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Version n1 du 21072011
Mode opratoire :
Recherche de
Vibrio Cholerae dans lenvironnement hydrique
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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement
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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement
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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement
1.1. Contexte
Les pidmies de cholra sont rcurrentes dans les pays du bassin du lac Tchad, en particulier depuis une
vingtaine dannes. Les sources de contamination et les modes de transmission sont encore mal compris,
malgr les hypothses proposes ds les annes soixante-dix portant sur la contamination des ressources
hydriques et le rle potentiel de la contamination interhumaine par les aliments partages/eau dans les
pidmies de cholra en zone subsahlienne.
En 2011, Action contre La Faim participe la rponse oprationnelle lpidmie de cholra au Tchad.
En parallle, des actions de rponses de terrain un programme de recherche oprationnelle a t mis en
place pour prolonger ce travail de capitalisation qui a dbut en janvier 2011. Un travail collaboratif est
ralis avec lUniversit de Franche Comte, pour lorientation et la rdaction de ce travail pilote en
microbiologie de lenvironnement, ainsi quun soutien oprationnel et technique est apport par la
Fondation Veolia Environnement, dans le cadre de ces travaux pour la Global Alliance Against Cholera
(http://www.choleraalliance.org/).
Le rle de la microbiologie de lenvironnement dans la lutte contre le cholra peut apporter des informations
pour la prise de dcision oprationnelle et assoir ainsi les recommandations sur la prvention du risque de
transmission auprs des populations exposes. Il est une partie intgrante dune approche transversale
pour la rponse aux questions de sant publiques.
Ce travail pilote na jamais t ralis au Tchad, et participe au dynamisme des capacits de recherche et
lchange des comptences et dau sein des laboratoires inclus dans le projet.
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1.2. Objectifs
Le protocole sera msie en deux tapes : tout dabord valid en laboratoire avec la participation de plusieurs
techniciens danalyses microbiologiques du laboratoire de Recherche vtrinaire et zoologique de Farcha
Ndjamena, et ensuite mis en application dans une phase pilote a partir de diffrents prlvements
environnementaux provenant de campagne dchantillonnage de terrain.
Le but de ce travail est de valider et doptimiser le mode de prlvement et danalyse afin de pouvoir
tablir la prsence/labsence du Vibrio Cholerae dans des prlvements provenant de diffrents milieux
hydriques tels que leau de marre, de fleuves au point de puisage, les puits utiliss pour la consommation
humaine ou des jarres de conservation de l eau au sein du domicile.
La validation de ces deux mthodes se fera en plusieurs tapes, comme dcrites dans la figure n 1 ci-
dessous. Ces diffrentes tapes permettront de valider :
la prsence de Vibrio cholerae O1 laide de la mthode qualitative (sur des solutions titres et sur
des chantillons prlevs sur le terrain, voir en annexe K).
valider la mthode quantitative aprs le calibrage laide de standard Mac Farland et de solutions
titres (voir annexe J).
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Mthode quantitative
Le dtail de la rpartition des diffrentes solutions titres et des chantillons terrain est donn dans le
tableau de lannexe h, rpartition des consommables.
La validation de ces deux mthodes devra galement permettre dajuster les temps et dures des
diffrentes tapes danalyse afin doptimiser le chronogramme initial dfinit au chapitre 3.
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La validation de ces deux mthodes sera effectue dans le Laboratoire de Recherche vtrinaire et
zoologique de Farcha Ndjamena (LRVZ).
Cette tape de validation des techniciens microbiologistes du Laboratoire de Rfrence de Ndjamena
(Microbiologie humaine) et du LRVZ (Microbiologie environnementale et animale) permettra de raliser le
protocole et doptimiser sa mise en place.
La formation permettra aux techniciens (3 binmes) de tester les deux mthodes comme indiqu dans le
programme danalyse de lannexe L.
Les deux tapes prcdentes seront ensuite suivies dune campagne de prlvements de terrain pour la
recherche et la quantification, qui permettra dapprofondir les connaissances sur la transmission hydrique.
La ralisation de la mthode quantitative (pour les chantillons positifs par la mthode qualitative) est
base sur duplicate de chaque prlvement, pour lesquels le codage des duplicates sera important, la
conservation durant la ralisation de la mthode qualitative (temprature, ambiante/ abris de la lumire/
volume
Ce tableau correspond une projection indicative des analyses raliser. Une adaptation
lpidmiologie de la maladie sur le terrain peut amener une modification du type et du nombre
de prlvements.
