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Metodologa microbiolgica para deteccin, aislamiento y

caracterizacin de STEC en alimentos

Luca Galli
lgalli@fcv.unlp.edu.ar
Instituto de Gentica Veterinaria "Ing. Fernando Noel Dulout, CONICET, FCV-UNLP
I CURSO Sndrome Urmico Hemoltico 25-06-2014
 No-O157 O157

no-O157
eae -
no-O157 O157:H7/NM
eae +
 CAA
C 4032

C III: A 156 tris comidas preparadas listas consumo

C VI: A 255 - carne picada fresca
A 286 bis - salazones O157:H7/NM
A 302 - chacinados frescos-secos-cocidos
C XI: A 925 quarter - frutas y hortalizas frescas
y mnimamente procesadas

USA USA EU
Carnes Otros Mtodo
y derivados alimentos horizontal
 O157:H7 O157:H7
MLG 5.06 BAM 4A
Carne (raw ground beef, & mixed
with other meat, cooked meat Vegetales hoja
patties, fermented sausage products,
beef trim, trim components) Leche/jugos/agua botella
Ambientales - esponjados Otros alimentos STEC
ISO/TS 13136
no-O157 15/11/2013
Mtodo horizontal
MLG 5B.05
29/06/2014
no-O157 Alimentos y piensos
Carne (raw beef, raw beef mixes BAM 4A
pork-poultry, Beef trim, trim
components) 07/2013
OBLIGATORIO
Carcasas esponjados
Ambientales - esponjados
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DETECCION, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

Muestra

Caldo
Enriquecimiento

Tamizaje Aislamiento

Resultado Resultado
Confirmacin
Negativo Positivo

Caracterizacin

Subtipificacin
(LNR)
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DETECCION, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

Muestra

Caldo
Enriquecimiento

Tamizaje Aislamiento

Resultado Resultado
Confirmacin
Negativo Positivo

Caracterizacin

Subtipificacin
(LNR)
 Flujograma Deteccin
no
O157:H7 Xg X g o x mL
O157:H7

x mL TSBm 9 x mL TSBm + N(16 mg/L)/A(12 mg/L)

x mL TSBm
+ N(20 mg/L) BPW

Enriquecimiento Enriquecimiento 15- Enriquecimiento

15-22 h a 42C 22 h a 42C 18-24 h a 37C

TAMIZAJE TAMIZAJE TAMIZAJE RT-

IC/ELISA/ELFA RT-PCR BAX STEC PCR stx/eae
PCR BAX O157 stx/eae

Resultado Resultado positivo Resultado Resultado positivo Resultado positivo Resultado

Resultado negativo stx+eae stx negativo stx
positivo stx+eae negativo

Panel 1 y 2 Panel 1 y 2
O26, O45, O103, O26, O103, O111,
O111, O121, O145 O145, O157

Informar
Aislar Informar Negativo Aislar Informar Negativo Aislar Aislar
Negativo
 Flujograma Deteccin
no
O157:H7 Xg X g o x mL
O157:H7

x mL TSBm 9 x mL TSBm + N(16 mg/L)/A(12 mg/L)

x mL TSBm
+ N(20 mg/L) BPW

Enriquecimiento Enriquecimiento 15- Enriquecimiento

15-22 h a 42C 22 h a 42C 18-24 h a 37C

TAMIZAJE TAMIZAJE TAMIZAJE

IC/ELISA/ELFA RT-PCR BAX STEC
PCR BAX O157 stx/eae
RT-PCR stx/eae

Resultado Resultado positivo Resultado Resultado Resultado Resultado

Resultado negativo positivo stx+eae positivo stx negativo stx
positivo stx+eae negativo

Panel 1 y 2 Panel 1 y 2
O26, O45, O103, O26, O103,
O111, O121, O145 O111, O145

Informar
Aislar Informar Negativo Aislar Informar Negativo Aislar Aislar
Negativo
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PROCEDIMIENTO DETECCION

