GUIA DE PROBLEMAS

2013
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ESTERILIZACIN

1) Qu consideraciones debe tener en cuenta para cargar el autoclave con material a esterilizar?

2) Qu mtodo utilizara para esterilizar cada uno de los siguientes materiales y soluciones?

Placas de Petri descartables, material de ciruga, ropa de cama hospitalaria, solucin fisiolgica,
suero fetal bovino, vitaminas, antibiticos, etanol, glicerol.

3) Una solucin salina se fraccion en partes iguales en dos frascos A y B. La fraccin A se

esteriliz en autoclave en una atmsfera conteniendo 100% de vapor; la fraccin B se esteriliz
tambin en autoclave pero en una atmsfera que contena 60% de vapor y 40% de aire, durante
el mismo tiempo. Cul de los dos procedimientos asegura la eliminacin total de esporas? Por
qu?

4) Qu caractersticas de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la eleccin de un

mtodo de esterilizacin ?.

5) Por qu se requiere mayor tiempo de esterilizacin en horno que en autoclave ?. Cul es el

agente esterilizante en cada caso ?.

6) Cmo decontaminara un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus

cereus y uno utilizado para crecer Escherichia coli ?.

7) Un tubo conteniendo medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente

incubado a 37 C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detect crecimiento de
microorganismos.

a) Qu parmetros debera controlar para que el proceso de esterilizacin se lleve a cabo de

manera adecuada?.

b) Una vez solucionado el inconveniente, Cmo determinara si dicho medio est efectivamente
estril?.

8) Cmo realizara un control de esterilizacin y un control de esterilidad ?.

9) Ud. dispone en su laboratorio de un mechero, autoclave, una solucin de etanol 70 %, un horno y

una lmpara de UV y necesita preparar y esterilizar los siguientes medios de cultivo: Caldo M9,
agar nutritivo y agar Mossel con yema de huevo y polimixina B. Adems necesita esterilizar una
membrana de nitrocelulosa de 0,2 m, placas de petri de vidrio, el rastrillo y el ansa.

a) Indique que mtodo de esterilizacin y/o desinfeccin de los que se dispone en su laboratorio
utilizara para cada uno de los materiales mencionados.

b) Necesita disponer de algn otro mtodo de esterilizacin?. Por qu?

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DIVERSIDAD MICROBIOLGICA

1) Qu tipos de bacterias se encuentran asociadas con las zonas de color prpura y verde de la
columna de Winogradsky?

2) En qu zona de la columna esperara encontrar un anaerobio estricto?

3) Describa una sucesin microbiana en la columna de Winogradsky

4) Qu gradientes se forman en la columna de Winogradsky?. Qu elementos se utilizan en el

laboratorio para garantizar la formacin de los mismos?.

5) a) Indique que funcin cumplen cada uno de los elementos agregados en la columna de
Winogradsky.

b) Ubique en relacin al gradiente de SH2 a los siguientes microorganismos: bacterias

reductoras de sulfato, bacterias verdes del azufre, bacterias prpuras del azufre, cianobacterias,
diatomeas.

c) En base a que otro/s parmetro/s ambientales podra ubicarlas.

Justifique en todos los casos.

6) A partir de libros de texto, citas bibliogrficas o bsquedas a travs de internet, recabar ms

informacin sobre el metabolismo y los requerimientos de oxgeno de los organismos que
pueden estar presentes en la columna de Winogradsky. Muchos de estos microorganismos se
mencionan ms abajo. Utilizando la informacin obtenida, dibujar una columna de Winogradsky
y ubicar los microorganismos en el lugar apropiado. Thiobacillus sp., Clostridium sp., Algae,
Desulfovibrio sp., Cyanobacteria, Chromatium sp., Rhodospirillum sp., Chlorobium sp.

