Zieri R DR SJRP

Rodrigo Zieri
INFLUNCIA HORMONAL SOBRE O SISTEMA PIGMENTAR EM
Eupemphix nattereri (ANURA): EFEITOS DO ALPHA-MSH,
ESTRADIOL E TESTOSTERONA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE BIOCINCIAS, LETRAS E CINCIAS EXATAS
SO JOS DO RIO PRETO - SP
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA ANIMAL
RODRIGO ZIERI
INFLUNCIA HORMONAL SOBRE O SISTEMA PIGMENTAR EM EUPEMPHIX NATTERERI
(ANURA): EFEITOS DO ALPHA-MSH , ESTRADIOL E TESTOSTERONA
Tese apresentada para obteno do ttulo

de Doutor em Biologia Animal, rea de
Biologia Animal, junto ao Programa de
Ps-Graduao em Biologia Animal do
Instituto de Biocincias, Letras e
Cincias Exatas da Universidade
Estadual Paulista Jlio de Mesquita
Filho, Campus de So Jos do Rio
Preto.
ORIENTADOR: PROF. DR. CLASSIUS DE OLIVEIRA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. SEBASTIO ROBERTO TABOGA
- 2010 -
Zieri, Rodrigo.
Influncia hormonal sobre o Sistema Pigmentar em Eupemphix nattereri
(Anura): efeitos do MSH, estradiol e testosterona / Rodrigo Zieri. - So Jos do
Rio Preto : [s.n.], 2010.
106 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Classius de Oliveira

Co-orientador: Sebastio Roberto Taboga
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biocincias,
Letras e Cincias Exatas
1. Clulas pigmentares viscerais. 2. Anuro - Morfologia. 3. Eupemphix

nattereri. 4. MSH. 5. Estradiol. 6. Testosterona. I. Oliveira, Classius de. II.
Taboga, Sebastio Roberto. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de
Biocincias, Letras e Cincias Exatas. IV. Ttulo.
CDU 597.8
Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE

Campus de So Jos do Rio Preto - UNESP
RODRIGO ZIERI
Influncia Hormonal sobre o Sistema Pigmentar em Eupemphix nattereri (Anura):
Efeitos do alpha-MSH , Estradiol e Testosterona
BANCA EXAMINADORA
TITULARES:
Prof. Dr. Classius de Oliveira

Professor Adjunto
UNESP So Jos do Rio Preto
Orientador
Prof. Dr. Rejane Maira Ges,

Professor Adjunto
Prof. Dr. Patrcia Simone Leite Vilamaior

Professora Doutora
UNIRP So Jos do Rio Preto
Prof. Dr. Selma Maria Almeida Santos

Professora Doutora
Instituto Butantan So Paulo
Prof. Dr. Wagner Jos Fvaro

Professor Doutor
UNICAMP - Campinas
SUPLENTES:
Prof. Dr. Maria Terclia Vilela de Azeredo Oliveira

Professor Adjunto
Prof. Dr. Silvana Gisele Pegorin de Campos

Professora Doutora
UNICAMP So Jos do Rio Preto
Prof. Dr. Sandra Regina de Carvalho Marchesin

Professora Doutora
UNIRP So Jos do Rio Preto
So Jos do Rio Preto, 01 de junho de 2010

SUMRIO
Dedicatria ....................................................................................................................... i
Agradecimentos .............................................................................................................. ii
Epgrafe ............................................................................................................................v
Resumo .............................................................................................................................1
Abstract ............................................................................................................................2
1. Introduo ....................................................................................................................4
1.1. Panorama geral dos Anfbios ..................................................................................4
1.2. Eupemphix nattereri (Anura, Leiuperidae) .............................................................6
1.3. Sistema Pigmentar ..................................................................................................9
1.4. Sistema Pigmentar Extracutneo ..........................................................................13
1.5. Ao Hormonal .....................................................................................................15
1.6. Sistema Reprodutor Masculino .............................................................................16
1.7. Referncias Bibliogrficas ....................................................................................20
1.8. Objetivos ...............................................................................................................32
Captulo 1 .......................................................................................................................33
Resumo ........................................................................................................................35
Introduo ................................................................................................................ 36
Material e Mtodos ..............................................................................................37
Resultados ......................................................................................................40
Discusso ..................................................................................................43
Agradecimentos ....................................................................................47
Bibliografia .......................................................................................50
Captulo 2 .......................................................................................................................56
Resumo ........................................................................................................................58
Introduo ................................................................................................................ 59
Material e Mtodos ..............................................................................................60
Resultados .....................................................................................................63
Discusso .................................................................................................64
Agradecimentos ...................................................................................71
Bibliografia .....................................................................................72
Captulo 3 .......................................................................................................................77
Resumo ........................................................................................................................79
Introduo ...............................................................................................................80
Material e Mtodos .............................................................................................81
Resultados ......................................................................................................82
Discusso .................................................................................................84
Agradecimentos ...................................................................................86
Bibliografia ....................................................................................89
2. Concluses ..................................................................................................................95
Dedicatria
i
DEDICATRIA
Aos meus pais, Maria e Alcio, lies de vida.
Isabella. Estarei sempre ao seu lado.
Pequena Jlia, que teu caminho seja pleno de alegrias.
Zieri et al., 2010

Agradecimentos
ii
AGRADECIMENTOS
Nesse especial e particular momento, fruto de trabalho, alegrias, tropeos,
sonhos e principalmente amizades, exponho a minha ntima e honesta gratido a cada
pessoa denominada aqui e outras que deixei escondidas em minha memria, mas que
fizeram ou ainda fazem parte de minha vida.
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Classius de Oliveira, cujo papel foi de
fundamental importncia para minha formao acadmica e pessoal. Devo-lhe muita
gratido e respeito pela confiana depositada em mim durante todos esses anos. Voc
Exemplo a ser seguido.
Aos membros do Laboratrio de Anatomia que aqui esto e que por aqui
passaram, Lia Raquel de Souza Santos, Lilian Franco Belussi, Rafaela Maria Moresco,
Juliana Rodrigues de Souza, Juliane S. Freitas, Mariana Navarro, Silvia Rosana
Pagliarini Cabral, Carlos Eduardo Saranz Zago, Paula Omena e Aline Cristina Santana,
pelo aprendizado e companheirismo.
Especialmente s amigas Lia Raquel de Souza Santos e Lilian Franco Belussi,
pela amizade e cumplicidade. Obrigado pela oportunidade de termos crescidos juntos da
maneira mais harmnica possvel. Contem sempre comigo.
Ao meu co-orientador Sebastio Roberto Taboga, pelos ensinamentos e
disposio para ajudar sempre. timo profissional. Serei eternamente grato.
Ao Centro de Microscopia, coordenado pelo Professor Dr. Sebastio Roberto
Taboga, que nos abriu as portas durante toda a ps-graduao. Sendo de fundamental
importncia para a realizao deste trabalho.
Ao tcnico do Centro de Microscopia e amigo Luiz Roberto Falleiros Junior,
pela assistncia laboratorial, pela convivncia e pelos momentos de descontrao. Muito
obrigado.
Zieri et al., 2010

Agradecimentos
iii
Aos professores que participaram de minha formao, sinceros reconhecimentos
e gratido.
Ao amigo Michel Varajo Garey, pelo grande auxlio com as anlises
estatsticas. Obrigado irmo (Man).
Aos meus queridos e atuais companheiros de Repblica S/N ou Tromba
dgua, Michel Varajo Garey (praticamente um filho, que toma conta do pai), Fenanda
Vital Ramos de Almeida (nossa linda e esquecida cantora e ficloga), Nando Rodrigues
(irmo e bagu), Laura Elena Chavara Pizarro (soy de Costa Rica y no de Puerto Rico)
e Adriano Mondini (orgulho). Desejo vocs um futuro brilhante e espero nunca
desfazer esse lao que fizemos. Amo todos vocs.
Aos amigos da extinta Repblica Toca do Largato pelos muitos anos de
convivncia, sofrimentos, alegrias e festas (que no foram poucas). Uso novamente
aquela clebre palavra, que de fato resume tudo o que queremos um para o outro:
sucesso.
Aos meus irmos Alessandra e Adriano, por tudo que fizeram e que ainda fazem
por mim. Irmo caula assim mesmo. Amo vocs.
minha querida sobrinha e afilhada Jlia Zieri Carminati, que nos trouxe ainda
mais alegria. To pequena e j to importante.
Ao meu sobrinho, concebido pouco. Ser muito bem vindo.
Ao primo Arlindo Pedro Santana e ao cunhado Paulo H. Carminati, pela ajuda e
incentivo.
Aos queridos amigos que fiz durante a minha passagem pela universidade e que
continuam presente em minha vida de alguma forma. Em ordem alfabtica: Aline Magri
de Aguiar, Angelita Capobianco, Bianca C. Lisboa, Carmlia, Carolina Panin Candeira,
Caroline Vieira, Cintia Bittar, Denilson Fernandes Peralta, Fernando Martins Couto (in
Zieri et al., 2010

Agradecimentos
iv
memorian), Gabriel Queirz Pereira, Glaura S. Fernandes, Isabella Mariana de Assis,
Ligia Maria Winter, Luiz Fernando Fracassi Gelin (Gorgon), Luiz Gustavo Gorgatto da
Silveira, Mario Pinzn Scatena (Xur), Nadia Martins Lemes da Silva, Natalia de Seta,
Renata Ferrari, Renato Romero, Rita L. Peruquetti, Tiago da Silveira Vasconcelos,
Thais Bilalba, Vandmel e Tilangas: Ana Rita, Ferzinha, Ferzona, Kaiser, Marts e
Vivian.
trupe, Adriano Mondini, Aline Chimello Ferreira, Ana Carolina Buzzo
Marcondeli, Diego Augusto Lopes da Silva, Lilian Sayuri Ouchi de Melo e Raduan
Alexandre Soleman. Incentivadores, amigos, lindas pessoas. Amo vocs.
Finalmente s pessoas pelas quais tenho amor incondicional, Maria e Alcio.
Levo de vocs tudo de melhor que um filho poderia esperar. Pais verdadeiros em todos
os sentidos.
Zieri et al., 2010

Epgrafe
v
O ser humano vivncia a si mesmo, seus pensamentos como algo separado do
resto do universo, numa espcie de iluso de tica de sua conscincia. E essa iluso
uma espcie de priso que nos restringe a nossos desejos pessoais, conceitos e ao afeto
por pessoas mais prximas. Nossa principal tarefa a de nos livrarmos dessa priso,
ampliando o nosso crculo de compaixo, para que ele abranja todos os seres vivos e
toda a natureza em sua beleza. Ningum conseguir alcanar completamente esse
objetivo, mas lutar pela sua realizao j por si s parte de nossa liberao e o
alicerce de nossa segurana interior.
(Albert Einstein)
Zieri et al., 2010

Introduo
1
Resumo: Os vertebrados ectotrmicos apresentam um desenvolvido sistema de clulas
com pigmentos melnicos em seu citoplasma, localizado em diversos rgos e
membranas. A disperso dos gros de melanina dentro dos melancitos responde
fortemente exposio ao hormnio estimulante de melancitos (MSH) e aos
hormnios sexuais, promovendo alterao na colorao. Este trabalho buscou avaliar o
efeito dos esterides cipinato de testosterona, 17 -estradiol e do MSH sobre a
pigmentao heptica e testicular de Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica,
e ultra-estrutural. Foram coletados 60 machos adultos na regio de So Jos do Rio
Preto, SP. Para cada experimento, dez machos adultos receberam doses subcutneas
contendo 0,5 mg/kg de cipionato de testosterona e 0,5 mg/kg de 17 -estradiol,
dissolvidos em leo vegetal e, 2,5x10-7 mmol/10g de -MSH dissolvido em PBS,
durante 7 dias, a cada 48h. O grupo controle recebeu apenas leo vegetal ou PBS.
Grupos com cinco animais foram eutanasiados 24h aps do trmino do tratamento, e
outros cinco, aps 15 dias. Foram realizados estudos morfolgicos utilizando
microscopia de luz e microscopia eletrnica de transmisso. No tecido heptico foram
encontradas clulas de Kupffer. No interstcio testicular observou-se melancitos, com
inmeros melanossomos. Para o grupo tratado com cipionato de testosterona, foi
observado um aumento de aproximadamente 2x na rea ocupada pelas clulas
pigmentadas no fgado e 4x nos testculos mediante analise a curto prazo. Para o mesmo
tratamento, foi observado aumento de 1,8x no fgado dos animais eutanasiados aps 15
dias. Tal resposta pode ser decorrente do aumento da atividade melanossinttica, do
aumento do nmero de clulas, ou ambos. Os animais tratados com 17 -estradiol e -
MSH no apresentaram alteraes na pigmentao heptica e testicular mediante
estudos morfolgicos. Apesar desses resultados, anlises bioqumicas podem ser teis
Zieri et al., 2010

Introduo
2
para detectar alteraes na atividade da dopa-oxidase ou da tirosinase no fgado e nos
testculos.
Palavras-chave: Anura, testculo, fgado, melancito, melanomacrfago, melanina.
Abstract: Ectothermic vertebrates have a well-developed system of melanin-containing
cells, which are distributed throughout several organs and tissues. The dispersion of
melanin-containing granules within melanocytes responds to prolonged exposure to
high concentration of MSH and sexual hormones inducing color change. The present
study aimed to characterize morphological and stereological patterns of pigmented cells
in liver and testis of the Eupemphix nattereri under effect of testosterone cypionate, 17
-estradiol and -MSH. Sixty adult males were collected in So Jos do Rio Preto, So
Paulo State, Brazil. For each experiment, ten adult males were treated with the
following hormones injected in the dorsal lymph sac during seven days: (1) 5 mg/kg
dose of testosterone cypionate or (2) 5 mg/kg dose of 17 -estradiol (dissolved in
vegetal oil) or (3) 2,5x10-7 mmol/10g of -MSH (dissolved in PBS). The control group
received only vegetal oil or PBS solution at the same hormonal concentration. Groups
of five animals were euthanatized after 24h and the other five, after 15 days.
Morphological studies with light and transmission electron microscopy were carried out
in the groups. In the hepatic tissue were found Kupffer cells, which are characterized by
multivesicle bodies in the cytoplasm and large amount of melanosomes. In the testis,
melanocytes-like cells are present in the interstitium. They presented large and irregular
aspect and a great amount of intensely pigmented cytoplasm. For the groups treated
with testosterone cypionate an increase of approximately 2x in the occupied area by the
pigmented cells in the liver and 4x in the testis was observed in the treatment group
against the control. The observed response can be due to increase of melanosynthesis
Zieri et al., 2010

Introduo
3
activity, increase in the number of pigmented cells, or both. Moreover, for the same
treatment an increase of approximately 1,8x was observed in the liver of animals
euthanatized after 15 days when compared to those euthanized after 24 hours. The
animals treated with 17 -estradiol and -MSH did not show differences with regard to
organs pigmentation. Despite these results, biochemical analysis may be useful in
detecting changes in the activity of dopa oxidase or tyrosinase in the liver and testes.
Keywords: Anuran, testis, liver, melanocyte, melanomacrophages, melanin.
Zieri et al., 2010

Introduo
4
1. Introduo
1.1. Panorama geral dos Anfbios
A classe Amphibia, descrita por Linnaeus (1758), apresenta-se como os primeiros
vertebrados a viverem em ambiente terrestre, h cerca de 350-400 milhes de anos, no
perodo Devoniano. Est dividida em trs subclasses, Labyrinthodontia (ancestrais dos
rpteis) e Lepospondyli, j extintas, e a subclasse Lissamphibia (HILDEBRAND, 1995;
LINZEY, 2001; POUGH et al., 2008).
A subclasse Lissamphibia, assim denominada pela escassez ou ausncia de
escamas sobre a pele, surgiu no perodo Jurssico da era Mesozica, h cerca de 150
milhes de anos (LINZEY, 2001). Estes anfibios viventes formam um grupo
monofiltico, que apresentam como sinapomorfia epiderme contendo glndulas
produtoras de muco e de veneno, ricamente vascularizado e que permite a realizao de
trocas gasosas (POUGH et al., 2008). Esta subclasse apresenta enorme diversidade na
forma corporal, tamanho, ecologia e comportamento (DUELLMAN e TRUEB, 1999),
sendo constituda pelas ordens Gymnophiona, representada pelas ceclias, Urodela, que
so as salamandras, e Anura, a qual inclui sapos, rs e pererecas (HILDEBRAND,
1995; POUGH et al., 2008).
A permeabilidade da pele dos anfbios uma caracterstica que rege em muitos
aspectos de suas vidas. A evaporao de gua pela superfcie da pele, limita a atividade
dos anfbios ambientes relativamente midos. A pele o maior stio de trocas gasosas,
portanto, esses animais apresentam epitlio glandular contendo glndulas mucosas para
manuteno da umidade, glndulas que produzem substncias utilizadas na corte e
glndulas de veneno como mecanismo de defesa passiva. Muitos anfbios advertem sua
toxicidade exibindo colorao aposemtica e, algumas espcies no txicas, se
protegem contra predao mimetizando animais venenosos (POUGH et al., 2008).
Zieri et al., 2010

Introduo
5
Os anfbios, por apresentarem caractersticas e modo de vida peculiares, como
permeabilidade cutnea gua e eletrlitos e ciclo de vida dependente do ambiente
aqutico e do terrestre, com uma fase larval aqutica e outra adulta terrestre (POUGH et
al., 2008), se tornam vulnerveis s alteraes ambientais (RABB, 1990; DUELLMAN
e TRUEB, 1999). Pelo carter estenobionte de certas espcies e seu declnio
populacional, o grupo tem sido reconhecido como bioindicador de qualidade ambiental
(WEYGOLDT, 1989; VITT et al., 1990; BLAUSTEIN e WAKE, 1995).
Neste grupo, tambm se observa uma grande diversidade de estratgias
reprodutivas, seja no comportamento de atrao sexual, seja nos tipos e nos locais de
postura e nos cuidados com as crias (FEIO et al., 1998; POUGH et al., 2008). A maioria
das espcies depositam ovos na gua ou em ambiente terrestre, transformando-se em
larvas aquticas ou em miniaturas de adultos. O cuidado parental observado em
muitos anfbios, onde adultos de algumas espcies carregam os ovos presos na
superfcie do corpo, outros carregam em dobras da pele, nos sacos vocais ou mesmo no
estmago. Algumas fmeas retm os ovos nos ovidutos e do a luz a jovens j
metamorfoseados, outros transportam os girinos do ninho para a gua e em alguns
casos, alimentam o girino (POUGH et al., 2008).
Os anfbios ocorrem em todos os continentes, com exceo da Antrtica, com a
proporo de 77% das suas famlias com centro de distribuio tropical, 14% em reas
subtropicais do hemisfrio norte e 9% distribudas pelo restante do globo (POUGH et
al., 2008). O Brasil tem a maior biodiversidade mundial (MITTERMEIER et al., 1992)
e de acordo com Haddad (1998) cerca de 60% das espcies so endmicas. Segundo a
Sociedade Brasileira de Herpetologia (SBH, 2009), desde 2005 foram descritas 59
novas espcies de anfbios e diante dos nmeros atuais, o Brasil ocupa a primeira
Zieri et al., 2010

Introduo
6
colocao na relao de pases com maior riqueza de espcies de anfbios, seguido por
Colmbia e Equador.
A ordem Anura, tambm conhecida como Salientia, compreende anfbios sem
cauda e que possuem os membros posteriores modificados para o salto (ORR, 1986;
POUGH et al., 2008). Os anuros, com poucas excees, apresentam fertilizao externa,
tendo o macho o papel de atrair a fmea por meio da vocalizao e durante o amplexo
ou abrao nupcial, as cloacas so justapostas, garantindo a fertilizao dos ovos. A
maioria dos anuros apresentam desenvolvimento indireto, passando por um estgio
larval denominado girino que morfofisiologicamente diferentes do adulto. Esta forma
contrastante entre corpo e estilo de vida pode explicar em parte a falta de pedomorfose e
pedognese em anuros (ZUG et al., 2001).
No Brasil, at o momento, foram descritas 849 espcies de anfbios, dos quais
821 pertencem Ordem Anura e 53 famlia Leiuperidae Bonaparte, 1850 (SBH,
2009), txon que incorpora a espcie utilizada como modelo biolgico neste trabalho.
1.2. Eupemphix nattereri (Anura, Leiuperidae)
O gnero Eupemphix Steindachner, 1863, removido da sinonmia de
Physalaemus Fitzinger, 1826, por Nascimento et al. (2005), aps reviso taxonmica do
grupo, atualmente est inserido na famlia Leiuperidae Bonaparte, 1850, juntamente
com outros 6 gneros: Edalorhina Jimnez de la Espada, 1871; Engystomops Jimnez
de la Espada, 1872; Physalaemus Fitzinger, 1826; Pleurodema Tschudi, 1838;
Pseudopaludicola Miranda-Ribeiro, 1926 e Somuncuria Lynch, 1978. Esses gneros
foram removidos da sinonmia de Leptodactylidae Werner, 1896, por Grant et al.
(2006), e apresentam centros de distribuio desde o Mxico, Amrica Central at o Sul
da Amrica do Sul (FROST, 2010).
Zieri et al., 2010

Introduo
7
A espcie Eupemphix nattereri (Fig. 1A) apresenta cerca de 4,5 cm de
comprimento rostro cloacal, cabea larga, focinho curto, colorao geral do dorso, com
manchas acinzentadas ou castanhas sobre um fundo mais claro, glndulas inguinais
ovides bem evidentes (Fig. 1B). Apresentam comportamento de escavao,
permanecendo enterrados em perodos de estiagem (CEI, 1980). A reproduo
prolongada, durante a qual os machos agregam-se e vocalizam em arenas, no interior de
corpos dgua, principalmente no incio da estao chuvosa (Fig. 1C). O amplexo
axilar (Fig. 1D) e os ovos so depositados em ninhos de espumas, sobre a gua (Figs.
1E-F). Para a produo do ninho, o macho bate com as pernas traseiras o muco que
liberado pela fmea juntamente com os ovos durante a desova, no momento do amplexo
(BASTOS et al., 2003).
Apresentam como mecanismo de defesa secundria o comportamento deimtico,
que consiste em mudanas bruscas na postura: aumento da rea corporal quando inflam
plenamente os pulmes; o animal abaixa a cabea, cerra as plpebras e soergue a parte
posterior do corpo, tornando salientes as glndulas inguinais brilhantes, pretas e
marginadas de branco, semelhantes a ocelos e que podem ficar recobertas por uma
secreo viscosa, de aspecto leitoso (SAZIMA e CARAMASCHI, 1986). O
comportamento deimtico pode ser interpretado como uma resposta adaptativa, das
diversas populaes, a diferentes presses seletivas exercidas pelos predadores
(EDMUNDS, 1974).
Zieri et al., 2010

Introduo
8
A B
C D
E F
Figura 1. Aspectos gerais e reprodutivos de Eupemphix nattereri. A- Vista lateral direita de E. nattereri. B-
Glndulas inguinais ovides. C- Macho em comportamento de vocalizao. D- Macho (superior) e fmea em
amplexo. E e F- Ovos depositados em ninhos de espumas nas margens do corpo dgua.
H contribuies relevantes sobre a herpetologia no pas (JIM, 1980; HADDAD,
1991; HADDAD e SAZIMA, 1992; GIARETTA, 1994; POMBAL Jr., 1995;
MARTINS, 1996; OLIVEIRA, 1996; ROSSA-FERES, 1997; HADDAD, 1998; ZIERI,
2004; FAIVOVICH et al., 2005; OLIVEIRA, 2007), entretanto estudos da biologia
estrutural relacionados com caractersticas morfolgicas e sobretudo a descrio da
pigmentao visceral so incipientes para a maioria dos anuros neotropicais
(OLIVEIRA e ZIERI, 2005; ZIERI et al., 2007, FRANCO-BELUSSI et al., 2009;
Zieri et al., 2010

Introduo
9
MORESCO e OLIVEIRA, 2009). Esse panorama enfatiza a necessidade de expandir
esses conhecimentos, o que permitir melhor entendimento sobre questes da biologia
reprodutiva e da pigmentao, estabelecendo alm da descrio, as relaes fisiolgicas
e adaptativas destes organismos.
1.3. Sistema Pigmentar
Os animais ectotrmicos apresentam, espalhados pelo tegumento, clulas
originadas da crista neural (BAGNARA 1982; SICHEL, 1997), de aspecto dendrtico,
dotadas de pigmentos em seu citoplasma (OLIVEIRA e ZIERI, 2005, ASPERGREN et
al., 2009), denominadas cromatforos. Os cromatforos so classificados em diferentes
grupos, dependendo do pigmento que contm: melanforos (marrom-escuro ou
amarelo-vermelho), xantforos (amarelo), eritrforos (vermelho) e leucforos /
iridforos (branco metlico). Os melanforos, clulas produtoras de melanina, so os
tipos mais comuns de cromatforos e so responsveis pela pigmentao da maioria dos
vertebrados. Nas aves e mamferos, os melanforos so chamados de melancitos
(ASPERGREN et al., 2009).
Os vertebrados, com exceo de aves e mamferos, podem apresentar a
capacidade de adaptao cromtica, influenciados pela luz, pelo ambiente e
comportamento social. Tal adaptao pode atuar como mecanismo de termorregulao,
proteo contra radiao, mimetismo, camuflagem e sinais comportamentais como
medo ou raiva (FILADELFI et al., 2005 e BAGNARA e HADLEY, 1973).
As mudanas de cor que ocorrem no tegumento desses animais, podem ser
classificadas em morfolgicas, que ocorrem em todos os vertebrados, em dias ou
semanas, e dependem de alteraes na quantidade de pigmento ou no nmero de clulas
ou fisiolgicas, que ocorrem apenas nos ectotrmicos, em segundos ou horas
Zieri et al., 2010

Introduo
10
(HADLEY, 1996; BAGNARA, 1976). As mudanas fisiolgicas dependem de
mecanismos celulares de disperso e agregao de pigmentos dentro dos cromatforos
(Fig. 2), resultando respectivamente no escurecimento ou clareamento da pele desses
animais (VISCONTI e CASTRUCCI, 1993).
A B
Figura 2 Mudana de cor fisiolgica resultante do deslocamento dos grnulos de melanina no interior
dos melanforos. A- grnulos de melanina agregados ao redor do ncleo, dando clula aspecto
puntiforme. B- grnulos de melanina dispersos pelo citoplasma, dando clula aspecto dentrtico.
(adaptado de Wallin, 2002).
O transporte coordenado de organelas contento melanina, os melanossomos,
pelo citoplasma das clulas pigmentadas, o fator responsvel pelas mudanas de cor
que ocorre no tegumento dos ectotrmicos. Em peixes, a translocao intracelular dos
pigmentos controlada por hormnios e por ao direta do sistema nervoso (FUJII,
2000). Em anfbios, a adaptao cromtica est sujeita exclusivamente ao controle
hormonal (BAGNARA e MATSUMOTO, 2006).
A motilidade dos melanossomos ocorre de forma centrfuga ou centrpeta, pelo
citoplama das clulas pigmentadas, com o auxlio dos elementos do citoesqueleto como
microtbulos e filamento de actina (ALBERTS et al., 2002). Tais elementos foram
observados atravs de eletromicrografias dos melancitos testiculares do anuro
Eupemphix nattereri (ZIERI et al., 2007). A dinena, protena citoplasmtica, est
envolvida com a movimentao dos melanossomos pelos microtbulos, em direo ao
ncleo celular, enquanto a cinesina dispersa os grnulos atravs dos microtbulos
(BAGNARA e MATSUMOTO, 2006). Em relao aos filamentos de actina, a
Zieri et al., 2010

Introduo
11
motilidade dos melanossomos est sujeita a ao da miosina no muscular, denominada
miosina V, relacionada com o transporte dos melanossomos do centro para a periferia
da clula (WOLFF, 1973) (Fig. 3).
Agregao Disperso
Melanossomo Dineina citoplamtica

Microtbulo
Cinesina II
Filamento de Actina
Miosina V
Figura 3 - Esquema ilustrando o mecanismo de translocao dos melanossomos, por ao de protenas

motoras, no interior dos melanforos de ectotrmicos (adaptado de Bagnara e Matsumoto, 2006).
De maneira geral, alguns hormnios atuam nas clulas pigmentares, estimulando
receptores de membrana da clula, as melanocortinas (MCR), que atravs de sinais
qumicos, interferem no comportamento da enzima adenilato ciclase, promovendo
alterao na quantidade de cAMP (3, 5- adenosina monofosfato cclico). A diminuio
nos nveis de cAMP ou aumento de ons Ca2+ provocam agregao dos pigmentos,
enquanto a disperso dos pigmentos so induzidas de modo antagnico (FUJII, 2000;
SUGIMOTO, 2002). Hormnios como noradrenalina, melatonina e o hormnio
Zieri et al., 2010

Introduo
12
concentrador de melanina (MCH), promovem agregao dos pigmentos, enquanto o
hormnio estimulante de melanina (MSH), noradrenalina em alguns animais e a luz,
podem ser agentes dispersores de pigmento (ASPERGREN et al., 2009).
Em mamferos, os melancitos podem produzir dois tipos de melanina: a
eumelanina (marrom ou preta) e a feomelanina (amarela ou vermelha) (ITO e
WAKAMATSU, 2003), ambas derivadas da dopaquinona, que formada quando o
aminocido tirosina oxidado (Fig. 4). Os animais ectotrmicos no sintetizam a
feomelanina (ASPERGREN et al., 2009).
Figura 4 Via biossinttica da eumelanina e feomelanina, protenas formadoras dos pigmentos

melnicos no interior das clulas pigmentadas (adaptado de Bagnara e Matsumoto, 2006).
Zieri et al., 2010

Introduo
13
1.4. Sistema pigmentar extracutneo
Nos vertebrados ectotrmicos, clulas com pigmentos melnicos so encontradas
em diversos rgos e estruturas alm da pele (fgado, bao, pulmes, corao, timo,
gnadas e tecido conjuntivo ao redor dos vasos sanguneos e meninges) formando um
sistema pigmentar extracutneo (GALLONE et al., 2002).
Nesses animais, tem sido descritas na epiderme e em diversos rgos, clulas
semelhantes melancitos (AGIUS e AGBEDE, 1984; ZUAST et al., 1998; ZIERI,
2004; OLIVEIRA e ZIERI, 2005; OLIVEIRA, 2007; ZIERI et al., 2007), que produzem
e estocam melanina no interior de estruturas esfricas ou ovides, os melanossomos
(AGIUS e ROBERTS, 2003). Esses tipos celulares so grandes e irregulares, com o
citoplasma abundante e intensamente pigmentado, mostrando-se ao microscpio
estereoscpio com aspecto dendrtico, devido presena dos melanossomos espalhados
pelos prolongamentos citoplasmticos, ou puntiforme, quando no se observa esses
prolongamentos, pela ausncia dessas organelas que ficam concentradas na regio
perinuclear (OLIVEIRA e ZIERI, 2005).
Os melancitos viscerais, como reportado para Eupemphix nattereri (ZIERI et al.,
2007) atravs da anlise da ultra-estrutura testicular, apresentam o citoplasma repleto de
gros de melanina e escassez das demais organelas. Nas regies citoplasmticas
desprovidas de grnulos de melanina, as cisternas do complexo de Golgi podem ser
observadas, alm de elementos do citoesqueleto, microtbulos e filamentos de actina.
Adicionalmente aos melancitos, observa-se em rgos hematopoticos (fgado,
bao e os rins durante a fase embrionria) de peixes, anfbios e rpteis, a presena de
clulas pigmentadas com atividade macrofgica conhecidas como melanomacrfagos
(AGIUS, 1980; AGIUS e AGBEDE, 1984). Em anfbios, os melanomacrfagos
residentes no fgado tambm so conhecidos como clulas de Kupffer (SICHEL et al.,
Zieri et al., 2010

Introduo
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1997; ZUAST et al., 1998; PRELOVSEK e BULOG, 2003) e apresentam diferentes
tipos de grnulos no citoplasma, os quais podem indicar substncias qumicas
diversificadas, como melanina, hemosiderina e lipofuscina, derivados da degradao de
material celular fagocitado (AGIUS e AGBEDE, 1984; HERRAEZ e ZAPATA, 1991).
As clulas de Kupffer no eram includas na classificao de clula pigmentar,
pois acreditava-se que os macrfagos presentes no fgado apenas fagocitavam os
melanossomos, e no os sintetizavam (FITZPATRICK et al., 1966). Entretanto, anlises
sobre a funo melanognica das clulas pigmentares no fgado de Xenopus laevis
(SICHEL et al., 1997), Rana esculenta (SICHEL et al., 1997 e GALLONE et al., 2002)
e Proteus anguinus (PRELOVSEK e BULOG, 2003) demonstraram que h
melanognese, e segundo Barni et al., 1999 e 2002, esta atividade de melanossntese em
R. esculenta pode variar de acordo com a sazonalidade.
A funo das clulas pigmentares nos rgos viscerais dos vertebrados
ectotrmicos no est bem definida e vrias hipteses tm sido propostas. Dentre elas
pode-se citar funes citoprotetoras relacionadas aos radicais livres (CESARINI, 1996;
RZANOWSKA, 1999; MCGRAW, 2005), propriedade antimicrobiana
(MACKINTOSH, 2001) e processos de detoxificao por poluentes (FENOGLIO,
2005). Barni et al. (1999) demonstraram um aumento na quantidade de melanina no
fgado e modificaes metablicas e estruturais das clulas hepticas em R. esculenta
durante o inverno. Outro trabalho correlaciona a ativao da melanognese heptica
com hipxia em salamandras (FRANGIONI et al., 2000). Ccero et al. (1977) e
Kalashnikova (1992) sugeriram uma relao entre o aumento da pigmentao no fgado
e a hemocaterese heptica. Com relao aos centros de melanomacrfagos em peixes, o
aumento de pigmentos melnicos tem sido descritos com uma condio particular de
doena (ROBERTS, 1974). Franco-Belussi (2010) relaciona resposta das clulas
Zieri et al., 2010

Introduo
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pigmentares, melancitos testiculares e melanomacrfagos hepticos, ao processo
inflamatrio induzido por lipopolissacardeo de Escherichia coli (LPS).
Para os anuros, os estudos relativos aos melancitos viscerais e aos
melanomacrfagos so recentes e se referem poucas espcies: Physalaemus cuvieri
(OLIVEIRA et al., 2002 e 2003; MORESCO e OLIVEIRA 2009), P. fuscumaculatus
(AOKI et al., 1969; ZIERI, 2004), Eupemphix nattereri (OLIVEIRA e ZIERI, 2005;
ZIERI et al., 2007, FRANCO-BELUSSI et al., 2009), R. esculenta (CCERO et al.,
1989; SICHEL et al., 1997; BARNI et al., 1999; GALLONE et al., 2002; BARNI et al.,
2002), R. ridibunda (AKULENKO, 1998) e Xenopus laevis (SICHEL et al., 1997;
ZUAST et al., 1998).
1.5. Ao Hormonal
Outro fator de merecido destaque e ainda pouco explorado, se refere aos
mecanismos fisiolgicos que regulam o sistema melanognico. A disperso dos gros
de melanina dentro dos melancitos responde fortemente exposio prolongada a alta
concentrao de MSH - hormnio estimulante dos melancitos (CASTRUCCI et al.,
1984; HADLEY, et al., 1985; FILADELFI e CASTRUCCI, 1994; BAGNARA e
MATSUMOTO, 2006), peptdeo produzido na hipfise e transportado at os
cromatforos pela circulao. Nos melanforos e eritrforos, e em alguns xantforos, o
MSH dispersa os grnulos de pigmento, promovendo alterao da cor do tegumento em
vertebrados pecilotrmicos (BAGNARA e MATSUMOTO, 2006). O mesmo
verificado nas clulas de Kupffer de R. esculenta (GUIDA et al., 2004), que apresentam
um aumento na expresso gnica da tirosinase quando submetidas ao MSH.
Estudos com outros vertebrados demonstram que os hormnios esterides
tambm influenciam na pigmentao, e seus efeitos em anfbios foi observado por
Zieri et al., 2010

Introduo
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Richards (1982) e Hayes e Menendez (1999) em Hyperolius argus, demonstrando
alterao na expresso dos cromatforos quando empregado hormnios sexuais.
Sobre a pigmentao extracutnea, alm do fgado, outro rgo de merecido
destaque que se tornou alvo de estudo por apresentar pigmentao em algumas espcies
de anuros so os testculos. Em Leiuperdeos, famlia da qual a espcie Eupemphix
nattereri faz parte, a pigmentao testicular parece ser inerente aos integrantes do txon,
como foi observado em Physalaemus cuvieri (OLIVEIRA et al., 2002 e 2003,
MORESCO e OLIVEIRA, 2009), P. fuscomaculatus (AOKI, 1969; ZIERI, 2004), E.
nattereri (ZIERI, 2004; OLIVEIRA e ZIERI, 2005; ZIERI et al., 2007; FRANCO-
BELUSSI, et al., 2009), P. olfersii e Pseudopaludicola falcipes (OLIVEIRA, 2007), os
quais apresentam um grande nmero de clulas pigmentadas na cpsula e no interstcio
testicular, conferindo uma tonalidade marrom escura s gnadas.
1.6. Sistema Reprodutor Masculino
Nos vertebrados, de modo geral, os aparelhos reprodutor e urinrio se originam a
partir da regio mesodrmica intermediria. Esse cordo de clulas mesodrmicas se
desenvolve em tbulos pronfricos, que so os precursores dos rins e ductos genitais
(GILBERT, 2002). As gnadas, sobre influncia de fatores genticos, fisiolgicos e
ambientais, se desenvolvem em testculos ou ovrios e tambm em seus sistemas
tubulares condutores de gametas (ROMER e PARSONS, 1985; DUELLMAN e
TRUEB, 1994).
O aparelho reprodutor masculino dos anfbios constitudo por testculos pares,
ligados diretamente aos ductos arquinfricos, que por sua vez abrem-se na cloaca
transportando apenas o esperma, ou ento atravs dos tbulos renais (mesonfricos) e
destes aos ductos arquinfricos e cloaca, transportando urina e esperma, mantendo em
Zieri et al., 2010

Introduo
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ambos os casos uma estreita relao com o aparelho urinrio (ROMER e PARSONS,
1985 e ORR, 1986).
Nos anuros (Fig. 5), os testculos so arredondados, compactos, de cor
geralmente esbranquiada e podem apresentar variaes anatmicas de forma e peso de
acordo com o perodo reprodutivo (DUELLMAN e TRUEB, 1994), alm de outras
alteraes morfofuncionais associadas sazonalidade da reproduo (LOFTS, 1974) ou
espcie-especficas (OLIVEIRA et al., 2002), como descrito para algumas espcies
(MONTERO e PISAN, 1990 e 1992; HUANG et al., 1997; OLIVEIRA e
VICENTINI, 1998). As gnadas esto localizadas na cavidade corporal, aderidas
parede dorsal pelo mesrquio, atravs do qual transitam dctulos eferentes que ganham
os ductos arquinfricos (ductos de Wolf) (LOFTS, 1974).
Na margem anterior dos testculos se encontram os corpos adiposos abdominais,
de colorao amarelada e com muitos prolongamentos delgados. Estes corpos adiposos
constituem uma caracterstica estrutural comum a todos os anfbios (DUELLMAN e
TRUEB, 1994) e servem como uma reserva nutricional para as gnadas
(FITZPATRICK et al., 1966) (Fig. 5).
Histologicamente os testculos so revestidos por uma delgada cpsula de tecido
conjuntivo, a tnica albugnea, pela qual percorrem vasos sangneos destinados ao
estroma testicular. O tecido germinativo est arranjado em lculos seminferos
delimitados por tecido conjuntivo frouxo, porm no se observa a presena de septos
intratesticulares (OLIVEIRA e VICENTINI, 1998; OLIVEIRA et al., 2002; SANTOS e
OLIVEIRA, 2008).
No parnquima testicular o tecido germinativo apresenta espermatognias
localizadas na base do epitlio e, na seqncia da citodiferenciao, espermatcitos,
espermtides e espermatozides, estes ltimos geralmente so encontrados prximos ao
Zieri et al., 2010

Introduo
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lmen. Esse epitlio possui organizao cstica, ou seja, grupos de clulas germinativas
associam-se s clulas de Sertoli constituindo espermatocistos, caracterstica comum
dos anfbios (WAKE, 1969; LOFTS, 1974; OLIVEIRA et al., 2002 e 2003), bem como
em outros anamniotas (GRIER, 1992) (Fig. 6).
Sobre a morfologia dos lculos seminferos e o arranjo cstico do epitlio
germinativo destacamos alguns trabalhos realizados coma ordem anura: Leiuperidae:
Physalaemus fuscomaculatus (AOKI et al., 1969), gnero Physalaemus (AMARAL et
al., 1999a e 1999b), Physalaemus cuvieri (OLIVEIRA et al., 2002) e Eupemphix
nattereri (OLIVEIRA e ZIERI, 2005; ZIERI et al. 2007 e 2008); Calyptocephalellidae:
Calyptocephalella gayi (=Caudiverbera caudiverbera) (HERMOSILLA et al., 1983);
Cycloramphidae: Odontophrynus cultripes (BO et al., 1991); Bombinatoridae:
Bombina bombina (GOLLMANN et al., 1993); Bufonidae: Rhinella ornata
(OLIVEIRA et al., 2007) e Hylidae: gnero Dendropsophus (SANTOS e OLIVEIRA,
2007; FRANCO-BELUSSI et al., 2010).
A espcie E. nattereri foi adotada como modelo biolgico nesse estudo pelas
caractersticas: 1- possui intensa pigmentao interna, principalmente nas gnadas, tanto
na cpsula quanto no interstcio; 2- dentre os animais pertencentes famlia Leiuperidae
encontrados durante a fase reprodutiva na regio de So Jos do Rio Preto, SP, E.
nattereri uma das mais abundantes e de fcil captura porque os machos vocalizam em
pequenos corpos dgua sem vegetao; 3- a espcie tem sido utilizada como modelo
em vrias outras pesquisas dessa temtica, com estudos relativos morfologia das
clulas pigmentadas no fgado e nos testculos.
Zieri et al., 2010

Introduo
19
corpo adiposo
mesrquio
testculo
dctulo eferente
veia cava
rim
ducto de Wolff
vescula urinria
cloaca
Figura 5- Desenho esquemtico do aparelho urogenital masculino de anuro. (adaptado de Duellman e

Trueb, 1994).
Figura 6 Representao esquemtica generalizada do epitlio germinativo cstico de anuro: parede locular
(I); tecido interlocular (2); espermatognia primria (3) e secundria (4); espermatcito primrio (5) e
secundrio (6); espermtide primria (7) e secundria (8); feixes de espermatozides (9) e clula de Sertoli
(10) (adaptado de Oliveira et al., 2003).
Zieri et al., 2010

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Zieri et al., 2010

Objetivos
32
1.8. Objetivos
Perante a escassez de estudos morfolgicos e funcionais relacionados ao sistema
pigmentar extracutneo de anuros, foram realizados trabalhos cujos objetivos
especficos foram:
1) Avaliar o efeito dos esterides cipionato de testosterona, 17- estradiol e do -MSH
sobre os melanomacrfagos do fgado no anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise
histolgica e ultraestrutural.
2) Efeito dos esterides cipionato de testosterona, 17 -estradiol e do -MSH sobre os
melancitos testiculares do anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica e
ultraestrutural.
3) Caracterizao da via intratesticular de conduo de gametas do anuro Eupemphix
nattereri, mediante anlise histolgica e ultraestrutural.
Zieri et al., 2010

Captulo 1
33
Efeitos de curto e mdio prazo da administrao exgena de
esterides sexuais e do -MSH sobre as clulas de Kupffer de
Eupemphix nattereri (Anura): estudos histolgicos e
ultraestruturais
Zieri et al., 2010

Captulo 1
34
Captulo 1
Efeitos de curto e mdio prazo da administrao exgena de esterides sexuais e

do -MSH sobre as clulas de Kupffer de Eupemphix nattereri (Anura): estudos
histolgicos e ultraestruturais
Rodrigo Zieri1
Lilian Franco-Belussi1
Lia Raquel de Souza Santos1
Sebastio Roberto Taboga2
Classius de Oliveira2
1
Curso de Ps graduao em Biologia Animal, Universidade Estadual Paulista
(UNESP), So Jos do Rio Preto SP.

2
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), So Jos do Rio
Preto SP.
Endereo para correspondncia:
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP), IBILCE, Rua
Cristvo Colombo, 2265, Jardim Nazareth, CEP:15040-000, So Jos do Rio Preto,
So Paulo, Brasil. Fax: (55-17) 3221- 2390. E-mail: rodrigozieri@gmail.com /
classius@ibilce.unesp.br
Zieri et al., 2010

Captulo 1
35
Resumo: Este trabalho avaliou o efeito dos hormnios cipionato de testosterona, 17 -
estradiol e -MSH (Hormnio estimulante de melancito) sobre a pigmentao heptica
do anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica e ultraestrutural. Foram
coletados 60 machos adultos, na regio de So Jos do Rio Preto, SP. Aps os
tratamentos com os esterides e com -MSH, os animais foram submetidos s anlises
morfolgicas. No tecido heptico foi encontrado clulas de Kupffer, contendo incluses
citoplasmticas e melanossomos. Para o grupo tratado com cipionato de testosterona foi
observado um aumento de aproximadamente 2x na rea pigmentada ocupada pelas
clulas pigmentadas no fgado, quando comparados o tratamento e o controle. Para o
mesmo tratamento, foi observado aumento de 1,8x no fgado dos animais eutanasiados
aps 15 dias. Os animais tratados com 17--estradiol e -MSH no apresentaram
diferenas na pigmentao heptica.
Palavras-Chave: Anura, melanomacrfago, testosterona, estradiol, -MSH, melanina.
Abstract: The present study aimed to characterize morphological and stereological
patterns of pigmented cells in liver of Eupemphix nattereri under effect of testosterone
cypionate, 17 -estradiol and -MSH. Morphological studies with light and
transmission electron microscopy were carried out in the groups. In the hepatic tissue
were found Kupffer cells, which are characterized by multivesicle bodies in the
cytoplasm and large amount of melanosomes. For the groups treated with testosterone
cypionate an increase of approximately 2x in the occupied area by the pigmented cells
in the liver was observed in the treatment group against the control. Morover, for the
same treatment an increase of approximately 1,8x was observed in the liver of animals
euthanatized after 15 days when compared to those euthanized after 24 hours.
Keywords: Anuran, melanomacrophages, testosterone, estradiol, -MSH, melanin.
Zieri et al., 2010

Captulo 1
36
INTRODUO
Os vertebrados ectotrmicos apresentam um notvel sistema formado por
clulas pigmentadas, localizadas em diversos rgos e estruturas alm do tegumento
(GALLONE et al., 2002; GUIDA et al., 2004; ZIERI et al., 2007; MORESCO e
OLIVEIRA, 2009 e FRANCO-BELUSSI et al., 2009).
Em peixes, anfbios e rpteis, tem sido descritas em rgo com funo
hematopotica, clulas com atividade macrofgica e que apresentam atividade
melanognica, os melanomacrfagos (CHRISTIANSEN et al., 1996; SICHEL et al.,
1997; PRELOVSEK e BULOG, 2003 e GUIDA et al., 2004).
Os melanomacrfagos hepticos, denominados clulas de Kupffer em anfbios e
rpteis ou centros de melanomacrfagos em peixes, so dotados de diversos grnulos
citoplasmticos, que podem indicar a presena de diferentes substncias qumicas como
hemosiderina, lipofuscina e grnulos escuros com propriedades histoqumicas e
ultraestruturais semelhantes melanina (AGIUS e AGBEDE, 1984; ZUAST et al, 1990;
HERRAEZ e ZAPATA, 1991; SICHEL, 1997; GUIDA 2004).
Estudos sobre a funo melanognica das clulas de Kupffer comprovam a
atividade melanossinttica no fgado de Xenopus laevis (SICHEL et al., 1997), Rana
esculenta (SICHEL et al., 1997 e GALLONE et al., 2002) e Proteus anguinus
(PRELOVSEK e BULOG, 2003), podendo variar de acordo com a sazonalidade
(BARNI et al., 1999 e 2002) ou em resposta ao anlogo sinttico do -MSH (hormnio
estimulante de melancito) que promove aumento da expresso gnica da tirosinase e da
atividade da dopa oxidase (GUIDA et al., 2004).
De maneira geral os hormnios atuam nas clulas pigmentares promovendo a
disperso ou agregao dos grnulos de pigmentos, ocasionando uma mudana de cor
Zieri et al., 2010

Captulo 1
37
fisiolgica, ou aumentando o nmero de clulas ou a quantidade de pigmentos em seu
interior, provendo uma mudana de cor morfolgica (BAGNARA, 1976). Alguns
trabalhos mostram que a disperso dos gros de melanina dentro de clulas pigmentadas
fortemente influenciada pela exposio prolongada alta concentrao de MSH
(CASTRUCCI et al., 1984; HADLEY, et al., 1985; FILADELFI e CASTRUCCI, 1994;
GUIDA et al., 2004; BAGNARA e MATSUMOTO, 2006). Efeitos dos homnios
esterides na pigmentao em anfbios foi observado por Richards (1982) e Hayes e
Menendez (1999) em Hyperolius argus, demonstrando alterao na expresso dos
cromatforos quando empregado hormnios sexuais.
Poucos e recentes estudos abordam o sistema pigmentar extracutneo em
anfbios anuros como reportado para Physalaemus cuvieri (OLIVEIRA et al., 2002;
2003; MORESCO e OLIVEIRA, 2009), P. fuscomaculatus (AOKI et al., 1969), E.
nattereri (OLIVEIRA e ZIERI, 2005; ZIERI et al., 2007; FRANCO-BELUSSI et al.,
2009), Rana esculenta (CICERO et al., 1989; SICHEL et al., 1997; BARNI et al., 1999,
2002; GALLONE et al., 2002), Rana ridibunda (AKULENKO, 1998), Xenopus laevis
(SICHEL et al., 1997; ZUASTI et al., 1998) e gnero Dendropsophus (FRANCO-
BELUSSI et al., 2010). Este trabalho avaliou o efeito dos esteroides cipionato de
testosterona e 17- estradiol e do -MSH sobre os melanomacrfagos do fgado no
anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica, estereoscpica e
ultraestrutural.
MATERIAL E MTODOS
Foram utilizados 60 machos adultos de Eupemphix nattereri (Leiuperidae),
coletados em vrzeas, lagoas temporrias e permanentes na regio de So Jos do Rio
Preto, SP, em atividade reprodutiva, nas estaes chuvosas de 2008 e 2009 (Licena
Zieri et al., 2010

Captulo 1
38
IBAMA: 14731-1). Os exemplares foram aclimatados durante 7 dias, em terrrios
individuais, no Laboratrio de Anatomia Comparativa do Instituto de Biocincias,
Letras e Cincias Exatas de So Jos do Rio Preto, SP. A manipulao e os
experimentos foram feitos de acordo com o procedimento da Universidade Estadual
Paulista (UNESP) seguindo o guia de cuidados e uso de animais de laboratrio.
Tratamento hormonal
Para o uso dos hormnios esterides, os animais coletados na estao chuvosa
de 2008, receberam injees subcutneas de cipionato de testosterona, dissolvido em
leo vegetal e aplicado a cada 48h por sete dias. Na anlise de curto prazo da condio
hiperandrognica, cinco exemplares foram sacrificados 24h aps a aplicao do
hormnio e outros cinco, para anlise de mdio prazo, no dcimo quinto dia. Outro
grupo de dez exemplares foi tratado com injees subcutneas de 17 -estradiol (Sigma)
dissolvido em leo vegetal e aplicado a cada 48h por sete dias, nos quais cinco foram
sacrificados 24h aps a aplicao do hormnio e outros cinco no dcimo quinto dia.
Para o grupo controle (10 animais para cada tratamento), foram utilizadas injees
subcutneas somente com leo vegetal, sendo cinco sacrificados 24h aps a ltima
aplicao e o restante no dcimo quinto dia.
Para uso do hormnio estimulante de melanina, os animais coletados na estao
chuvosa de 2009, receberam injees subcutneas de -MSH dissolvido em PBS e
aplicado a cada 48h por sete dias. Para cada espcime, foram utilizados 10 exemplares,
nos quais cinco foram sacrificados 24h aps a aplicao do hormnio e outros cinco no
dcimo quinto dia. No grupo controle (10 animais) foram aplicadas injees
subcutneas contendo apenas PBS. Cinco animais foram sacrificados para anlise de
curto prazo com 24h e o restante, sacrificados no dcimo quinto dia a partir da ltima
aplicao.
Zieri et al., 2010

Captulo 1
39
Para o uso dos hormnios esterides, cipionato de testosterona e 17 -estradiol
(Sigma), foi administrado uma dosagem de 0,5 mg/Kg corporal dissolvido em 0,05 ml
de leo vegetal (SANTOS, 2006). Para o -MSH foi administrado 2,5x10-7 mmol/10g
de -MSH (Sigma), dissolvido em 0,05 ml de PBS (adaptado de HADLEY et al. 1985).
Coleta e processamento do material biolgico
Os animais foram pesados e submetidos a medida do comprimento rostro-
caudal. Ento foram dissecados por meio de inciso mediana na regio ventral, expondo
os rgos. Aps esse procedimento, o fgado foi removido, pesado e imediatamente
imerso em soluo fixadora Karnovsky (tampo fostato Srensn 0,1M, tampo fosfato
pH 7.2 contendo paraformaldedo 5% e glutaraldedo 2.5%) e encaminhado rotina
histolgica (RIBEIRO e LIMA, 2000) para serem desidratados em srie alcolica e
includos em historesina (Leica-historesin embedding kit). Seces de 3m foram
coradas com hematoxilina-eosina (HE) para observao em microscopia de luz.
Amostras para observaes em microscopia eletrnica de transmisso foram
fixadas durante 2h a 25C em glutaraldedo 3% e cido tnico 0.25% pH 7.3 em tampo
Millonig. Aps lavagem no mesmo tampo, as amostras foram ps-fixadas durante 1h
em tetrxido de smio 1% diludo no mesmo tampo, desidratadas em acetona e
includas em araldite (COTTA-PEREIRA et al., 1976). Seces ultrafinas (50-75 nm)
foram obtidas usando navalha de diamante e coradas com acetato de uranila 2% por 20
minutos (WATSON, 1958) e citrato de chumbo em soluo de hidrxido de sdio 1N
(VENABLE e COGGESHALL, 1965) durante 8 minutos, e examinados com
microscpio eletrnico Leo-Zeiss EM 906 operando a 80 kV.
Anlise morfomtrica
Para as anlises estereolgicas, cortes corados com hematoxilina-eosina foram
observados em microscpio Leica DM 4000B. Para cada animal, 25 campos foram
Zieri et al., 2010

Captulo 1
40
observados, utilizando o software de anlise de imagem (Image Pro-Plus, Media-
Cybernetics Inc.) baseando-se na diferena de intensidade de colorao para quantificar
a rea ocupada pelas clulas pigmentadas. Para anlise dos dados foram identificados
outliers e posteriormente foi realizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Para
dados paramtricos foi realizada anlise de varincia Two Way ANOVA. Quando os
dados foram no paramtricos, foi realizada a transformao com a utilizao de
logartimo, tornando-os paramtricos (ZAR, 1999). Foi utilizado teste de regresso
linear para correlacionar o ndice hepatossomtico (IHS) e o ndice gonadossomtico
(IGS) com a rea pigmentada do fgado e testculo, respectivamente.
RESULTADOS
O anuro Eupemphix nattereri apresenta comprimento rostro-cloacal de 4,31cm
0,32, medida tomada pelas extremidades anterior at a posterior do animal, e peso de
7,53g 1,08, apresentando o fgado como rgo de grande volume, quando comparado
aos demais rgos, com peso de 0,179g 0,028.
O fgado de E. nattereri constitudo por trs lobos, apresenta forma irregular e
cor vermelha intensa quando analisado in vivo devido grande vascularizao nesse
tecido. O rgo est disposto anteriormente na cavidade abdominal, estende-se at o
tero posterior, sobrepondo a maioria dos rgos da cavidade.
Anatomicamente, o fgado formado pelos lobos direito, mdio e esquerdo,
sendo esses ltimos maiores e parcialmente unidos no tero inicial. Entre os lobos
direito e mdio, est localizada a vescula biliar, estrutura volumosa e esfrica,
apresentando-se com uma colorao verde escura, vista por transparncia atravs de sua
parede delgada (Fig. 1A).
Zieri et al., 2010

Captulo 1
41
O rgo mantm sintopia com o corao em sua borda cranial, com os pulmes
em suas bordas laterais e face visceral. Est posteriormente relacionado ao estmago,
intestino, testculos e corpos adiposos com diferentes condies em razo dos estados
funcionais destes rgos (Fig. 1A).
No parnquima do fgado, quando analisado em seco longitudinal, observa-se
fileiras duplas de hepatcitos dispostos em arranjo cordonal, entre os quais so
observados uma grande quantidade de vasos sanguneos intimamente associados s
clulas hepticas, os sinusides hepticos, espalhados pelo tecido e de dimetro
varivel, com eritrcitos em seu interior (Fig. 1B). No tecido heptico tambm h
clulas do sistema imunolgico, os melanomacrfagos, que apresentam em seu
citoplasma grande quantidade de incluses de pigmento (Fig. 1B e 1C). Estas clulas
tambm denominadas clulas de Kupffer, mantm ntimo contato com as clulas
hepticas e com os sinusides (Figs. 1B, D e E).
Os hepatcitos so clulas de formato polidrico, com ncleo esfrico e
centralmente localizado, ocupando grande volume celular. Na regio central do ncleo
observa-se a presena de um nico nuclolo esfrico e bem evidente (Figs. 1D e E) e no
citoplasma so observados, por meio de eletromicrografia, grande quantidade de
mitocndrias, cisternas do Golgi e retculo endoplasmtico liso bem desenvolvidos,
alm de grande quantidade de glicognio. Tambm se observa canalculos biliares, com
a superfcie revestida por microvilos curtos, os quais se projetam para o lmen. Junto
aos canalculos visualiza-se uma confluncia de hepatcitos e a presena de junes
celulares, os desmossomos (Fig. 1F).
No tecido heptico foram encontrados dois diferentes tipos de clulas
fagocitrias. Uma delas (Fig. 1G), possui aspecto volumoso, dotadas de pseudpodes,
ncleo grande e central com cromatina frouxa, contendo incluses citoplasmticas. O
Zieri et al., 2010

Captulo 1
42
outro tipo celular aparentemente maior que o primeiro descrito, apresentando o
citoplasma com inmeras vesculas, o que confere clula uma colorao marrom
escura quando observada em microscopia de luz (Figs. 1C e D). A anlise da
ultraestrutura permite observar uma grande quantidade de pigmentos melnicos no
interior de corpsculos eltron-densos, formando os grnulos de melanina ou
melanossomos, em vrios graus de melanizao (Figs. 1H e I), alm de outros corpos de
incluso como vesculas grandes e irregulares contendo lipofuscina e vesculas
lisossmicas, tpica dos macrfagos.
Foi observada diferena na rea ocupada pelos melanomacrfagos no fgado de
E. nattereri entre os controles e os tratamentos nos animais tratados com cipionato de
testosterona, no qual o grupo tratado obteve um aumento da rea pigmentada de
aproximadamente 1,96 vezes em relao rea pigmentada do grupo controle (F1,12 =
6,395; p = 0.026). Quando os tratamentos so comparados, observa-se um aumento na
rea pigmentada do grupo com recuperao de mdio prazo de 1,82 vezes em relao ao
grupo com recuperao de curto prazo (F1,12 = 6,395; p = 0.049) (Figs. 2A, B e 3).
Os animais tratados com 17 -estradiol (F1,16 = 0,07; p = 0,794) e -MSH (F1,15 =
0,003; p = 0,959) no apresentaram diferenas na pigmentao do rgo quando
comparados aos grupos submetidos aos tratamentos hormonais e seus respectivos
controles, levando em conta os tempos de recuperao de cada tratamento, obtendo as
seguintes mdias para 17 -estradiol: 0,0173m 0,0075 para o controle com
recuperao imediata, 0,0183m 0,0127 para o controle com recuperao lenta,
0,0043m 0,0009 para tratamento com recuperao imediata e 0,0148 m 0,0060
para o tratamento com recuperao lenta. As mdias para o -MSH foram: 0,0581m
0,0405 para controle com recuperao imediata, 0,0699m 0,0529 para controle com
Zieri et al., 2010

Captulo 1
43
recuperao lenta, 0,0767m 0,0583 para tratamento com recuperao imediata e
0,0909m 0,0414 para tratamento com recuperao lenta.
No entanto, o fgado apresentou um aumento significativo no ndice
hepatossomtico (IHS) nos animais tratados com 17 -estradiol com recuperao
imediata de aproximadamente 1,3x em relao ao tratamento com recuperao lenta e
em relao aos grupos controles, com as seguintes mdias: IHS = 0,0220 0,0038 para
o controle com recuperao imediata, IHS = 0,0256 0,0043 para o controle com
recuperao lenta, IHS = 0,0320 0,0041 para o tratamento com recuperao imediata
e IHS = 0,0240 0,0035 para tratamento com recuperao lenta. No tratamento com
17 -estradiol tambm foi verificado, utilizando o ndice de regresso linear, uma
correlao negativa entre o IHS e a rea ocupada pelas clulas pigmentadas no fgado
(R = - 0,64; R2 = 0,42; F1,17=12,1; P=0,003).
DISCUSSO
O fgado do Eupemphix nattereri est localizado na regio anterior da cavidade
abdominal, em ntima associao com os demais rgos da cavidade. Apresenta-se
divido em trs lobos hepticos, no ocorrendo subdiviso do parnquima heptico em
lbulos, semelhante ao observado para alguns telesteos (BRUSL e ANADON, 1996;
BOMBONATO et al. 2007).
O arranjo dos hepatcitos nessa espcie, em seco longitudinal do fgado, do
tipo cordonal duplo, onde observada a presena de duas camadas de clulas
(FRANCO-BELUSSI et al., 2010). Esse arranjo em camada dupla de clulas relatado
para alguns peixes (BRUSL e ANADON, 1996) e rpteis (MOURA et al., 2009), em
contraste ao observado nos mamferos onde h predomnio de uma camada celular nica
(BRUSL e ANADON, 1996).
Zieri et al., 2010

Captulo 1
44
Estudos sobre a morfologia de rgos hematopoiticos de peixes descrevem a
presena de clulas pigmentadas, com atividade macrofgica, conhecidas como
melanomacrfagos (AGIUS, 1980; AGIUS e AGBEDE, 1984; ZUAST et al., 1990;
AGIUS e ROBERTS, 2003; JORDANOVA et al., 2008). Estas clulas, tambm
residentes no fgado de anfbios (SICHEL et al., 1997; ZUAST, 1998; PRELOVSEK e
BULOG, 2003) e rpteis (CHRISTIANSEN et al., 1996; RUND et al., 1998;
JOHNSON et al., 1999) so conhecidas como clulas de Kupffer, e apresentam
diferentes tipos de grnulos no citoplasma, os quais podem indicar substncias qumicas
diversificadas, como melanina, lipofuscina e hemosiderina, derivados da degradao de
material celular fagocitado (AGIUS e AGBEDE, 1984; HERRAEZ e ZAPATA, 1991;
AGIUS e ROBERTS, 2003; FRANCO-BELUSSI et al., 2010).
As clulas de Kupffer, tambm designadas macrfagos pigmentados, apresentam
morfologia tpica, que garante sua distino frente as demais clulas hepticas. Segundo
Corsaro et al., 2000, a presena de atividade enzimtica, tais como esterases no
especficas e peroxidases endgenas e ainda a habilidade fagoctica so caractersticas
que reforam a classificao dessas clulas como macrfagos, similar aos encontrados
nos mamferos, sendo includas no sistema mononuclear fagocitrio.
Como tem sido demonstrado em animais ectotrmicos, agrupamentos de clulas
pigmentadas esto presentes no fgado, localizadas principalmente na rea portal
(CORSARO et al., 2000), e a presena de pigmentos melnicos no interior dessas
clulas depende principalmente da sua habilidade de sintetizar e armazenar melanina no
interior dos melanossomos, e uma pequena parte derivada da fagocitose de
melanossomos de outras clulas pigmentadas (ZUAST et al. 1989; SICHEL et al.,
1997).
Zieri et al., 2010

Captulo 1
45
Alm dos grnulos de melanina, foi observada a presena de outras incluses no
citoplasma das clulas de Kupffer de E. nattereri como lipofuscina e hemosiderina, que
possivelmente so resultantes da oxidao de cidos graxos e da degradao de
hemcias respectivamente, como proposto para outras espcies (AGIUS e ROBERTS,
2003; FRANCO-BELUSSI et al., 2010), sendo fortes indicadores de atividade
fagocitria.
Outras semelhanas entre os melanomacrfagos de anfbios e as clulas de
Kupffer de mamferos foram demonstradas atravs de caractersticas histolgicas e
histoqumicas em Rana esculenta, Xenopus laevis, Triturus cristatus e Ambystoma
mexicanum (CORSARO et al. 2000), que tambm identificou dois principais tipos de
clulas de Kupffer no fgado desses animais, as pequenas e grandes clulas de Kupffer,
com morfologia e quantidade de pigmentos distintos, apresentando as pequenas clulas
uma menor quantidade de pigmentos e a superfcie celular menos regular quando
comparadas s grandes clulas de Kupffer. Esses dois tipos celulares tambm foram
identificados no tecido heptico de E. nattereri.
Anlises sobre a funo melanognica das clulas pigmentares no fgado de
Xenopus laevis (SICHEL et al., 1997), Rana esculenta (SICHEL et al., 1997 e
GALLONE et al., 2002) e Proteus anguinus (PRELOVSEK e BULOG, 2003),
demonstraram que h melanognese e esta atividade pode variar de acordo com a
sazonalidade, como demonstrado em R. esculenta (BARNI et al., 1999 e 2002) e
temperatura, como demonstrado em E. nattereri (SANTOS, 2010).
Estudos sobre mudanas na colorao de vertebrados tem sido investigados,
principalmente em relao a pigmentao dos cromatforos cutneos, submetidos a
tratamentos com melanotropinas (CASTRUCCI et al., 1984; HADLEY, et al., 1985;
FILADELFI e CASTRUCCI, 1994; BAGNARA e MATSUMOTO, 2006), nos quais, a
Zieri et al., 2010

Captulo 1
46
disperso dos gros de melanina dentro dos melancitos responde fortemente
exposio prolongada a alta concentrao de MSH. Em relao pigmentao interna,
principalmente relacionada s clulas de Kupffer, no que concerne a mudanas no
padro de pigmentao de rgos por induo hormonal, poucos trabalhos tem sido
realizados (GUIDA et al., 2004) e geralmente considera-se que as clulas pigmentares
internas so fracamente responsivas (ASPERGREN et al., 2009).
O presente estudo mostrou que dos animais tratados com esterides e com -
MSH e submetidos s anlises morfolgicas, apenas o hormnio cipionato de
testosterona promoveu um significante aumento na rea do fgado ocupada pelas clulas
pigmentares, no tratamento com recuperao lenta quando comparado ao tratamento
com recuperao imediata. Tambm foi observado aumento da rea pigmentada
heptica do tratamento com recuperao lenta em relao ao grupo controle, indicando
que o as clulas de Kupffer de E. nattereri responderam ao tratamento com cipionato de
testosterona e, o aumento da pigmentao, pode ser decorrente do aumento de atividade
melanossinttica, do aumento do nmero de clulas, ou ambos.
Quanto aos hormnios 17 -estradiol e -MSH, apesar de no terem promovido
resposta nas clulas pigmentadas do fgado, mediante estudos morfolgicos e
estereolgicos, anlises bioqumicas podem ser teis para detectar alteraes na
atividade da dopa-oxidase ou da tirosinase no fgado (ITO, et al., 2000; PURRELO et
al., 2001; GALLONE et al., 2002; GUIDA et al., 2004) em presena desses hormnios.
Trabalhos com -MSH in vitro em Xenopus, mostram que o -MSH possui uma
meia vida de cerca de 120 minutos, e que pode decair quando aplicado e analisado no
animal in vivo, pois a melanotropina est sujeita a ao do soro plasmtico que tem
efeito degradante sobre o peptdeo, ou pelo efeito sinergista com outros hormnios
plasmticos (CASTRUCCI et al., 1984; HADLEY et al., 1985). A no responsividade
Zieri et al., 2010

Captulo 1
47
das clulas de Kupffer de E. nattereri frente ao -MSH pode estar relacionado com
tempo mnimo de recuperao dos animais tratados, que foi de 24h.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao tcnico Luiz Roberto Falleiros Junior pela assistncia
nos procedimentos morfolgicos, ao MSc. Michel Varajo Garey pelo suporte nas
anlises estatsticas e CAPES, Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel
Superior, pelo apoio financeiro.
Zieri et al., 2010

Captulo 1
48
Figura 1. Aspectos anatmicos, histolgicos e ultraestruturais do fgado de E. nattereri. A- Fgado formado pelos
lobos direito (LD), mdio (LM) e esquerdo (LE) e vescula biliar (VB) em sintopia com os demais rgos da
cavidade. Corao (C), pulmo (P) e corpos adiposos (CA). B- Tecido heptico evidenciando o arranjo de suas
clulas e os melanomacrfagos (setas claras). C- Detalhe do melanomacrfago contendo grnulos de pigmentos
no citoplasma. D- Proximidade dos melanomacrfagos com os sinusides hepticos. Melanomacrfagos (MM),
hepatcitos (Hp) e hemcias (H). E- Eletromicrografia mostrando a interao dos melanomacrfagos (MM) com
hepatcitos (Hp) e a proximidade com sinusides contendo hemceas (H) em seu interior. F- Eletromicrografia
dos hepatcitos mostrando os canalculos biliares (CB), desmossomos (seta clara), complexo de Golgi (CG) e
retculo endoplasmtico liso (REL), G- Macrfago pequeno e pouco pigmentado, evidenciando ncleo (N),
pseudpodes (setas) e vescula fagoctica (*). H- Melanossomos em graus diferentes de melanizao. I-
Melanomacrfago tpico, contendo inmeros melanossomos e grandes incluses de lipofuscina (Lp).
Zieri et al., 2010

Captulo 1
49
- -
3.0 2.0 24h
- - 15d
3.2 2.5
-
3.4 -
- 3.0
3.6
-
- 3.5
3.8
- -
4.0 4.0
-
-
4.2
4.5
-
4.4 -
- 5.0
4.6
-
-
4.8
A 5.5 B
- -
5.0
Tratamento Controle 6.0
Tratamento Controle
Figura 2. Pigmentao no tecido heptico de E. nattereri tratados com cipionato de testosterona. (A) -
Diferenas na pigmentao entre o grupo tratado com cipionato de testosterona e o grupo controle. (B) -
Interao entre tratamento e o tempo de recuperao em animais tratados com cipionato de testosterona. (Ponto
= mdia; Barra desvio padro).
Controle Grupo tratado 24h Grupo tratado 15d
Figura 3. Pigmentao heptica de E. nattereri tratado com cipionato de testosterona mostrando aumento da rea
pigmentada dos tratamentos em relao ao grupo controle e entre o grupo tratado e recuperado durante 15 dias e
o grupo tratado e recuperado durante 24 horas.
Zieri et al., 2010

Captulo 1
50
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Captulo 2
56
Efeitos de Esterides Sexuais e do alpha-MSH sobre os
Melancitos Testiculares de Eupemphix nattereri (Anura):
Anlises Histolgicas, Estereolgicas e Ultraestruturais
Captulo 2
Zieri et al., 2010

Captulo 2
57
Efeitos de Esterides Sexuais e do alpha-MSH sobre os Melancitos Testiculares de
Eupemphix nattereri (Anura): Anlises Histolgicas, Estereolgicas e
Ultraestruturais
Rodrigo Zieri1
Lilian Franco-Belussi1
Lia Raquel de Souza Santos1
1

2
Preto SP.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
58
Resumo: Este trabalho buscou avaliar o efeito do hormnio estimulante de melanina (-
MSH) e dos esterides cipionato de testosterona e 17 -estradiol sobre a pigmentao
testicular no anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica, estereolgica e
ultraestrutural. Foram coletados 60 machos adultos, em So Jos do Rio Preto SP.
Aps os tratamentos hormonais, os animais foram submetidos s anlises morfolgicas
e estereolgicas. No interstcio testicular observou-se melancitos com inmeros
melanossomos. Para o grupo tratado com cipionato de testosterona foi observado um
aumento de aproximadamente 4x na rea pigmentada ocupada pelas clulas
pigmentadas nos testculos, quando comparados o tratamento e o controle. Os animais
tratados com 17--estradiol e -MSH no apresentaram diferenas na pigmentao
testicular.
Palavras-Chave: Anura, melancito, melanina, testosterona, estradiol, -MSH
Abstract: The present study aimed to characterize morphological and stereological
patterns of pigmented cells in testis of Eupemphix nattereri under effect of testosterone
cypionate, 17 -estradiol and -MSH. Morphological studies with light and
transmission electron microscopy were carried out in the groups. In the testis,
melanocytes-like cells are present in the interstitium. They presented large and irregular
aspect and a great amount of intensely pigmented cytoplasm. For the groups treated
with testosterone cypionate an increase of approximately 4x in the occupied area by the
pigmented cells in the testis was observed in the treatment group against the control.
The animals treated with 17--estradiol and -MSH did not show differences with
regard to organs pigmentation.
Keywords: Anuran, melanocyte, melanin, testosterone, estradiol, -MSH
Zieri et al., 2010

Captulo 2
59
INTRODUO
Em vertebrados ectotrmicos, tem sido descritas na epiderme e em diversos rgos
clulas semelhantes melancitos (AGIUS e AGBEDE, 1984; ZUAST et al., 1998;
OLIVEIRA e ZIERI, 2005; ZIERI et al., 2007; MORESCO e OLIVEIRA, 2009;
FRANCO-BELUSSI et al., 2009; FRANCO-BELUSSI et al., 2010), que produzem e
estocam melanina no interior de estruturas esfricas ou ovides, os melanossomos
(AGIUS e ROBERTS, 2003; ZIERI et al., 2007).
Os melancitos, comumente designados melanofros quando se trata de animais
ectotrmicos, so clulas grandes e irregulares, com o citoplasma abundante e
intensamente pigmentado, mostrando-se ao microscpio estereoscpio com aspecto
dendrtico, devido presena dos melanossomos espalhados pelos prolongamentos
citoplasmticos, ou puntiforme, quando no se observa esses prolongamentos, pela
ausncia dessas organelas que ficam concentradas na regio perinuclear (OLIVEIRA e
ZIERI, 2005).
Estas clulas, quando presentes na epiderme, conferem um importante mecanismo
de adaptao cromtica aos vertebrados ectotrmicos, caracterizado por mudanas
rpidas na colorao dos melancitos, ocasionadas por movimentos intracelulares de
pigmentos, podendo atuar como mecanismo de termorregulao, proteo contra
radiao, mimetismo, camuflagem e sinais comportamentais como medo ou raiva
(FILADELFI et al., 2005 e BAGNARA e HADLEY, 1973).
A translocao intracelular dos pigmentos, em peixes, controlada por hormnios
e por ao direta do sistema nervoso (FUJII, 2000), j em anfbios, a adaptao
cromtica esta sujeita exclusivamente ao controle hormonal (BAGNARA e HADLEY,
1973). Estudos com anfbios demonstram que os hormnios esterides influenciam na
Zieri et al., 2010

Captulo 2
60
pigmentao, e seus efeitos promoveram alterao na expresso dos cromatforos,
como observado por Richards (1982) e Hayes e Menendez (1999) em Hyperolius argus.
Em Leiuperdeos, famlia da qual a espcie Eupemphix nattereri faz parte, a
pigmentao testicular parece ser inerente aos integrantes do txon, como foi observado
em Physalaemus cuvieri (OLIVEIRA et al., 2002 e 2003, MORESCO e OLIVEIRA,
2009), P. fuscomaculatus (AOKI et al., 1969), E. nattereri (OLIVEIRA e ZIERI, 2005;
ZIERI et al., 2007; FRANCO-BELUSSI, et al., 2009), P. olfersii e Pseudopaludicola
falcipes (FRANCO-BELUSSI et al., 2009). Esses animais apresentam um grande
nmero de clulas pigmentadas na cpsula e no interstcio testicular, conferindo uma
tonalidade marrom escura s gnadas. Baseado nessa peculiar pigmentao, este
trabalho avaliou o efeito dos esteroides cipionato de testosterona e 17 -estradiol e do
hormnio estimulante de melancitos (-MSH) sobre os melancitos testiculares do
anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica, estereoscpica e
ultraestrutural.
MATERIAL E MTODOS
Preto, SP, em atividade reprodutiva, nas estaes chuvosas de 2008 e 2009 (Licena
IBAMA: 14731-1). Os exemplares foram aclimatados durante 7 dias, em terrrios
individuais, no Laboratrio de Anatomia Comparativa do Instituto de Biocincias,
Letras e Cincias Exatas de So Jos do Rio Preto, SP. A manipulao e os
experimentos foram feitos de acordo com o procedimento da Universidade Estadual
Paulista (UNESP) seguindo o guia de cuidados e uso de animais de laboratrio.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
61
Tratamento hormonal
Para o uso dos hormnios esterides, os animais coletados na estao chuvosa
de 2008, receberam injees subcutneas de cipionato de testosterona, dissolvido em
leo vegetal e aplicado a cada 48h por sete dias. Na anlise de curto prazo da condio
hiperandrognica, cinco exemplares foram eutanasiados 24h aps a aplicao do
hormnio e outros cinco, para anlise de mdio prazo, no dcimo quinto dia. Outro
grupo de dez exemplares foi tratado com injees subcutneas de 17 -estradiol (Sigma)
dissolvido em leo vegetal e aplicado a cada 48h por sete dias, nos quais cinco foram
sacrificados 24h aps a aplicao do hormnio e outros cinco no dcimo quinto dia.
Para o grupo controle (10 animais para cada tratamento), foram utilizadas injees
subcutneas somente com leo vegetal, sendo cinco sacrificados 24h aps a ltima
aplicao e o restante no dcimo quinto dia.
Para uso do hormnio MSH, os animais coletados na estao chuvosa de 2009,
receberam injees subcutneas de -MSH dissolvido em PBS e aplicado a cada 48h
por sete dias. Para cada espcie, foram utilizados 10 exemplares, nos quais cinco foram
sacrificados 24h aps a aplicao do hormnio e outros cinco no dcimo quinto dia. No
grupo controle (10 animais) foram aplicadas injees subcutneas contendo apenas
PBS. Cinco animais foram sacrificados para anlise imediata com 24h e o restante,
sacrificados no dcimo quinto dia a partir da ltima aplicao.
Para o uso dos hormnios esterides, cipionato de testosterona e 17 -estradiol
(Sigma), foi administrado uma dosagem de 0,5 mg/Kg corporal dissolvido em 0,05 ml
de leo vegetal (SANTOS, 2006). Para o -MSH foi administrado 2,5x10-7 mmol/10g
de -MSH (Sigma), dissolvido em 0,05 ml de PBS (adaptado de HADLEY et al. 1985).
Os animais foram pesados e dissecados por meio de inciso mediana na regio
ventral, expondo os rgos. Aps esse procedimento, o testculo direito foi removido,
Zieri et al., 2010

Captulo 2
62
pesado e imediatamente imerso em soluo fixadora Karnovsky (tampo fostato
Srensn 0,1M, tampo fosfato pH 7.2 contendo paraformaldedo 5% e glutaraldedo
2.5%) e encaminhado rotina histolgica (RIBEIRO e LIMA, 2000) para serem
desidratados em srie alcolica e includos em historesina (Leica-historesin embedding
kit). Seces de 3m foram coradas com hematoxilina-eosina (HE) para observao em
microscopia de luz.
Anlise em historresina
Para as anlises em historresina, cortes corados com hematoxilina-eosina foram
observados em microscpio Leica DM 4000B. Para cada animal, 25 campos foram
observados, utilizando o software de anlise de imagem (Image Pro-Plus, Media-
Cybernetics Inc.) baseando-se na diferena de intensidade de colorao para quantificar
a rea ocupada pelas clulas pigmentadas. Para anlise dos dados foram identificados
outliers e posteriormente foi realizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Para
dados paramtricos foi realizada anlise de varincia Two Way ANOVA. Quando os
dados foram no paramtricos, foi realizada a transformao com a utilizao de
logartimo, tornando-os paramtricos (ZAR, 1999).
Zieri et al., 2010

Captulo 2
63
RESULTADOS
As gnadas masculinas do anuro Eupemphix nattereri so estruturas ovides,
que apresentam comprimento e peso (gnada direita) de 4,82mm 0,78 e 0,17g 0,06
respectivamente. Os testculos apresentam uma conspcua colorao marrom escura sob
a cpsula testicular, visualizadas por transparncia da mesma, e ao redor dos lculos
seminferos, junto s demais clulas intersticiais, quando visualizadas pela microscopia
de luz (Figs. 1A e B).
A intensa pigmentao testicular se deve presena de melancitos que so
clulas de grande tamanho, quando comparadas s demais clulas intersticiais, e
possuem aspecto estrelado ou dendrtico devido s expanses citoplasmticas. Nos
processos dendrticos esto distribudos grnulos de pigmento marrom, conferindo ao
rgo tonalidade marrom escura ou preta em alguns casos. Os melancitos esto em
ntimo contato com as demais clulas do parnquima testicular (Fig. 1C) e
frequentemente so encontradas ao redor dos capilares sanguneos que nutrem o tecido
(Fig. 1D).
A anlise da ultraestrutura mostra que os melancitos apresentam o ncleo
grande e irregular, com cromatina condensada na regio perifrica e nuclolo bem
evidente. Espalhados ao redor do ncleo e pelo citoplasma dendrtico, encontra-se
grande quantidade de corpsculos ovais e eletrondensos contento melanina,
denominados melanossomos (Fig. 2A).
Os melancitos podem exibir melanossomos com diferentes tamanhos e graus de
melanizao, mostrando diferentes estgios de desenvolvimento e, geralmente, esto em
ntimo contato ou proximidade com outras clulas como fibroblastos (Figs. 2B e C),
clulas de Leydig e clulas miides, rodeados por uma grande quantidade de fibras
colgenas (Fig. 2C).
Zieri et al., 2010

Captulo 2
64
A regio citoplasmtica com ausncia de melanossomos, exibe escassez de
organelas com algumas cisternas de Golgi (Fig. 2D), e associados aos grnulos de
pigmentos h elementos do citoesqueleto como microtbulos e filamentos de actina
(Figs. 2D e E).
Observou-se diferena na rea ocupada pelos melancitos nos testculos de E.
nattereri entre os controles e os nos animais tratados com cipionato de testosterona, no
qual o grupo tratado obteve um aumento da rea pigmentada de aproximadamente 2
vezes em relao rea pigmentada do grupo controle (F1,12 = 6,395; p = 0.026) (Fig.
3A). Quando os tratamentos so comparados, no se observa diferenas entre eles.
Notvel diferena observada entre o tratamento com recuperao de mdio prazo e o
controle, com aumento da rea pigmentada de aproximadamente 4 vezes (F1,12 = 6,395;
p = 0.0001) (Figs. 3B e 4).
Os animais tratados com 17 -estradiol (F1,16 = 0,07; p = 0,794) e -MSH (F1,15 =
0,003; p = 0,959) no apresentaram diferenas na pigmentao do rgo quando
comparados os grupos submetidos aos tratamentos hormonais e seus respectivos
controles, levando em conta os tempos de recuperao de cada tratamento.
DISCUSSO
Animais ectotrmicos apresentam clulas com pigmentao citoplasmtica,
localizadas, alm da pele (TREVISAN et al., 1991), em diferentes rgos e estruturas
formando o sistema pigmentar extracutneo, de funo ainda pouco compreendida
(ZUASTI et al., 1988; OLIVEIRA e ZIERI, 2005), mas que tem recebido ateno para
decifrar seu significado biolgico, com estudos avaliando a influencia sazonal
(MORESCO e OLIVEIRA, 2009), influncia da temperatura e fotoperodo
(MORESCO, 2009), inflamao por lipopolissacardeo (LPS) de Escherichia coli
Zieri et al., 2010

Captulo 2
65
(FRANCO-BELUSSI, 2010) e caractersticas taxonmicas ou filogenticas (FRANCO-
BELUSSI et al., 2009).
Os melanforos so os tipos mais comuns de cromatforos e so responsveis
pela pigmentao dos vertebrados, sendo que em mamferos, os melanforos so
denominados melancitos (BAGNARA e MATSUMOTO, 2006; ASPERGREN et al.,
2009). Todas as clulas pigmentadas encontradas nesses animais originam-se a partir
da crista neural embrionria, os melanoblastos, que atravs da atividade migratria
atingem o rgo alvo e esto sujeitos a fatores presentes na prpria crista neural ou
fatores extrnsecos, encontrados durante a migrao ou quando alcanam o destino.
Esses fatores controlam a expresso das clulas determinando um padro de
pigmentao tpico. