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La biotecnologa moderna tiene un papel im- protenas. Se han explorado diversas fuentes
portante en la restauracin de sitios daados de enzimas en la naturaleza. Especialmente,
ambientalmente. El reto actual es desarrollar los microorganismos responsables de la de-
herramientas biotecnolgicas que formen par- gradacin de la lignina son productores de una
te de procesos limpios y eficientes energtica- batera de enzimas de baja especificidad y con
mente para la prevencin, el control y la reme- un alto potencial para su uso en la transforma-
diacin de contaminaciones ambientales. La cin de compuestos contaminantes y xenobi-
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investigacin en este campo est sustentada ticos. El desarrollo de nuevos biocatalizadores
en herramientas metodolgicas de diferentes con mejores propiedades catalticas, cinticas
reas del conocimiento, como lo son la bioin- o de estabilidad, se ha sustentado en el uso
geniera, enzimologa, ingeniera de protenas, de las tcnicas de mutacin sitio-dirigida, o en
microbiologa aplicada y termodinmica de las tcnicas de modificacin qumica de pro-
solventes. El esfuerzo del laboratorio de Biotec- tenas. Esta ltima permite conjugar nuevos
nologa Ambiental se centra en la modificacin grupos funcionales (acilacin, sililacin, pegila-
enzimtica de sustancias contaminantes, princi- cin, etc.) en los sitios reactivos de los residuos
palmente hidrocarburos aromticos policclicos aminocidos de las protenas. De esta manera,
y plaguicidas. Adems de investigaciones con se ha logrado disear y construir biocataliza-
otros compuestos hidrfobos de alto impacto dores semisintticos que pueden disolverse
ambiental, como los colorantes industriales, en solventes orgnicos, que tienen mayor es-
los compuestos azufrados heterocclicos y los tabilidad y actividad a altas temperaturas o
policlorofenoles. Es imperativo que las trans- que incrementan el rango de sustratos que re-
formaciones enzimticas o microbiolgicas de conoce una enzima. Todo este potencial de la
dichos contaminantes, conlleven a la reduccin biocatlisis se ejemplifica aqu, en la transfor-
o eliminacin de su impacto ambiental. macin biocataltica de contaminantes como
Por otro lado, la bsqueda y diseo de nue- los colorantes industriales, los plaguicidas y los
vos biocatalizadores se realiza a travs del uso compuestos derivados del petrleo, como los
de tcnicas de mutacin sitio-dirigida, tecno- hidrocarburos policclico aromticos y los com-
loga enzimtica o modificacin qumica de puestos organoazufrados.
Figura 1.
Representacin esquemtica de la estructura cristalogr-
fica del citocromo c de Sacharomyces cereviciae, tomado
del PDB YCC2.
directa entre el contenido de azufre de los com- de hidrocarburos policclico aromticos. Como
bustibles y la emisin de partculas y dixido de productos de la reaccin se generan las qui-
azufre a la atmsfera. Con el fin de evitar estas nonas correspondientes, de la misma manera
emisiones, actualmente la tendencia mundial como se ha descrito para las enzimas peroxida-
ha establecido como lmite mximo el 0.05% sas (figura 3). Esto sugiere que el mecanismo de
de contenido de azufre en el diesel. reaccin es similar para estos biocatalizadores.
Los compuestos aromticos azufrados han La oxidacin enzimtica, seguida de la adicin
sido oxidados por las hemoprotenas no enzi- de microorganismos endgenos, puede ser una
mticas, como el citocromo c y la hemoglobina, estrategia de remediacin efectiva de suelos
en condiciones de reaccin moderadas, como contaminados, debido a que la biodegradacin
temperatura ambiente, presiones atmosfricas de los hidrocarburos policclicos y sus metabo-
y con un contenido de solventes de 10-20%. Sol- litos incrementa con su estado de oxidacin.
ventes como la dimetilformamida o el acetoni- Adicionalmente, las quinonas resultantes son
trilo son adecuados para disolver los compues- significativamente menos mutagnicas. Por
tos organoazufrados presentes en el diesel, ejemplo, el benzo(a)pireno, un potente carcin-
como el dibenzotiofeno, tiantreno, dibencilsul- geno, mostr una concentracin mnima mu-
furo y otros ms, de los cuales sus estructuras tagnica de 14 ng/ml, mientras que ninguna de
qumicas y de los productos de reaccin, que sus quinonas fue mutagnica. Esto nos indica
son principalmente sulfonas, se ejemplifican que una transformacin enzimtica de los hi-
en la figura 2. Estas reacciones se llevan a cabo drocarburos policclicos aromticos es suficien-
en presencia de 1 mM de perxido de hidrge- te para reducir su impacto ambiental.
no como donador de electrones. Los hidrocarburos policclicos aromticos
En el mismo sistema de reaccin, el citocro- son componentes del petrleo crudo, la creo-
mo c y la hemoglobina tambin han sido uti- sota y el carbn. Este tipo de compuestos est
lizados como biocatalizadores en la oxidacin ampliamente distribuido en el ambiente como
Tabla 1. Biotransformaciones con citocromo c (Vzquez-Duhalt, R., en J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 7, 1999).
Sustratos Productos
Hidrocarburos aromticos policclicos
Antraceno 9,10-Antraquinona
Benceno Fenol
Benzo(a)pireno 1,6-Benzo(a)pirenodiona
Pireno 1,8-Pirenodiona
Compuestos organoazufrados y heterocclicos
Benzotiofeno Sulfxido de benzotiofeno
Carbazol Desconocido
Dibenzotiofeno Sulfxido de dibenzotiofeno
Sulfuro de dibencilo Sulfxido de dibencilo
Sulfuro de difenilo Sulfxido de difenilo
N-methyl carbazol N-Hidroximetil carbazol
Tiantreno Disulfxido de tiantreno
Tioanisol Metilfenil-sulfxido
Otros sustratos
ABTS ABTS (radical catinico)
Guayacol Tetraguayacol
cido linolnico Perxido de linoleato
Luminol Quimioluminiscencia
Metionina Etileno
Estilbeno Epxido de estilbeno
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Figura 2.
Estructuras moleculares de los compuestos organoazu-
frados y los productos de reaccin en la biocatlisis con
hemoprotenas.
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^[ce]beX_dW
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E
Figura 3.
Oxidacin de hidrocarburos policclicos aromticos con di-
ferentes hemoprotenas.
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9b 9b 9b 9b
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Figura 4.
Deshalogenacin oxidativa del pentaclorofenol por las lig-
nino, manganeso o cloro peroxidasas de hongos.
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Figura 5.
Biotransformacin de plaguicidas por el sistema de mo-
noxigenasa citocromo P450 de Pleurotus ostreatus (Jure-
gui et al., en Biodegradation, 14, 2003).
Tabla 3. Velocidad de decoloracin de diferentes colorantes industriales por la peroxidasa verstil de Bjerkandera adusta.
(Tinoco R. et al., 2007 J. Mol. Catal. B: Enzymatic 46: 1-7)
Tabla 4. Constantes cinticas del citocromo c de levadura nativo y variantes en la oxidacin del pireno
(Vzquez-Duhalt, en J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 7, 1999).
Variante kcat KM,app kcat/KM,app
(s )
-1
(s )
-1
(s-1 M-1)
lo menos otras 10 000 esperando ser identifi- padres de la siguiente ronda de evolucin. La
cadas. En estos momentos, el reto a vencer es gran ventaja de la evolucin in vitro es que so-
cmo tener acceso a esta rica fuente de recur- lamente requiere de la secuencia del gene que
sos naturales. Dada la impredecible diversidad codifica para la enzima de inters y no de la re-
de especies que habitan un sitio en particular, solucin de su estructura tridimensional, aun-
la alternativa ms explorada a la fecha se fun- que un conocimiento ms profundo del me-
damenta en la amplificacin masiva de cidos canismo de reaccin permite tomar mejores
nucleicos a partir de muestras ambientales, lla- decisiones sobre la estrategia de seleccin.
mada bioprospeccin. Algunos casos exitosos El diseo racional de protenas est emer-
que han aplicado esta estrategia son el aisla- giendo como la tcnica idnea para estudiar los
miento de genes que codifican para nuevos an- principios generales que rigen la estructura y la
tibiticos, la identificacin de actividades enzi- funcin de las protenas. La meta de muchos de
mticas con nuevas propiedades, por ejemplo estos estudios ha sido la generacin de protenas
a-amilasas ms termoestables, la utilizacin con nuevas funciones, incluyendo el aumento de
de sustratos novedosos, o inclusive la recupe- la tasa cataltica de algunas reacciones. De ma-
racin de vas metablicas completas. nera muy especial, la habilidad para disear una
Como alternativa al uso de la biodiversidad enzima para llevar a cabo una reaccin qumica
natural, se han desarrollado mtodos in vitro especfica tiene potenciales aplicaciones am-
que permiten la generacin acelerada de va- bientales. La utilizacin de las herramientas mo-
riantes sobre una secuencia en particular. Es- leculares para el diseo de biocatalizadores ms
tos mtodos se basan en simular la evolucin eficientes en la degradacin de compuestos con-
Darwiniana en un tubo de ensayo, e involucran taminantes ha abierto un nuevo panorama en la
la generacin y seleccin de una biblioteca mo- aplicacin ambiental de las enzimas. La mutacin
lecular con suficiente diversidad como para que sitio dirigida de algunos residuos especficos del
la funcin alterada requerida se encuentre re- citocromo c ha permitido aumentar la eficiencia
presentada. Esta diversidad molecular se pue- cataltica en la degradacin de hidrocarburos aro-
de crear tpicamente mediante mutagnesis al mticos policclicos (tabla 4).
azar. Aquellas variantes funcionalmente mejo- Dos factores limitan la aplicacin a gran es-
radas son identificadas de manera preliminar cala de las enzimas: su actividad y sobretodo,
mediante mtodos de seleccin o de escrutinio su estabilidad en condiciones de proceso. Las
de alto desempeo y entonces utilizadas como peroxidasas y en general la hemoprotenas se
Tabla 5. Estabilidad cataltica e integridad del hemo de variantes del citocromo c de levadura en presencia de 1 mM de
perxido de hidrgeno.
Y46F, Y48F, Y67F, Y74F, Y97F 0.7 45.5 8.7 5.50 x 10-3 1592
N52I, W59F, Y67F, F82G 91.3 estable 8.4 4.12 x 10-2 205
N52I, W59F, Y67F, K79A, F82G estable 170 10.1 7.26 x 10-2 139