7) Los siguientes 4 tipos metablicos se encuentran presentes en la columna de Winogradsky:

fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimiolitoauttrofos y quimioorganohetertrofos.
a) Mencione un ejemplo de cada uno de estos microorganismos que pueda ser encontrado en una
columna de Winogradsky tpica.
En base a los ejemplos por usted seleccionados seale:
b) Qu microorganismos participan en el ciclo del azufre y qu transformaciones realizan de ese
compuesto.
c) Ubique espacialmente c/u de los microoganismos seleccionados en funcin del gradiente de O2.

TINCIONES

1) En qu consiste una tincin diferencial?. Para qu se emplea?.

2) Qu sucede si a un cultivo envejecido de Bacillus sp. se le realiza una tincin de Gram?.

3) Cmo espera observar las bacterias luego de la tincin de Gram si se olvida de realizar el
paso de decoloracin ?.

4) Qu suceder si no se calienta en presencia del colorante en la tincin de esporas?.

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5) Podra utilizar un colorante bsico como primer colorante en la tincin de esporas ?.

6) Qu caractersticas debe tener un colorante para ser empleado en una tincin negativa?.

7) Las tinciones de Gram y esporas permiten determinar diferencias estructurales en clulas

de distintos gneros. Cules son esas diferencias y cul es el paso de cada coloracin que las
pone en evidencia ?. Qu tipos de colorantes se utilizan en cada caso ?.

8) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio ptico luego de una tincin de Gram
y color rosado al efectuarse una coloracin de esporas. Por qu motivo el cristal violeta en
el primer caso y la safranina en el segundo tien la bacteria de esa manera ?.

9) Indique cual o cuales de las tinciones realizadas en los trabajos prcticos ponen en
evidencia diferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente.

10) Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta.

a) En una tincin negativa los colorantes utilizados tienen afinidad slo por la pared
bacteriana.

b) En la tincin de esporas el verde de malaquita no tie el citoplasma celular porque es

removido por los solventes orgnicos que se utilizan en el paso de decoloracin.

c) Las clulas Gram negativas no se tien con cristal violeta porque el mordiente no puede
atravesar la pared de peptidoglicano.

11) Se dispone de un kit de Gram y un frasco de verde de malaquita. Con estos colorantes podra
realizar una tincin para determinar la ubicacin de las esporas en una especie de Bacillus que
se quiere identificar?. Explique.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

1) Qu tipo de medio es el agar Mossel?. Para qu sirven cada uno de sus constituyentes?.
Podra reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro?.

2) Disee un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la
maltosa con produccin de cido de los que no lo hacen.

3) Discuta las siguientes afirmaciones:

a- Para determinar la carga bacteriana de una muestra debe realizarse un enriquecimiento

previo.

b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio lquido pues hay libre competencia por los
nutrientes.

c- El paso de aislamiento selectivo y/o diferencial puede hacerse en medio lquido.

d- La premisa fundamental en un protocolo de aislamiento es conseguir un cultivo puro.

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4) La composicin del caldo nutritivo es: extracto de carne y peptona en agua a pH 7. La

composicin del caldo Mc Conkey es: peptona, lactosa, sales biliares, prpura de bromocresol y
cloruro de sodio en agua a pH 7. Cul es la funcin de cada uno de los componentes en cada
medio?.

5) Los principales componentes del agar Rogosa utilizado en el aislamiento de Lactobacillus

son: glucosa, extracto de levadura, extracto de carne, peptonas, acetato de sodio, tween 80 (pH
5,5). Explique cul es la funcin de cada uno de ellos y por qu la incubacin se realiz en
anaerobiosis.

6) Discuta los siguientes enunciados y justifique:

a) Cualquiera de los siguientes medios podra ser utilizado para diferenciar aquellos
microorganismos capaces de fermentar la lactosa:

Medio 1 Medio 2 Medio 3 Medio 4

Peptona de Peptona de carne Cloruro de Cloruro de
carne amonio amonio
Lactosa Extracto de carne Lactosa Lactosa
Rojo fenol Lactosa Rojo fenol Glucosa
Agua Rojo fenol Agua Rojo fenol
Agar Agua Agar Agua
---- ---- ---- Agar

b) Especies del gnero Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar EMB.