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Prlvement
enrichissement"
Incuber 16h 30 C
de"titration"
membrane,
procder des
dilutions afin
a.Les colonies supectes apparraissent jaunes et plates et dgradent la d'encadrer le
saccharose. rsultats, et
b.Dnombrer l'ensemble des colonies suspectes pour chaque boite, ensuite appliquer ensuite
additionner les rsultats afin d'obtenir la concentration pour un litre un facteur correctif
Echantillon
d'chantillon. au rsultats du
ngatif
c. Repliquer une colonie supsecte par boite de glose TCBS 1, sur une glose dnombrement
non slctive GNA 1, afin de procder l'identification de la colonie suspect.
Agglutination
Incuber 24h 36 C
Rsultat
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Les rcipients doivent tre autoclavable, afin de pouvoir tre strilis ou usage unique. dfaut,
utilis des bouteilles deau minrale non usages.
Transport et conservation :
Les chantillons doivent tre transports dans une glacire ferme ( labri de la lumire) contenant
des pains de glace afin de maintenir une temprature infrieure 10C et arriver au laboratoire
moins de 12h aprs prlvement.
La glacire de transport doit tre lave et dsinfecte aprs chaque journe dutilisation (solution de
nettoyage 0.1% en chlore : dissoudre 1.5 gr de Hypochlorite de Calcium dans un litre deau).
Une traabilit des chantillons devra tre mise en place systmatiquement (fiche de suivi par
chantillon comportant le lieu, la date, lheure de prlvement ainsi que le nom du prleveur) et
lensemble des informations devra tre report sur un fichier regroupant lensemble des
informations.
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4. Mode opratoire pour lisolement du Vibrio Cholerae dans des chantillons deau
4.1.1. Filtration
Noter la date sur le cahier de paillasse, le codage, le type d chantillon et la provenance + initiale du
technicien sur la page ddie lchantillon
Noter les paramtres physico chimique (pH, Turbidit, salinit, temprature)
Filtrer un litre dchantillon sur des membranes de porosit 0.22 m. Si lchantillon est turbide, il
est possible dutiliser plusieurs membranes afin de pouvoir filtrer 1l sur au maximum de 5
membranes.
Placer les membranes enroules dans 50 ml deau pep tonne alcaline puis agiter vigoureusement.
Incuber pendant 16h 30C
4.1.2. Ensemencement
Sortir les chantillons de ltuve sans les agiter (!). En effet, les Vibrions se situent en surface le
surnageant est un film blanchtre la surface de la colonne de liquide.
Collecter le dveloppement en surface laide dune oeuse strile
procder un isolement en stries sur une boite de glose TCBS (il est prfrable davoir des boites
de 90 mm de diamtre car cela permet de meilleur isolement).
4.1.3. Lecture
,
tat frais : Aspect monomorphe, vol de moucherons du au flagelle polaire
Coloration de GRAM :=ngatif, flore monomorphe, de bacilles fins, en virgules
Sont considres comme colonies suspectes les colonies plates, lisses et de couleur jaune faisant
fermenter le saccharose1. Si les colonies ne sont pas correctement isoles, procder un nouvel
isolement sur glose slective TCBS.
Pour les tests de confirmation, il faut absolument travailler sur des souches pures.
ce moment la filtration et mise en culture pour la mthode quantitative pour les chantillons
suspects dtre positif.
4.1.4. Confirmation
Repiquer 3 colonies suspectes sur des gloses non slectives de type GNA2 pour identification
Incuber 16 24h 37C.
Aprs incubation, raliser test loxydase et la coloration de Gram3.
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Ce caractre biochimique discriminant avec lensemble des autres vibrio ( lexception de Vibrio Mimicus) ne sera pas
test
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Voir document en annexe
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Voir document en annexe
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Si les tests doxydase et de coloration de Gram sont concluants, le test de mobilit et le test au latex sont
raliss .pres le test au latex Si les rsultats de sont pas concluant faire une galerie API 20E.
Test au Latex
Une fois les vibrio cholerae identifi, il convient, de vrifier leur appartenance au serogroupe (O1 ou 139)
laide du texte Latex, seul srogroupe responsable du cholra chez lhomme.
