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Produccin de lacasa utilizando Pleurotus ostreatus


sobre cscaras de pltano y bagazo de caa
Katerine Manjarrs*, Adriana Castro**, Eduardo Rodrguez Sandoval***

Resumen Production of locase using


Pleurotus ostreatus on plantain
Introduccin. La cscara de pltano de uso indus- peel and sugar cane bagasse
trial representa del 35% al 40%, del peso total del
fruto, siendo una cantidad considerable de residuos Abstract
que se podran aprovechar para la produccin de
complejos enzimticos. Objetivo. Investigar el poten- Introduction. Plantain peel for industrial purposes
cial que tiene la cscara de pltano (verde y madura) represents from 35% to 40% of the total fruit weight,
variedad Dominico-Hartn como sustrato para la pro- becoming a considerable quantity of waste which
duccin de la enzima extracelular lacasa utilizando el could be used to produce enzymatic complexes. Ob-
hongo Pleurotus ostreatus. Materiales y mtodos. jective. To investigate the potential green and matu-
re plantain peel of Dominico-Hartn as a support-
El hongo Pleurotus ostreatus se cultiv en diferentes
substrate to produce laccase extracellular enzyme
mezclas as: Cscaras de pltano verde (PV), cs- by the use of Pleurotus ostreatus fungus. Materials
caras de pltano maduro (PM), cscaras de pltano and Methods. Pleurotus ostreatus fungus was cul-
verde-bagazo de caa (50/50) (PVB), cscaras de tivated in different mixtures, as follows: Green plan-
pltano maduro-bagazo de caa (50/50) (PMB). Las tain peel (GPP), mature plantain peel (MPP) green
unidades de fermentacin se mantuvieron a un pH plantain peel-cane bagasse (50/50) (GPPCB), ma-
de 4.8, una temperatura de 28C y un contenido de ture plantain peel-cane bagasse (50/50) MPPCB).
humedad de 63%. La determinacin de la enzima la- Fermentation units were kept at pH 4.8, 28C and a
casa se llev a cabo por la oxidacin ABTS Resul- 63% humidity. The determination of the laccase en-
tados. En los sustratos utilizados se obtuvieron un zyme was carried out by ABTS oxidation. Results.
mximo de actividad lacasa el da 24; con excepcin In the substrates used, a maximum laccase activity
del tratamiento con PM que lo alcanza en el da 34. was achieved in the 24th day, except in the matu-
El sustrato PMB tuvo la mayor produccin de lacasa re plantain treatment, which achieved it in the 34th
day. MPPCB substrate had the highest production of
con una concentracin de 19.4 U/ml. Conclusin. La
laccase with 19.4 U/mL concentration. Conlcusion.
cscara de pltano puede ser un buen sustrato cuan- Plantain peel can be a good substrate when is su-
do se suplementa con otros residuos lignocelulsicos pplemented with other lignocellulosic wastes, such
como por ejemplo el bagazo de caa. La lacasa pue- as sugar cane bagasse. Laccase can be used as a
de ser un indicador morfogentico al mostrar el mxi- morphogenetic indicator because it shows the maxi-
mo crecimiento del micelio. mum growth of the mycelium.

Palabras claves: cscara de pltano, bagazo de Key words: plantain cane, cane bagasse, Pleurotus
caa, Pleurotus ostreatus, lacasa. ostreatus, laccase.

* Ingenieria de Alimentos. Candidata a Maestra en Ciencia y Tecnologa de Alimentos Universidad Nacional de Colombia. Medelln
Antioquia.
** Ingeniera de Alimentos. Master en Administracin de Negocios (MBA). Universidad de los Andes. Bogot.
*** Ingeniero Qumico. Ph D. en Ingeniera de Alimentos. Docente Asociado. Departamento de Ingeniera Agrcola y Alimentos. Facultad de
Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Colombia. Medelln. Antioquia.