7) En el estudio de la esporulacin de Bacillus cereus, cuya espora es oval y central, se

observaron al microscopio bacilos con esporas terminales caractersticas de Bacillus subtilis.
Disee un medio de cultivo que le permita diferenciar ambos microorganismos.

PRUEBAS BIOQUIMICAS

1) Diga si es verdadero o falso

a) En el agar EMB y en el agar Fe de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que

realizan fermentacin cido-mixta de aquellos que realizan fermentacin butilengliclica.

b) Las pruebas bioqumicas Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, pueden realizarse en

cualquiera de los siguientes medios:

i) Extracto de carne, peptona de carne, agua.

ii) Peptona, glucosa, buffer fosfato, agua.

2) Qu resultados espera obtener en la prueba bioqumica de agar hierro de Kligler, para

microorganismos con las siguientes caractersticas metablicas:?.

a) Aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbono

b) Aerobio facultativo que no utiliza la lactosa como fuente de carbono

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c) Aerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente de carbono

3) Qu tipo de metabolismo y qu productos se ponen en evidencia al realizar las pruebas

de Rojo de Metilo y Voges-Proskahuer ?. Qu precauciones debera tener para la correcta
interpretacin de ambas pruebas ?.

4) A partir de una muestra de agua del Ro de la Plata, se obtienen cultivos puros de 5

microorganismos (A, B, C, D, E) A cada uno de ellos se le realizan las pruebas de agar hierro
de Kligler, Rojo de Metilo y Voges Proskahuer, obtenindose los siguientes resultados:

Kligler Rojo de Metilo Voges Proskahuer

A Ac/Ac con gas
B Alc/SC sin gas
C Alc/Ac sin gas
D Alc/Ac con gas
E Ac/Ac con gas
+ -
- -
+ -
- +
- +

A partir de los resultados obtenidos:

a) Qu caractersticas metablicas puede inferir para cada uno de los microorganismos

aislados ?.

b) De qu otra forma podra determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los
cinco microorganismos ?.

5) Discuta las siguientes afirmaciones;

a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos cidos generados
por la fermentacin de la lactosa.

b).Los resultados de las pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer a diferencia de la

prueba de agar hierro Kligler son independientes del tiempo de lectura.

c) La aparicin de un producto coloreado en la primera parte de la prueba de reduccin del

nitrato se considera positiva.

6) En una placa sembrada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta

contaminacin con Pseudomonas aeruginosa. Indique por lo menos 3 pruebas bioqumicas y
los resultados esperados de las mismas que le permitiran comprobar que se trata de estos dos
microorganismos.

7) A partir de una muestra de agua se realiza un cultivo de enriquecimiento en caldo Mac

Conkey, el cual es sembrado en placas de agar EMB-Levine , obtenindose los siguientes

resultados:

.- Colonias transparentes.
.- Colonias con centro pardo-grisceo sin brillo metlico.
.- Colonias con brillo verde metlico.
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a) Sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias qu componentes del medio de
cultivo utilizan los microorganismos para su crecimiento?. Explique.
b) En caso de que posean un metabolismo fermentativo, podra inferir que tipo de fermentacin
realizan y a qu colonias corresponden los microorganismos con esas caractersticas?. Explique.
c) Qu pruebas bioqumicas empleara para verificar el tipo de fermentacin, qu colonias
utilizara y cul sera el resultado de dichas pruebas en cada caso?.
d) Qu caractersticas deberan tener los microorganismos aislados para poder ser identificados
empleando un test multiprueba API 20 E.

RASTREO DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS

1) Las enzimas responsables de las hidrlisis de los sustratos ensayados en el TP 7 son exo o
endocelulares? Justifique
2) Puede el mtodo ensayado dar resultados cuantitativos? Qu debe tener en cuenta?
3) Puede Ud sugerir un ensayo para evaluar la hidrlisis de gelatina como sustrato proteico en
placa
4) Qu otras actividades enzimticas podra ensayar en placa como mtodo de rastreo?

ANTIBIOTICOS

1) Disee un protocolo para determinar la concentracin inhibitoria mnima de un antibitico

para un determinado microorganismo. Este protocolo es aplicable en el caso de un
bacteriosttico, un bactericida ltico y un bactericida no ltico ?.

2) Para obtener un cesped de un microorganismo se siembra con hisopo una placa

conteniendo: agar, glucosa, NH4Cl, MgSO4, K2HPO4 y se aplican distintos discos de papel
embebidos con diferentes cantidades de un determinado antibitico. Luego de 48 horas de
incubacin se observa un halo de inhibicin alrededor del disco que contiene 5 g de
antibitico. Cuando se hace lo mismo pero utilizando un medio que contiene agar, triptona y
extracto de levadura, se observa un halo de inhibicin del mismo tamao que el anterior
recin alrededor del papel que contiene 50 g del antibitico. Discuta las posibles
explicaciones para estos resultados.

3) Disee un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un
compuesto con actividad antibitica. Cmo determinara si dicho compuesto es bactericida
o bacteriosttico ?.

4) Se dispone de dos cultivos bacterianos: uno en estado de crecimiento estacionario y otro en

estado de crecimiento exponencial. Si se agrega la misma concentracin de penicilina en
ambos cultivos Que resultados esperara obtener ?. Grafique y explique.

5) Se inoculan caldos nutritivos con Staphylococcus aureus y se incuban a 37 C, tomando

alcuotas a distintos tiempos para medir nmero de clulas viables y D.O. A los 120 minutos
(fase log) se agregan a cada cultivo diferentes agentes: a) penicilina, b) cloranfenicol, c)
solucin fisiolgica. A los 240 minutos, los cultivos se centrifugan a baja velocidad, se
resuspenden en un volumen igual de medio fresco y se contina la incubacin. Esquematice
las curvas de crecimiento esperadas en cada caso (nmero de clulas viables y D. O.).
Justifique.
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6) Qu efecto espera obtener si se agrega en forma combinada un bacteriosttico y un

antibitico de accin sobre sntesis de pared a un cultivo bacteriano en crecimiento
exponencial ?.

7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibicin 3 veces mayor para
el antibitico A que para el antibitico B. Qu conclusin se puede extraer de esta prueba ?.
Justifique.

8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por sntesis qumica con presunta actividad
antimicrobiana para bacterias gram negativas.

a) Cmo determinara cual de las tres presenta mayor actividad?.

b) Qu parmetros debera tener en cuenta en el ensayo experimental?.

c) Cmo determinara su mecanismo de accin?.

9) a) A qu se debe la aparicin de colonias dentro de la zona de inhibicin del crecimiento

en un ensayo de concentracin inhibitoria mnima?

b) Qu resultados esperara obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas
colonias en relacin a las que crecen por fuera del halo de inhibicin? Cmo la calculara?

Nota: Ud. esta trabajando con un cultivo puro

10) Debido al recorte presupuestario, la Ctedra de Microbiologa no pudo comprar las tiras
de E-Test Penicilina para la determinacin de la CIM (concentracin inhibitoria mnima).
Qu metodologa alternativa podra emplear para calcularla?. Explique detalladamente el
mtodo por Ud. propuesto. Nota: Se dispone de todo el material de laboratorio necesario.