TAMIZAJE
Caractersticas de una tcnica ideal:

Factible: rpida/bajo costo/fcil aplicar

Reproducible

Validada
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Mtodos de TAMIZAJE

INMUNOLOGICOS

MOLECULARES
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Mtodos TAMIZAJE
Inmunolgicos

Mtodos Inmunolgicos para detectar patgenos o sus toxinas

Son pruebas analticas que utilizan Ac para detectar estos Ag

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PROCEDIMIENTO DETECCION

Mtodos Inmunolgicos

Segn su origen los anticuerpos se clasifican en:

POLICLONALES MONOCLONALES RECOMBINANTES

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PROCEDIMIENTO DETECCION

Mtodos Inmunolgicos
Las tcnicas utilizadas con mayor frecuencia en microbiologa de alimentos son:

Aglutinacin

Precipitacin

Fluorescencia

Enzimo-inmunoensayo
Mtodos Inmunolgicos

Factible
Caractersticas Rapidez
ideales de una Bajo costo
tcnica de ensayo
Fcil de aplicar
Reproducible
Vlida.
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje-inmunocromatografa O157

Poner la muestra Aadir medio de Transferir 1 mL Colocar la tira Despus de 10

en una bolsa enriquecimiento caldo a un tubo del test minutos, retirar la
incubar tira y leer el
resultado
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje-ELISA O157
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje- ELFA O157

E NZYME
L INKED
F LUORESCENT
A SSAY
Pared
del cono Sustrato = 4-Methyl Umbelliferyl Phosphate (4-MUP)

= 4-Metil-umbeliferona
Ac Conjugado = Fosfatasa alcalina unida al Ac
ligado
Ag = LPS de O157
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje- ELFA O157

Ciclos de aspiracin y expulsin

cartucho

E E E

Molcula E E E

a detectar

Muestra Lavado CONJUGADO SUSTRATO

BUFFER
Reaccin INMUNOLOGICA Reaccin ENZIMATICA
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje- ELFA VIDAS UP O157

Pared Sustrato = 4-Methyl Umbelliferyl Phosphate (4-MUP)
del cono

= 4-Metil-umbeliferona

Proteinas Conjugado = Fosfatasa

recombinantes alcalina unida al Ac
de fagos para
O157
Ag = LPS de O157
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Mtodos TAMIZAJE
Moleculares

Mtodos Moleculares para detectar patgenos

-factores de virulencia-

Son pruebas que se basan en la deteccin de material gentico.

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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje- MDS O157

Sistema 3Mde Deteccin Molecular
Metodologa alternativa a PCR
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Sistema 3Mde Deteccin Molecular MDS

Amplificacin Deteccin por

Isotrmica + Bioluminiscencia
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Cmo funciona? Amplificacin Isotrmica de ADN

Mltiples iniciadores reconocen diferentes regiones del genoma
Una ADN polimerasa con desplazamiento de cadena
Amplificacin eficiente, rpida y continua del ADN objetivo

Deteccin por Bioluminiscencia

Generacin exponencial de pirofosfato como subproducto de la
amplificacin de ADN
Conversin de Pirofosfato en Adenosine Tri Phosphate (ATP)
Luciferasa termoestable que utiliza ATP para generar luz
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Deteccin por Bioluminiscencia

Produce seales de incremento y decrecimiento rpido de luz nicamente
cuando se amplifica la secuencia objetivo.

Amplificacin Exponencial
del ADN molde

Cada de
Bioluminiscencia
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Los resultados aparecen en tiempo real

Las muestras positivas se identificaran durante la ejecucin
Las muestras negativas se identificaran al final de la corrida
Todos los pocillos se pueden visualizar en el grfico
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PROCEDIMIENTO DETECCION
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje- PCR (O157 y no-O157)

Buffer
Cebadores
Polimerasa
Mg++
dNTPs
Agua destilada

Producto de
ADN blanco
amplificacin
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Desnaturalizacin