Lanalyse quantitative sera ralise sur le deuxime chantillon (qui sera stock en chambre froide), lorsque
le premier chantillon, analys par la mthode qualitative, apportera un rsultat positif au premier
ensemencement.
4.2.1. Filtration
Filtrer un litre dchantillon sur des membranes de porosit 0.22m. Si lchantillon est turbide, il est
possible dutiliser plusieurs membranes afin de pouvoir filtrer 1 litre. Toutefois, un nombre
maximum de 5 membranes sera utilis, il est donc important de reporter sur le cahier de paillasse le
volume exact filtr afin de pouvoir exprimer ensuite le rsultat en nombre de colonies pour 100 ml.
Chaque membrane devra tre mise en culture indpendamment sur des boites de glose TCBS4 de
55mm
Incuber 37C pendant 24h.
4.2.2. Lecture
Les colonies suspectes apparaissent jaunes et plates, avec un halo.
Dnombrer les colonies suspectes sur chaque boite et additionnez les rsultats afin de connaitre la
concentration en vibrion prsent dans le volume filtr. Exprimer ensuite le rsultat en nombre de
colonies pour 100 ml (noter le comptage brutes et le nombre dUFC pour 100 ml)
Si un trop grand nombre de bactries sont prsentes sur les membranes rendant leur lecture impossible,
raliser des dilutions selon le schma ci-dessous :
Slectionner trois volumes en fonction de la charge bactrienne observe lors de la premire filtration.
4.2.3. Confirmation
Repiquer les colonies suspectes sur une glose non slective type GNA5.
Incuber 24h 37C.
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Voir document en annexe
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Voir document en annexe
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Une fois les vibrio cholerae identifi, il convient, de vrifier leur appartenance au serogroupe O1 laide du
texte Latex.
Les souches de vibrio cholerae isoles partir des chantillons environnementaux peuvent tre conserves
sur des boites de glose GNA pour des conservations court terme ou congel -80C (dans un bouillon
10% de glycrol) pour une conservation long terme.
Une alternative dans la conservation des collections de souche pure est lutilisation de glose de
conservation tubes de glose conservation (BIORAD 63683) la temprature ambiante et labri de la
lumire.
5. Bibliographie
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Annexes
DOMAINE DUTILISATION
La glose au Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose (TCBS) constitue un milieu slectif destin lisolement de
Vibrio cholerae et des autres vibrions entropathognes (en particulier Vibrio parahaemolyticus) dans les
poissons, les produits de la mer et les autres prlvements biologiques dorigine animale.
HISTORIQUE
La formule dorigine, mise au point par Nakanishi, a t modifie ultrieurement par Kobayashy et al. pour
lisolement slectif des Vibrio pathognes.
PRINCIPES
- Les concentrations leves en thiosulfate et en citrate de sodium ainsi que la forte alcalinit du milieu
inhibent fortement la croissance des entrobactries.
- La bile de boeuf et le chlorure de sodium ralentissent la culture des entrocoques et inhibent le
dveloppement des germes Gram positif.
- Par acidification du milieu, rsultant de la fermentation du saccharose, les Vibrio provoquent le virage au
jaune de lindicateur au thymol et au bleu de bromothymol.
- partir du thiosulfate, qui constitue une source de soufre, la production de sulfure dhydrogne est
rvle en prsence de citrate ferrique. Tous les Vibrio sont H2S-ngatifs.
MODE DEMPLOI
- Refroidir et maintenir le milieu 44-47C.
- Couler en botes de Petri striles.
- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire scher les botes ltuve, couvercle entrouvert.
- Ensemencer linoculum par talement en surface.
- Incuber 37C pendant 18 24 heures, labri de la lumire.
- sortir les boites en avance
LECTURE
Les colonies prsentent les aspects suivants :
Caractristiques Microorganismes
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FORMULE TYPE
(Pouvant tre ajuste de faon obtenir des performances optimales)
Pour 1 litre de milieu :
- Polypeptone ...................................................................................10,0 g
- Extrait autolytique de levure.............................................................5,0 g
- Saccharose ....................................................................................20,0 g
- Bile de boeuf bactriologique ...........................................................5,0 g
- Cholate de sodium ...........................................................................3,0 g
- Citrate de sodium...........................................................................10,0 g
- Thiosulfate de sodium....................................................................10,0 g
- Chlorure de sodium........................................................................10,0 g
- Citrate ferrique ammoniacal .............................................................1,0 g
- Bleu de bromothymol ..................................................................40,0 mg
- Bleu de thymol ............................................................................40,0 mg
- Agar agar bactriologique..............................................................14,0 g
pH du milieu prt--lemploi 25C : 8,6 0,2.