Correspondencia: Eduardo Rodrguez Sandoval. e-mail: edrodriguezs@unal.edu.co


Artculo recibido:16/12/2009; Artculo aprobado: 3/12/2010

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Produo de lacasa utilizando pltano maduro-baguau de cana (50/50) (PMB). As
pleurotus ostreatus sobre cascas unidades de fermentao se mantiveram a um PH
de pltano e bagazo de cana de 4.8, uma temperatura de 28C e um contedo de
umidade de 63%. A determinao da enzima lacasa
Resumo se levou a cabo pela oxidao ABTS Resultados.
Nos substratos utilizados se obtiveram um mximo
Introduo. A casca de pltano de uso industrial de atividade lacasa o dia 24; com exceo do trata-
representa do 35% ao 40%, do peso total do fru- mento com PM que o atinge no dia 34. O substra-
to, sendo uma quantidade considervel de resduos to PMB teve a maior produo de lacasa com uma
que se poderiam aproveitar para a produo de concentrao de 19.4 Ou/ml. Concluso. A casca
complexos enzimticos. Objetivo. Pesquisar o po- de pltano pode ser um bom substrato quando se
tencial que tem a casca de pltano (verde e madura) suplementa com outros resduos lignocelulsicos
variedade Dominico-Hartn como substrato para a como, por exemplo, o baguau de cana. A lacasa
produo da enzima extracelular lacasa utilizando pode ser um indicador morfogentico ao mostrar o
o fungo Pleurotus ostreatus. Materiais e mtodos. mximo crescimento do miclio.
O fungo Pleurotus ostreatus se cultivou em diferen-
tes misturas assim: Cascas de pltano verde (PV), Palavras Importantes: casca de pltano (Banana
cascas de pltano maduro (PM), cascas de pltano da Terra), Baguau de cana, Pleurotus ostreatus,
verde-baguau de cana (50/50) (PVB), cascas de lacasa.

el procesamiento del pltano4. La cscara con-


Introduccin
tiene celulosa (10.5%) y hemicelulosa (14%) y
lignina (17%)5. Por esta razn, se podra utilizar
El cultivo de pltano en Colombia tiene gran im-
para la produccin de complejos enzimticos.
portancia socioeconmica como generador de
Se han realizado diversas investigaciones sobre
empleo y de seguridad alimentaria, entendida
la obtencin de enzimas ligninolticas y celulolti-
esta ltima como la disponibilidad estable y su-
cas con diferentes clases de hongos empleando
ficiente de alimentos. El pltano (de consumo
como sustrato residuos de pltano (hojas, tallos,
interno y exportacin) alcanz un rea total de
cscaras). Reddy et al. (2003),6 investigaron la
cultivo de 346.524 ha y un nivel de produccin obtencin de lacasa, lignina peroxidasa, xilana-
de 2.699.099 ton en el 20081. Actualmente, cer- sa, CMCasa y Fpasa sobre residuos de banano
ca de un 4% de la produccin nacional de pl- utilizando Pleurotus ostreatus y Pleurotus sajor-
tano se destina al mercado de exportacin, el caju. Osma et al. (2007),7 investigaron la pro-
restante se dirige hacia el consumo interno en duccin de lacasa a partir de cscara de banano
fresco y una muy pequea proporcin, menos con el hongo Trametes pubescens. Otros estu-
del 1%, se destina como materia prima para la dios se han enfocado en la evaluacin de laca-
agroindustria nacional. Se estima que el merca- sa, manganeso peroxidasa y ligninoperoxidasa
do industrial del pltano absorbe aprox.12 mil utilizando Pleurotus djamor y Lentinus crinitus
ton/ao y se destinan a productos procesados en residuos de pltano y aserrn8-9.
para consumo humano y concentrados para
consumo animal2, donde se generan grandes Los hongos del gnero Pleurotus son basidio-
residuos ricos en lignina y celulosa. micetos de pudricin blanca, con un alto valor
nutricional, propiedades teraputicas y variadas
La lignocelulosa es uno de los recursos bio- aplicaciones biotecnolgicas. El hongo Pleuro-
energticos renovables ms abundantes en tus ostreatus (P. ostreatus) posee la capacidad
la naturaleza, el cual se compone de celulosa, de degradar grandes polmeros (lignina y celu-
hemicelulosa y lignina. Sin embargo, su utiliza- losa) que constituyen el substrato vegetal, as
cin como fuente de energa se ve limitada en el como contaminantes ambientales mediante la
presente porque la lignina es difcil de degradar secrecin de un complejo enzimtico. La efec-
y transformar a glucosa3. El porcentaje en peso tividad de esta degradacin depende en gran
de cscara de las variedades de uso industrial medida de las oxidoreductasas extracelulares
puede estar entre un 35% a 40%, el cual es y los metabolitos secundarios de bajo peso mo-
una cantidad considerable de residuos durante lecular3. Segn estudios previos, el hongo P. os-

