias mviles pueden contener un
solo flagelo o muchos, adems su
localizacin varia con su especie bacteriana
y las condiciones de cultivo. A veces las
bacterias con movilidad producen variantes
no mviles que parecen ser estables y
raramente se revierten en formas mviles.
Condiciones de incubacin
Tiempo: 24-48 h temperatura: 35-37C
Resultados

La degradacin del triptfano libera indol, Pruebas bioqumicas

acido pirvico, amoniaco y energa. El cido
pirvico puede ser nuevamente
metabolizado por medio del ciclo glucolitico
o entrar en el ciclo de Krebs para liberar
CO2 y H2O y una gran produccin de
energa. El NH3 puede ser utilizado para
sintetizar nuevos aminocidos empleando la
energa que se encuentra para la reaccin
anablica.

La prueba indol se bas en la formacin de

un complejo de color rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehdo de p-
dimetilaminobenzaldehido (sustancia activa
del reactivo de kovacs).
Pruebas Resultados tericos Resultados prcticos
bioqumicas

TSI Pico de flauta alcalino / profundidad cida

(negra) (K/A/H2S). Glucosa fermentada,
lactosa no fermentada; produccin de H2S. pico de flauta
Caracterstico de bacterias no fermentadoras acido/profundidad acida
de lactosa y productoras de H2S se produjo el gas y se
fermento glucosa y
lactosa

citrato Crecimiento aunque no exista cambio de

color. Crecimiento y el medio de color azul
intenso en pico de flauta.

Si se utiliza carbono a partir de citrato de

sodio, tambin se extrae nitrgeno del fosfato
de amonio contenido en el medio, liberndose
amoniaco. En ocasiones se detecta un
crecimiento visible a lo largo de la lnea de
siembra antes de la aparicin de color. Este
crecimiento visible tambin indica resultado
positivo.

Los resultados de esta prueba son

parciales por que se tomaron al siguiente
da
La prueba dio negativo no se present
cambio del color.
urea Si no hay hidrlisis el medio permanece con el color La prueba dio negativo por
que no se presento un
original (amarillo) y se observa crecimiento
cambio de color solo
creimiento

sim Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se

extiende ms all de la lnea de siembra.
se produjo crecimiento
movilidad en el medio pero no
y
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de
color. presento cambios ms notorios
Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Rojo de Positiva: Rojo en la superficie del medio (pH =

4.4) Algunas bacterias pueden producir
la prueba dio negativo
cambio de color
no presento

metilo menores cantidades de cido a partir del

sustrato por ello es posible que aparezca un
color naranja. Esto indica una prueba positiva.
Negativo: Amarillo (pH = 6) o naranja

Voges La aparicin de un color rosado constituye

una reaccin positiva indicadora de la
la prueba dio negativo
por ausencia de color rojo
proscav presencia de acetona, producto de la
fermentacin de la glucosa.
er Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos
minutos despus de una completa agitacin
del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.