Apareamiento
Extensin
Desnaturalizacin

95C
72C
60C Extensin
extensin
Apareamiento
apareamiento

Ciclos de PCR
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PROCEDIMIENTO DETECCION
Concentracin de ADN blanco

Nmero de ciclos
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PROCEDIMIENTO DETECCION
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PROCEDIMIENTO DETECCION

PCR MK para la deteccin de los genes stx1 y stx2

105 104 103 102 101

1000 pb

300 pb
200 pb

100 pb

1 2 3 4 5 (+) (-) cs M
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PROCEDIMIENTO DETECCION

PCR Convencional: ventajas

Excelente sensibilidad y especificidad
Bajo costo por muestra
Deteccin de numerosas especies bacterianas con el mismo equipo
Identificacin de diferentes factores de virulencia
Subtipificacin de los aislamientos
D
E Condiciones edilicias adecuadas
S
V
E
Personal capacitado
N
T Equipamiento especfico
A
J Utilizacin de reactivos cancergenos
A
S
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje- PCR Tiempo Real (O157 y no-O157)

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PROCEDIMIENTO DETECCION

PCR tiempo real: ventajas

Excelente sensibilidad y especificidad
Automatizacin
menor tiempo de anlisis
menor riesgo de contaminacin con sust. cancergenas
menor riesgo de contaminacin con ADN amplificado
cuantificacin
D
E Equipamiento especfico
S
V
E
Alto costo por muestra
N
T Carencia de equipos comerciales para
A algunos patgenos
J
A
S
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Buffer
Cebadores
Polimerasa
Mg++
dNTPs
Agua destilada
sonda o intercalante

Producto de
ADN blanco
amplificacin
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Principales tecnologas de PCR en tiempo real

Inespecficas
Intercalantes

Especficas
Sondas TaqMan
Sondas FRET
Sondas Scorpion
Sondas Molecular Beacons
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Agentes intercalantes
Fluorgeno ADN
intercalante

PCR
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Agentes intercalantes - Resultados

Tm
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Sondas de hidrlisis TaqMan

taq
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Sondas de hidrlisis TaqMan - resultados

Muestra

Ctrol +

CT
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje - BAX

Sistema de PCR automatizado / cerrado

Extraccin de ADN

10 min
95C
20 min
37C
Programacin del equipo
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PROCEDIMIENTO DETECCION

MEZCLA DE REACCION

Buffer
Cebadores
Polimerasa
Mg++
dNTPs
Agua destilada
sonda o intercalante

Producto de
ADN blanco
amplificacin
Mezcla de reaccin rehidratada con muestra
Mezcla de reaccin rehidratada con muestra
Ciclador trmico
Anlisis e interpretacin de resultados
Anlisis e interpretacin de resultados
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PROCEDIMIENTO DETECCION

Tamizaje Gene Disc (PALL) EU

Sistema de PCR automatizado / cerrado

Extraccin de ADN
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PROCEDIMIENTO DETECCION

MEZCLA DE REACCION

Buffer
Reduce N falsos +
Cebadores (STEC no patognicos)
Polimerasa
stx + eae variantes
Mg++
dNTPs
Agua destilada
sonda o intercalante

Producto de
ADN blanco
amplificacin
Ciclador trmico
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DETECCION, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

Muestra

Caldo
Enriquecimiento

Tamizaje Aislamiento

Resultado Resultado
Confirmacin
Negativo Positivo

Caracterizacin

Subtipificacin
(LNR)
Flujograma Aislamiento y confirmacin

Aislamiento Aislamiento

stx + eae
O26, O103, O111, stx
stx + eae
O145, O157
O157 O26, O45, O103,
O111, O121, O145
Del caldo
enriquecimiento
SIM
Del caldo Del caldo
enriquecimiento enriquecimiento
SIM SIM Sembrar caldo de
Medios S y D enriquecimiento
en medios S y D

Medios RBA Medio RBAm Picar 50 colonias Picar 50 colonias

morfologa E. coli morfologa E. coli

Chequear colonias
tpicas por Chequear colonias Armar pooles Armar pooles
aglutinacin ltex tpicas por
O157 aglutinacin ltex

PCR stx + eae PCR stx

Re-aislar colonias Re-aislar colonias
ltex + en AN ltex + en AN
Identificar colonia Identificar colonia
stx + eae + stx +
PCR PCR stx + eae +
rfbO157 + stx + eae serogrupos Chequear
serogrupo Confirmar
PCR o Ag

Caracterizar Caracterizar Caracterizar Caracterizar

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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

SEPARACION INMUNOMAGNETICA SIM

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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

SIM Automatizada VIDAS ICE (BioMrieux)

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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

SIM Automatizada Sistema de columnas octoMACS

(Miltenyi Biotec)
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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

Medios de cultivo
Componentes bsicos Componentes selectivos
peptonas / minerales
vitaminas sales
extracto de carne extracto de antibiticos
levaduras antifngicos
agar pH

Componentes diferenciales
carbohidratos + indicador
aminocidos + indicador
sustrato fluorognico + enzima bacteriana
sustrato cromognico + enzima bacteriana
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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO
Peptona
Pluripeptona
Mezcla de sales biliares
Cristal violeta
Cloruro de sodio
Agar

Lactosa
Rojo neutro

Fermentacin MO
Lactosa Productos cidos

Rojo Neutro ROJO

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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

Sustrato cromognico:
5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-glucurnido

Enzima: b-glucuronidasa
Escherichia coli

El medio tambin contiene

sales biliares que inhiben a
la flora gram positiva
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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

RAINBOW Agar O157

Peptona
Extracto de levadura
Sales
Mezcla cromognica
Agar

Sustrato: cromgeno Sustrato: cromgeno

Enzima: -D -galactosidasa Enzima: -D-glucuronidasa
Color negro-gris Color rojo-violeta-azul
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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

ChromIDTM O157:H7

Peptona
Extracto de levadura
Sales
Mezcla cromognica
Agar

E. coli O157
Color verde-azuladas/turquesas
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PROCEDIMIENTO AISLAMIENTO

CHROMagarTM STEC
Peptona
Extracto de levadura
Sales
Mezcla cromognica
Agar
Serotipos STEC ms comunes
malva
Otras enterobacterias
incoloras, azules, inhibidas
Gram positivas: inhibidas
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DETECCION, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

Muestra

Caldo
Enriquecimiento

Tamizaje Aislamiento

Resultado Resultado
Confirmacin
Negativo Positivo

Caracterizacin

Subtipificacin
(LNR)
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PROCEDIMIENTO
CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Fenotpica
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Identificacin bioqumica tradicional IMVIC

SIM
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Identificacin bioqumica tradicional IMVIC
Rojo Metilo Voges Prokauer
20h 24h 48h 20h 24h

Glucosa....cido........cidocido Glucosa....cido........acetona

Rojo de KOH
Metilo Alfa-
naftol
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Identificacin bioqumica tradicional IMVIC

Citrato
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Identificacin bioqumica tradicional

Azcares
Dulcitol
Sorbitol
Sacarosa
Lactosa
Daniel Fung
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Identificacin bioqumica mtodos rpidos
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Identificacin bioqumica mtodos rpidos
VITEK (BioMrieux)
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Serotipificacin

Aglutinacin con partculas de ltex

y/o antisueros

NEGATIVO

POSITIVO
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
Produccin fenotpica de toxina Shiga

Rpido

Tradicional
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CONFIRMACION / CARACTERIZACION
genotpica

PCR mltiple para la deteccin de

los genes stx1, stx2 y rfbO157
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DETECCION, AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION

Muestra

Caldo
Enriquecimiento

Tamizaje Aislamiento

Resultado Resultado
Confirmacin
Negativo Positivo

Caracterizacin

Subtipificacin
(LNR)
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION

La subtipificacin bacteriana tiene por objeto

la diferenciacin de aislamientos
de una misma especie
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION

Fenotpicos
Estudio de las protenas involucradas
en la fisiologa de los microorganismos

Genotpicos

Estudio de los cidos nucleicos

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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Mtodos fenotpicos
Biotipificacin

Serotipificacin

Fagotipificacin

Perfil de susceptibilidad a los antimicrobianos

Perfil proteico

MLEE
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Mtodos genotpicos
Perfiles plasmdicos

Mtodos basados en PCR: RAPD / REP / ERIC

Mtodos basados en restriccin enzimtica:

REA / PFGE

Mtodos combinados: PCR-RFLP / RP

AFLP / MLST / MLVA
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
ERIC-PCR
C B D A E A F
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Electroforesis en gel de campos pulsados PFGE
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Electroforesis en gel de campos pulsados PFGE
A +60 A -60

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Electroforesis en gel de campos pulsados PFGE

Electroforesis
convencional

Electroforesis en
campo pulsado
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Electroforesis en gel de campos pulsados PFGE
Suspensin bacteriana
Mezcla con agarosa
Molde de plug

Lisis Qumica

ADN: plugs de agarosa

Restriccin enzimtica
PFGE
Sistema CHEF

Anlisis de Datos (BioNumerics)

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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE - suspensin bacteriana
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE armado de plugs
Molde LLenado
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE lisis qumica

Proteinasa K
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE - lavados
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE corte plug
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE - digestin enzimtica del cromosoma

EZ depende
org
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE armado del gel
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE armado del gel
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE corrida

Estandarizada
cada org
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE lectura
 Centro Buenos Aires para la Capacitacin
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Centro colaborador de la OIE

PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
PFGE STEC

1300 kb

50 kb

M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 M 9 10 11 M
 Centro Buenos Aires para la Capacitacin
de los Servicios Veterinarios

Centro colaborador de la OIE

100
80

90
70
50

60
DendrogramaCluster patron

D=0,98
 Centro Buenos Aires para la Capacitacin
de los Servicios Veterinarios

Centro colaborador de la OIE

PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Riboprinter
Analiza > porcin genoma bacteriano: 16S, 5S, 23S, regiones
espaciadoras, genes flanqueantes.

Combina AUTOMATIZACION con el poder de las tcnicas

moleculares.

Simplifica entrenamiento personal

Minimiza los errores debido a la tcnica

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Centro colaborador de la OIE

PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Riboprinter

Componentes del sistema:

Unidad caracterizacin
Computadora
Software
Impresora
Bloque trmico
Soporte preparacin muestra
Mezclador de mano
 Preparar Restriccin
Muestra EZ

Captura
Electroforesis
luz emitida
Gel

Transferencia
Sistema lo Hibridacin sondas ADN
transforma React quimioluminiscente
Patrn bandas
Patrn compara
Base datos y genera
nuevos datos
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PROCEDIMIENTO SUBTIPIFICACION
Riboprinter

Caracterizar aislamientos ambientales, patgenos, MO

deterioro alimentos, cepas control, MO benficos
Corridas 8 hs
8 muestras por corrida
Nuevas corridas cada 2-3 hs
Reactivos estandarizados o encargues a medida
Ppal. til industrias alimentos y farmacuticas
Base datos 5700 patrones, 180 gneros, 1200 especies
Cada nueva corrida, nuevo dato generado almacenado
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Resumen

Muestra

Caldo
Enriquecimiento

SIM / SIM-automatizada
Tamizaje Aislamiento
Medios SyD/Cromognicos

Inmunolgicos: IC Bioqcas tradicionales

Confirmacin
ELISA/ELFA Bioqcas miniaturizadas/auto.
automatizados Serotipificacin
Produccin toxina
Moleculares: PCR/ RT-PCR Caracterizacin Factores virulencia genot.
Amplificacin Isotrmica MDS
Subtipificacin Fenotpicos: fagotipo/ATB//
(LNR) MLEE
Genotpicos: PP/RE/PCR
Muchas Gracias