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treatus es capaz de crecer sobre sustratos muy unidades de fermentacin fueron bolsas de
econmicos como los residuos agrcolas10. polipropileno biorientado (esterilizables), con
tapn de algodn y capacidad de 500g, pero
La importancia biotecnolgica de la enzima solo empleando 200 g en cada una de ellas.
lacasa radica en su habilidad para oxidar los La fermentacin se llev a cabo a 28C, en
compuestos fenlicos y los relacionados con la
oscuridad, y ajustando la humedad a 63%,
lignina, como tambin degrada ciertos contami-
nantes ambientales7. La lacasa se ha utilizado condiciones apropiadas para el crecimiento del
como agente blanqueador en la pulpa de ma- organismo y la produccin de enzimas3.
dera y la industria de papel, en la desinfeccin
con cloro y en la eliminacin de compuestos fe- Medicin de la actividad enzimtica lacasa
nlicos de las aguas residuales. En lo referen- (Lcc)
te al sector alimenticio esta enzima hace parte
indispensable de los anlisis de fenoles en los Los extractos enzimticos de cada cultivo se
jugos naturales; adems tiene aplicaciones obtuvieron con buffer de acetato 0.05 M, pH
como biosensor para la determinacin de los 4.8, en una relacin 0.25 g de sustrato/mL de
catecoles de los polifenoles en el t. La lacasa buffer. Se agitaron vigorosamente y se centrifu-
inmovilizada se ha utilizado para eliminar feno- garon a 4000 rpm durante una hora. El sobre-
les del zumo de manzana y del vino11. Teniendo nadante se filtr sobre gasa y se centrifug de
en cuenta lo anterior, esta propuesta plantea
nuevo a 4000 rpm durante 30 min y se alma-
la evaluacin de la actividad enzimtica de la-
casa producida mediante el cultivo Pleurotus cen a 4C para una posterior medicin de su
ostreatus sobre cscaras de pltano verdes actividad enzimtica.
y maduras, y bagazo de caa como fuente de
carbono en fermentacin slida. La determinacin de la enzima lacasa se llev
a cabo por la oxidacin ABTS [2,2- Azino-
bis( 3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] al
Materiales y mtodos catin ABTS+ con un volumen de reaccin de
2 ml que comprende a 200 l de ABTS 1 mM,
Materia prima 600 l de buffer acetato de sodio 0.1M, pH 5 y
1200 l de extracto enzimtico 12. La absorban-
Los pltanos verde y maduro variedad Domi-
cia se tom a una longitud de onda de 420 nm
nico-Harton, fueron adquiridos en un super-
mercado local de la ciudad de Bogot D.C y en un espectofotometr (Unicam Helios B NC
almacenados a temperatura ambiente hasta su 9432 UVB 1000E, Termo Spectronic, Rochester
posterior uso. Las cscaras fueron retiradas de NY), realizando medidas al inicio de la reaccin
los pltanos y desinfectadas con hipoclorito de y tres minutos despus, para obtener un delta
sodio al 1% en agua y cortadas en lminas de de absorbancia til en los clculos, donde se
aproximadamente 2 cm x 2cm. El bagazo de utiliz un coeficiente de extincin de 36000 M-1
caa adquirido por la Universidad Jorge Tadeo cm -1 12-13.Una unidad enzima se define como 1
Lozano fue cortado en trozos de 2 cm x 2cm y mol de producto formado por minuto (U = mol
mezclado con la cscara verde y madura en di- / min), bajo las condiciones del ensayo. Las uni-
ferentes proporciones. Los sustratos utilizados dades enzimticas (U/L) de lacasa se calculan
en la experimentacin fueron los siguientes: utilizando la Ecuacin 1.
cscaras de pltano verde (PV) (100%), cs-
caras de pltano maduro (PM) (100%), cs-
caras de pltano verde-bagazo de caa (PVB)
(50/50), cscaras de pltano maduro-bagazo
de caa (PMB) (50/50).
(Ecuacin 1)
Cultivo de Pleurotus ostreatus
Donde, ABS es la lectura de absorbancia
Los inculos de Pleurotus ostreatus se obtuvie- final - lectura de absorbancia inicial, Vr es el
ron de semillas de trigo cultivada con esta cepa volumen total de la reaccin, es el coeficiente
utilizando una relacin de 4% (p/p en base h- de extincin que tiene un valor de 36000 mol-1
meda) para cada unidad de fermentacin. Las cm-1, Vm es el volumen de la muestra.14