11) Un antibitico A que acta por unin reversible a la subunidad menor del ribosoma
bacteriano se modifica qumicamente obtenindose una serie de compuestos distintos: B, C y
D.
Al realizar una prueba de sensibilidad en agar para un determinado microorganismo se
obtuvieron los siguientes dimetros (d en mm) en los halos de inhibicin: dA 25, dB 6, dC 30
y dD 6.
a) Qu conclusiones se pueden obtener a partir de estos resultados?. Justifique.
b) Cmo comprobara que C tiene ms actividad que A?. Explique brevemente.
Al determinar el mecanismo de accin de C se obtuvieron las siguientes curvas de DO600 nm (--
-) y log UFC/ml () en funcin del tiempo:

c) Qu tipo de actividad presenta C?. Justifique brevemente.

d) Cambi respecto de A?. Explique.

Nota: la flecha indica el tiempo de agregado de C.

FAGOS

1) Cul es el ttulo de un stock de fagos a partir del cual se cuentan 38 placas de lisis en la
dilucin 10-5 ?. Volumen de inculo 0,1 ml.
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2) Si un lisado de ttulo 5 x 108 UFP/ml se utiliz para infectar a una moi = 20 Qu cantidad
de bacterias fueron necesarias para la infeccin ?.

3) Se dispone de 5 ml de un stock de fago T4 para titular, el cual es diluido 1 : 5 . A partir de

esta dilucin se realizan diluciones seriadas al dcimo ( 10-1 a 10-8) y se siembran 0,2 ml en
agar blando, por duplicado. Los resultados obtenidos fueron:

Dilucin Nmero de placas de lisis

10-5 520-480
10-6 60-54
10-7 3-6
10-8 0-1

a) Calcule el ttulo del stock de fago. Qu esperara observar en las placas

correspondientes a diluciones menores que 10-5 ?.

b) Qu diluciones hara a partir del cultivo original para obtener 35 placas de lisis en una
placa de Petri ?.

4) Se preparan dos lisados del fago virulento P1. Del primero se obtienen 20 ml que se titulan
en placa con un recuento de 50 playas de lisis en la dilucin 10-6. Del segundo se obtienen 2.5
ml que se diluyen al medio con solucin fisiolgica y se titula en placa con un recuento de
200 playas de lisis en la dilucin 10-6. Cul de los dos lisados tiene mayor nmero de UFP
totales? (Volumen de inculo = 0,1 ml).

Si es necesario infectar a una m.i. = 5 Qu cantidad de bacterias utilizara para cada uno de
los lisados?. (Considere volumen de inculo = 0,1 ml para fagos y bacterias).

5) Se prepara un nuevo stock de fagos utilizando un cultivo bacteriano susceptible cuyo

recuento en placa es de 108 UFC/ml y un viejo stock cuyo ttulo es 1010 UFP/ml, de manera
de aumentar el ttulo.

Protocolo: Volumen de cultivo bacteriano infectado: 10 ml. Inculo del viejo stock: 0.1 ml de
una dilucin 10 1. Tiempo de incubacin a 37 C: 5 horas. El lisado obtenido es centrifugado
y filtrado.

a) Qu rango de 3 diluciones debera plaquear para poder verificar que el ttulo aumento un
orden?.

b) Qu multiplicidad de infeccin utiliz al preparar el stock?

6) Se dispone de un stock de fagos con un ttulo de 106 UFP/ml. Se desea preparar un nuevo
stock de mayor ttulo teniendo en cuenta que cada bacteria sensible produce 300 fagos. Para
ello se cuenta con un cultivo de bacterias en fase exponencial con 5x109 bacterias/ml. La
preparacin de dicho stock se realiza mezclando 1 ml del stock original con 1 ml de la
dilucin del cultivo bacteriano que garantice un fago por bacteria ( mi = multiplicidad de
infeccin = 1).

a) Qu diluciones tendra que realizar para obtener una mi = 1 ?. Indique los volmenes.
b) Qu diluciones del nuevo stock de fagos hara para determinar el ttulo viral ?. Indique
los volmenes.
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RECUENTO DE BACTERIAS

1) Se dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 108 UFC/ml. Qu diluciones debera

realizar para contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha
dilucin ?.

2) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 108 UFC/ml : Cmo procedera para obtener
80 colonias en una placa de agar nutritivo ?. Indique los volmenes a utilizar.

3) Qu dilucin debera realizar para obtener 2 ml de una suspensin de bacterias que contenga
2 x 105 UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml ?.

4) Un cultivo bacteriano se diluye 1/4. A partir de esa dilucin se realizan diluciones seriadas al
dcimo. Se siembra 0,1 ml de cada dilucin en placas de agar nutritivo por triplicado
obtenindose los siguientes resultados:

Nmero de colonias
Dilucin
Placa 1 Placa 2 Placa
3
10-4 621 546 356
10-5 64 56 68
10-6 5 9 4

Qu dilucin elegira para calcular las UFC del cultivo original ?. Justifique su eleccin.

5) Un cultivo bacteriano de 10 ml tiene un recuento de 250 UFC cuando se plaquea 0,1 ml de la

dilucin 10-4 . Si 2 ml de ese cultivo se inoculan en 100 ml de medio fresco para realizar una
curva de crecimiento: Cul es la concentracin bacteriana inicial ?. Qu diluciones realizara
del mismo para contar 100 colonias si sembrara 0,1 ml ?.

6) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 106 bacterias lcticas viables
/ ml.

Qu mtodo de recuento utilizara para corroborar ese nmero ?. Describa el protocolo,

condiciones y materiales que utilizara para realizar dicha determinacin.

7) Enumere las ventajas y desventajas de los siguientes mtodos de recuento de bacterias: i)

turbidez, ii) recuento en placa, iii) conteo directo al microscopio.

8). Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibracin de
recuento en placa vs. turbidez (D.O. leda a 600 nm). A partir de la misma se establece una
relacin UFC./ml por unidad de D.O. de 4. 107

a) Qu ventajas tiene realizar una curva de calibracin de recuento vs. turbidez?

b) Que diluciones debera realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo
sembrada con 0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5.

9) Un investigador dispone de una curva de calibracin de DO vs UFC/ml para E. coli en caldo

nutritivo. Podra utilizar la misma curva para un cultivo de: Bacillus megaterium y otro de
Micrococcus luteus ?. Justifique su respuesta.
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10) Un cultivo de Klebsiella pneumoniae en fase exponencial tiene una DO = 0,2 medida a 600
nm. Al realizar un recuento en placa se contaron 40 colonias al sembrar 0,2 ml de la dilucin 4
del cultivo original.
a) Calcular las UFC/ml
b) Calcular las UFC totales si el volumen del cultivo original es de 3 ml.
c) Qu diluciones debera realizar a partir del mismo cultivo de Klebsiella pneumoniae cuando
alcanza una DO = 0,5 para contar en una placa 100 colonias.
d) En un cultivo exponencial de Baccillus megaterium que tiene una DO = 0,5 esperara obtener
ms o menos UFC/ml que en el cultivo de Klebsiella pneumoniae que tiene igual DO?. Por
qu?.

11) En un laboratorio un tcnico realiza el anlisis de una muestra de agua debiendo informar el N
ms probable (NMP) de coliformes totales/100 ml. Para ello el tcnico us el mtodo de Wilson
empleando el caldo McConkey como indicador de coliformes:

Diluciones de la muestra TC -1 -2 -3 -4
Tubos sembrados 3 3 2 2 2
Volumen sembrado (ml.) 1 1 1 1 1
Positivos en McConkey 37C 3 3 2 0 0

A partir de estos resultados calcular el NMP de coliformes totales.

12) Con el objeto de investigar una eventual contaminacin de las aguas de un afluente del
Riachuelo, se tom una muestra y se procedi a analizarla empleando el caldo Brila Fluorocult. El
protocolo y los resultados fueron los siguientes:

N de tubos Vol. (ml.) Dil. Nmero de tubos positivos Caldo Brila 37 C

sembrados
3 10 100 3
3 1 100 3
3 1 10-1 3
3 1 10-2 1
3 10 10-3 1
3 1 10-3 0
3 1 10-4 0

Calcular el N ms probable (NMP) de coliformes totales cada 100 ml.

13) Se realiza un recuento de Pseudomonas a partir de una muestra de agua de pozo empleando
caldo M9 glicerol/asparragina, obtenindose los siguientes resultados:

N de tubos sembrados Vol. (ml.) Dil. Nmero de tubos

positivos
3 0,01 10-1 3
3 1 10-2 3
3 0,1 10-3 3
3 1 10-3 3
3 0,01 10-3 2
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3 1 10-6 1
3 0,01 10-4 1

Calcular el NMP de Pseudomonas/100ml de agua.

INMUNOLOGA

1) Indique:

a) Cmo procedera para verificar la efectividad del proceso de purificacin de un antgeno

bacteriano soluble?

b) Cmo procedera para cuantificar un antgeno bacteriano soluble utilizando una tcnica
inmunolgica?

2) Un paciente con Salmonellosis concurre a un laboratorio A y le informan que el ttulo de

anticuerpos en el suero es de 64 usando la tcnica de aglutinacin con una suspensin de
Salmonella typhi como Ag. Asustado el paciente concurre a otro laboratorio B ese mismo da
donde le informan que el ttulo es 256 usando tambin Salmonella typhi como Ag. para la
reaccin de aglutinacin. El paciente est desconcertado. Qu explicacin le dara a Ud. a
este paciente?

3) A partir de un suero humano se desea purificar la albmina. Dicho suero es sometido a

tres pasos de purificacin sucesivos.

Cmo determinara la concentracin de albmina despus de cada paso de purificacin?

Nota: Ud. dispone de: antisuero anti humano total, antisuero monoespecfico anti albmina
humana, albmina humana purificada de origen comercial de concentracin conocida, agar,
solucin fisiolgica, material de vidrio y micropipetas.

4) Se inmuniza un conejo con una suspencin de Salmonella typhi.

a) Cmo estudiara la cintica de aparicin de anticuerpos sricos anti-flagelos a fin de

determinar el momento en que se obtiene el pico mximo de la respuesta inmune?

b) Qu indicara la obtencin de 6 bandas de precipitacin en una inmunodifusin

unidimensional doble cuando se enfrenta un lisado de S. typhi. con el suero inmune obtenido?

c) Qu tcnica empleara para saber si S. typhi. comparte determinantes antignicos con

S.newport? Describa brevemente la tcnica elegida usando como control suero normal.

d) Cmo determinara la concentracin del antgeno flagelar presente en varios lisados de S.

typhi. obtenidos por distintos mtodos? Describa brevemente la tcnica que empleara.

5) Qu metodologa empleara para:

a) Detectar anticuerpos anti una protena soluble de pneumococos en el suero de un cobayo

inmunizado con dicha bacteria. Enumere y d el fundamento de las tcnicas que conoce para
dicho fin.

b) Determinar la concentracin de IgE humana en muestras obtenidas de pacientes alrgicos.

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D el fundamento del mtodo elegido y esquematice el protocolo de trabajo.

7) Se inyectan 2 conejos con Salmonella newport siguiendo distintos esquemas de

inmunizacin. Luego de la ltima inoculacin se sangran los animales y se obtienen los
sueros.

Cmo determinara cul de los dos animales alcanzo el ttulo ms elevado de anticuerpos anti
Salmonella newport? Describa brevemente la tcnica empleada y cmo expresara los
resultados.

8) En el estante de una congeladora del laboratorio de Microbiologa se encontraron 2 tubos

rotulados de la siguiente manera: Suero anti Salmonella N 1 y Suero anti Salmonella N 2.

a) Sabiendo que all se trabaja con 2 especies de dicha bacteria : Salmonella schottmulleri y
Salmonella typhi, Podra Ud. determinar que especie de Salmonella se emple para obtener
cada antisuero ?. Qu tcnica empleara ?. Expliquela brevemente. Describa los resultados
que le permitiran identificar ambos antisueros.

Nota: Las bacterias presentan los siguientes antgenos

Salmonella schottmulleri: Antgeno O (determinantes antignicos 1, 4, 5 y 12).

Salmonella typhi: Antgeno O ( determinantes antignicos 9 y 12) y Antgeno Vi.

b) Cmo determinara cual de los 2 antisueros tiene mayor ttulo aglutinante ?. Qu

tcnica empleara ?. Explique brevemente.

c) Si los antisueros fueron hechos en conejo, Cmo determinara la concentracin de IgG en

cada suero ?. Explique la tcnica.

PROBLEMAS TIPO PARCIAL

PROBLEMA 1

Se desea estudiar la efectividad de un mtodo de irradiacin para esterilizar arroz. Para ello se
dispone de tres muestras de arroz esterilizadas en autoclave (5 g/ 8,5 ml), de 10 ml de un cultivo de
E. coli con un recuento de 50 UFC cuando se plaquean 0,1 ml de la dilucin 10-6 y de 5 ml de una
suspensin de esporas de B. cereus de 4x107 esporas/ml. Cada una de las muestras de arroz
esterilizadas se inocul con 1 ml del cultivo de E. coli y con 0,5 ml de la suspensin de esporas y se
someti a una dosis diferente de radiacin. Al cabo de los respectivos tratamientos se cuantific en
cada muestra el nmero de UFC totales de E. coli y de B. cereus sobrevivientes obtenindose los
siguientes resultados:

Tratamiento 1 2 3
E. coli 2,5x104 ND ND
B. cereus 2,5x104 2x102 ND
ND= no detectable.

a) Discuta sobre la efectividad de cada uno de los tratamientos como mtodo de esterilizacin.
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b) Cul es la carga bacteriana total con que se inocul cada muestra antes de someterlas a la
radiacin?.
c) Describa el protocolo para hacer los recuentos de los sobrevivientes justificando los pasos que
realizara. Indique volmenes, diluciones, medios de cultivo empleados con la funcin de sus
constituyentes.
d) Ud. dispone de una cuarta muestra de arroz esterilizada en el autoclave simultneamente con las
otras tres muestras. Qu tipo de control le realizara previamente a dicha muestra para garantizar
que los sobrevivientes de las otras muestras provienen de la inoculacin artificial?

PROBLEMA 2

Se sembraron en agar Mossel sin polimixina B los siguientes microorganismos:

Cepas patrn de ensayo Color del medio Precipitado

Bacillus cereus rosadas +
Bacillus cereus variedad mycoides rosadas +
Bacillus subtilis amarillas -
Escherichia coli rosadas -
Pseudomonas aeruginosa rosadas -
Proteus mirabilis rosadas -
Staphylococcus aureus amarillas +

a) Cul es la fuente de carbono que permite el crecimiento de cada uno de los

microorganismos en este medio? Cul es la relacin con el color de las mismas?
b) Qu paso realizado en el aislamiento del TP para Bacillus disminuye la aparicin de la
flora acompaante en este medio sin polimixina?

PROBLEMA 3

A partir de una muestra de agua del lago de Palermo se prepar una dilucin 10-2 y se sembr por
rastrillado 0,1 ml de dicha dilucin en tres placas con los siguientes medios:

Agar nutritivo Agar Mac Conkey Agar Cetrimida

62 colonias 38 colonias 5 colonias

a) Indique cmo esterilizara dichos medios.

Explicar a qu se deben las diferencias observadas en el n de colonias que aparecen en cada medio
considerando que se inocul la misma cantidad de muestra en cada uno.

b) Describa todos los tipos de morfologa de colonias que podran encontrarse en la placa con agar
Mac Conkey explicando a qu se deben las diferencias.

c) Describa un protocolo para cuantificar el nmero de esporas presentes en 10 ml de la muestra de

agua.