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NUTRITIVE (GELOSE)
Milieu dusage courant qui peut tre enrichi avec 10 % de sang ou autres liquides biologiques.
COMPOSITION (grammes/litre)
Extrait de viande de buf 1,0g
Extrait de levure 2,0g
Peptone 5,0g
Chlorure de sodium 5,0g
Agar 15,0g
pH 7,4 0,2
PREPARATION
Verser 28 g de poudre dans un litre deau distille et porter bullition jusqu dissolution complte.
Striliser 15 minutes 121C lautoclave.
DESCRIPTION
La glose nutritive sert de milieu de culture de base pour repiquer les souches conserver, ou pour vrifier
la puret des subcultures avant deffectuer des tests biochimiques et srologiques. Ce milieu sous forme
semi-solide est utilis en tubes inclins (culot et pente) pour conserver des souches de rfrence.1
La glose nutritive contient 1,5 % dAgar et peut tre supplmente si ncessaire avec 10 % de sang ou
autres liquides biologiques. Ce milieu utilis sans additif convient la culture des germes qui ne prsentent
pas dexigence nutritive particulire.
Voir aussi la Glose de base au sang n2 (CM0271) pour un milieu plus riche en lments nutritifs.
CONSERVATION
Conserver le milieu dshydrat 1025C jusqu la date de premption indique sur le flacon. Conserver le
milieu prt lemploi 28C.
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c. Coloration de Gram
MATERIEL
LAMES, COLORANTS, EVIERS ET BAC EN VERRE.
MODE OPERATOIRE
RESULTAT
LES BACTERIES GRAM + SONT COLOREES EN VIOLET FONCE, LES BACTERIES GRAM - SONT COLOREES EN
ROSE, CECI ETANT DU A UNE DIFFERENCE DE COMPOSITION DE LA PAROI
LORSQUE L'ON COLORE PEU DE LAMES, PLUTOT QUE D'IMMERGER LES PREPARATIONS, ON PEU LES
RECOUVRIR DE COLORANTS. LE DECOLORANT DOIT ETRE CHANGE CHAQUE JOUR.
RISQUES D'ERREURS
REACTIFS
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SOLUTION A :
Violet de gentiane 2 g
Alcool 95 20 ml
SOLUTION B :
MELANGER LES SOLUTIONS A ET B, LAISSER REPOSER 24 HEURES AVANT L'EMPLOI, VERSER A TRAVERS UN
PAPIER FILTRE DANS UN FLACON.
Iode 1 g
Iodure de potassium 2 g
Eau distille 300 ml
DISSOUDRE D'ABORD L'IODURE DE POTASSIUM DANS ENVIRON 30 ML D'EAU DISTILLEE, AJOUTER L'IODE
ET MELANGER JUSQU'A DISSOLUTION. AJOUTER LE RESTE D'EAU DISTILLEE, MELANGER.
CONSERVER DANS UN FLACON EN VERRE BRUN OU EN PLASTIQUE OPAQUE (A L'ABRI DE LA LUMIERE).
3- SOLUTION DE SAFRANINE
SOLUTION A :
Safranine O 2,5 g
Alcool 95 qsp 100 ml
SOLUTION A BIS :
Solution A 10 ml
Eau distille 90 ml
4- DECOLORANT
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d. Test doxydase
PRINCIPE
-. Il permet de mettre en vidence une enzyme : la phnylne diamine oxydase des bactries partir de leur
culture en milieu glos. Cette enzyme est capable doxyder un ractif : le N dimthyl paraphnylne
diamine.
MODE OPERATOIRE
RESULTAT
- Si la colonie prend une teinte rose, violette. Le germe possde une oxydase : le test est positif.
- Si la colonie reste incolore, le germe ne possde pas doxydase, le test est ngatif.
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e. Test au latex
REACTIFS
MODE OPERATOIRE
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f. Ensemencement en strie
Source : http://www.commentfaiton.com/fiche/voir/10003/comment_ensemencer_un_milieu_solide_par_la_methode_des_stries_d_isolement)
ALLUMEZ LE BEC BUNSEN EN PRENANT SOIN D'OBTENIR UNE FLAMME BLEUE, AFIN DE STERILISER L'AIR
ALENTOUR DANS UN RAYON DE 10 CENTIMETRES.
VOUS NE DEVEZ PAS VOUS ECARTER AU-DELA DE CE SECTEUR, FAUTE DE QUOI VOUS RISQUERIEZ DE
CONTAMINER VOTRE BOITE DE PETRI.
RAPPELEZ-VOUS QUE VOUS AVEZ MIS DE L'ALCOOL SUR VOTRE PLAN DE TRAVAIL ...
ESSAYEZ LE PLUS POSSIBLE DE NE PAS LA LAISSER OUVERTE DANS LE BUT D'EVITER TOUTE CONTAMINATION
INDESIRABLE.
INSCRIVEZ SUR LE COTE OU LE FOND DE LA BOITE A QUOI CORRESPOND LE CONTENU (NOM ECHANTILLON,
CONCENTRATION, DATE ...).
PASSEZ L'ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU'A CE QU'ELLE DEVIENNE INCANDESCENTE, DANS
LE BUT DE LA STERILISER.
PATIENTEZ QUELQUES SECONDES LE TEMPS QUE LA TEMPERATURE DIMINUE, PUIS PLONGEZ L'ANSE DANS
LA SOLUTION BACTERIENNE.
FAITES EN SORTE QU'UNE GOUTTELETTE RESTE "PRISONNIERE" DE LA BOUCLE DE L'ANSE. C'EST CE VOLUME
QUE VOUS ALLEZ ENSEMENCER SUR VOTRE MILIEU.
REFERMEZ LA BOITE DE PETRI, ET PLONGEZ A NOUVEAU L'ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU'A
L'INCANDESCENCE.
PATIENTEZ QUELQUES SECONDES, LE TEMPS QU'ELLE REFROIDISSE.
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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement
PLONGEZ A NOUVEAU L'ANSE DANS LA FLAMME DU BEC JUSQU'A INCANDESCENCE. PATIENTEZ QUELQUES
SECONDES LE TEMPS QU'ELLE REFROIDISSE.
COMME PRECEDEMMENT, FAITES DES STRIES DANS LE 3E ET DERNIER TIERS DE VOTRE BOITE,
EN PRENANT GRAND SOIN DE RECUPERER DE LA SOLUTION EN REPASSANT UNE SEULE FOIS SUR
L'EXTREMITE DE LA DERNIERE STRIE EFFECTUEE DANS LE 2ND TIERS.
UNE FOIS VOUS STRIES TERMINEES, REFERMEZ LA BOITE DE PETRI. PLONGEZ L'ANSE DANS LA FLAMME DU
BEC BUNSEN JUSQU'A SON INCANDESCENCE, ET POSEZ-LA SUR LE PRISME.
LES RESULTATS DEVRAIENT MONTRER DES COLONIES MULTIPLES ET REGROUPEES SUR LE PASSAGE DES
STRIES DU 1ER TIERS DE LA BOITE. PUIS, DANS LE 2ND TIERS, ELLES DEVRAIENT ETRE PLUS ESPACEES ET
DONC MOINS NOMBREUSES. LE DERNIER TIERS DEVRAIT ENFIN LAISSER APPARAITRE DES COLONIES ISOLEES,
ET PURES (NE CONTENANT QU'UN SEUL TYPE DE BACTERIE).
CES COLONIES DE BACTERIES PURES POURRONT PAR LA SUITE ETRE REPIQUEES POUR UNE ANALYSE PLUS
POUSSEE.
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Surnageant
boite de petri (90 mm) TCBS 67 7 3 4 60 60
Ensemensement
Boite de petri (50 mm)
avec milieu TCBS 116 56 8 4 8 16 20 60 60
(compter toutes les colonnies
caracteristiques / isolement 1)
Colonnies reprsentatives (colonnies jaunes)
3 3 3 3 3
(1.1/1.2/1.3)
441 21 9 12 60 60 360 180 180
Boite de petri (90 mm) GNA
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Ralisation d'une solution mre S0 par la mise en culture d'une souche de Vibrio
Jour 1 Cholerae (fourni gracieusement par le laboratoire de N'Djamena), dans de l'eau
peptonne alkaline
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Saisie infos suivi dans Saisie infos suivi dans Saisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier de
cahier de paillasse cahier de paillasse de paillasse de paillasse paillasse
Mthode qualitative
Mthode quantitative
Prparation et saisie de rsultats
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