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Diseo experimental y anlisis estadstico Resultados y discusin
Para este estudio se aplic un diseo experi-
mental aleatorio de medidas repetidas, con los En los ensayos preliminares se observaron di-
siguientes factores: tiempo de fermentacin (5 ferentes intensidades de color amarillo en los
niveles) y tipo de sustrato (4 niveles). El tiempo extractos de cada uno de los tratamientos, los
de medicin de la fermentacin fue en los das cuales se utilizaron para la cuantificacin de la
actividad lacasa (Figura 1). Durante el tiempo
12, 24, 34, 41 y 45. Los sustratos utilizados fue-
de experimentacin la coloracin de los extrac-
ron cscaras de pltano verde (PV), cscaras de
tos enzimticos aumentaba lo que se atribu-
pltano maduro (PM), cscaras de pltano ver-
ye al estado de maduracin del sustrato en el
de-bagazo de caa (PVB), cscaras de pltano momento de hacer las mediciones. Amaga et
maduro-bagazo de caa (PMB). Los tratamien- al (2008)18 establecieron que se incrementa el
tos se realizaron por triplicado, en total fueron porcentaje de lignina (14.315.4%) a medida
60 tratamientos. La variable de respuesta fue la que las cscaras de pltano maduran, y si se
actividad lacasa. Los datos experimentales se tiene en cuenta que la lignina es utilizada por
analizaron mediante un ANOVA y las diferencias los hongos filamentosos para producir enzimas
significativas se establecieron utilizando la prue- ligninasas como la lacasa, se podra afirmar
ba de Duncan. El anlisis se realiz mediante que las cscaras de pltano maduro pueden
Statgraphics plus de Microsoft. tener una mayor produccin de lacasa.

Figura 1. Intensidad de color de los extractos con el complejo enzimtico

En la figura 2 se presenta el comportamiento en el da 16, debido a que el sustrato estaba


de la actividad lacasa para los diferentes trata- cubierto completamente con el micelio (masa
mientos durante el tiempo de experimentacin. de hifas que constituye el cuerpo vegetativo de
A partir del da 12 de cultivo se observa un pe- un hongo), lo que indica el inicio de la fructifi-
queo valor en la produccin de lacasa. En los cacin. En esta etapa la produccin de lacasa
sustratos utilizados se obtiene un mximo de disminuye y comienza la produccin de celu-
actividad lacasa el da 24; sin embargo, el tra-
lasas que se relaciona con el desarrollo de los
tamiento PM alcanza su mximo en el da 34.
primordios (cuerpos fructferos en las primeras
Luego comienza a descender, aunque en el da
45 hay un leve aumento de esta actividad para etapas de desarrollo)16. En el presente estu-
el tratamiento con sustrato PMB. Este compor- dio se encontr un comportamiento parecido,
tamiento es similar al reportado por Murrieta et donde la mxima actividad enzimtica coincide
al. (2002)15, quienes evaluaron la produccin con el mximo crecimiento del micelio duran-
de lacasa utilizando Pleurotus pulmonarius y te la fase vegetativa y decrece hasta aparecer
Trichoderma viride sobre pulpa de caf. los cuerpos fructferos del hongo. Esta enzima
puede utilizarse como un indicador morfogen-
La mayor actividad de lacasa en el estudio de tico al mostrar el mximo crecimiento del mi-
Murrieta et al. (2002)15 se obtuvo en el da 12 celio, y de esta manera obtener el tiempo que
con un valor de 34.69 U/g sustrato y descendi debe comenzar a fructificar el P. ostreatus.

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Figura 2. Actividad de la enzima lacasa producida por P. ostreatus en los sustratos:
Cscaras de pltano verde (PV), cscaras de pltano maduro (PM), cscaras de pltano
verde-bagazo de caa (PVB), cscaras de pltano maduro -bagazo de caa (PMB)

Los valores de la actividad lacasa obtenidos guido del sustrato PVB que al mismo tiempo
por ml de extracto (U/ml) para cada uno de report un valor de 17.6 U/ml. Los PV y PM ob-
los tratamientos de cultivo durante 45 das se tuvieron las actividades ms bajas con valores
muestran en la Tabla 1. Los resultados de la entre 12-12.6 U/ml para ese mismo tiempo de
cultivo (24 das). Si se comparan estos dos l-
actividad lacasa tuvieron diferencias significati-
timos sustratos se puede apreciar que se pro-
vas entre tratamientos. El sustrato PMB resul- duce ms lacasa cuando se utiliza sustrato de
t ser el ms adecuado para la produccin de cscaras de pltano maduro (PM), lo cual pudo
lacasa, teniendo una mayor concentracin de contribuir a la mayor actividad de esta enzima
esta en un tiempo de 24 das (19.4 U/ml), se- empleando bagazo de caa (PMB).

Tabla 1. Actividad lacasa ( Lcc) expresada en (u/L) para cada uno de los tratamientos

Tratamiento*
Tiempo (da)
PM** PV** PMB** PVB**
12 0.36 0.02 0.75 0.05 0.17 0.08 0.32 0.04
24 12.03 0.18 12.66 0.11 19.42 0.12 17.58 0.16
34 14.23 0.10 6.89 0.01 8.90 0.01 14.67 0.19
41 6.97 0.17 7.17 0.12 4.94 0.01 11.01 0.08
45 7.69 0.12 2.89 0.05 9.85 0.18 8.77 0.06

* Valores son el promedio desviacin estndar


** Cscaras de pltano verde (PV), cscaras de pltano maduro (PM), cscaras de pltano verde-bagazo de
caa (PVB), cscaras de pltano maduro -bagazo de caa (PMB).

La lignina es un componente estructural de la lulosa, la hemicelulosa y las pectinas. Adems,


pared celular de los vegetales, junto con la ce- la lignina es una cadena de compuestos fen-

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licos conformado por aldehdo sirngico, alco- suplementa con otro tipo de residuo lignocelu-
holes coniferlicos, sinaplicos y cumarlicos17. lsico, como por ejemplo el bagazo de caa.
El principal componente de la cscara de pl-
tano es la lignina con un contenido entre 12%-
16.8%, de acuerdo al estado de madurez y al Conclusiones
genotipo de la variedad18-19. Durante la madu-
racin del pltano, el contenido de lignina au- El Pleurotus ostreatus es un hongo comestibles
menta contrario a lo que sucede con la cscara que tiene la capacidad de producir complejos en-
de banano. Adicionalmente, se ha reportado zimticos con actividad lignoltica, como la laca-
que el incremento de la glucosa en la cscara sa. El estudio de la produccin de este tipo de
de pltano se debe a la hidrlisis del almidn y a enzimas, de gran inters para la industria alimen-
la degradacin de la hemicelulosa presente en taria, ambiental y qumica, a partir de cscaras
este material vegetal18. Los cambios dinmicos de pltano de diferentes estados de maduracin
en la matriz de la superficie del sustrato pueden y bagazo de caa es una buena alternativa para
afectar los resultados de la actividad enzimti- el aprovechamiento de residuos orgnicos por
ca3. Esto podra explicar el comportamiento de medio de procesos biotecnolgicos. Durante el
la actividad lacasa cuando se emplea cscara desarrollo de este trabajo, se encontr que el
de pltano maduro. El incremento del contenido Pleurotus ostreatus produce mayor cantidad de
de lignina y la deficiencia de hemicelulosa en lacasa (19.4 U/ml) en el da 24 de cultivo utilizan-
la cscara a medida que se madura el pltano
do como sustrato cscara de pltano maduro y
podra contribuir al aumento en la produccin de
suplementado con bagazo de caa (50/50). Ade-
enzimas ligninolticas como la lacasa.
ms, cuando se desarrolla completamente el mi-
celio se presenta la mayor actividad de la lacasa,
Las condiciones de crecimiento constituyen un
y posteriormente desciende debido al desarrollo
factor importante que influye en la eficiencia de
los hongos para producir lacasa. Por ejemplo, de los cuerpos fructferos del hongo. Se reco-
cuando se suplementan las cscaras de caca- mienda estudiar el efecto de otros suplementos
huete con diferentes sustratos ricos en nitrgeno lignocelulsicos y otras condiciones de proceso
a una razn de 9:1, la productividad de lacasa au- (pH, temperatura) para encontrar mayores pro-
menta de 2.2 a 49.2 U/g de sustrato seco20. Los ducciones de la enzima lacasa.
niveles de la actividad lacasa se pueden mejorar
despus de optimizar las condiciones de cultivo
y de adicionar inductores (fuentes de nitrgeno y Agradecimientos
xilidina). Reddy et al. (2003)6 encontraron valo-
res de lacasa entre 0.11 y 1.66 U/mg de protena Se reconoce la ayuda ofrecida por el labora-
de sustrato despus del da 10 de cultivo con P. torio de biotecnologa de la Universidad Jorge
ostreatus y P. sajor-caju sobre residuos agrco- Tadeo Lozano. Adems se agradece los apor-
las de banano. Ramirez et al. (2003)21 reportaron tes realizados por la Ingeniera Yineth Pieros
valores de 20 U/ml de actividad lacasa utilizando para desarrollar este estudio.
P. ostreaus en un sustrato de vinaza y salvado
de trigo (1:1). Sin embargo, estos resultados son
particulares para cada sistema y dependen del
sustrato y las condiciones de cultivo. Referencias

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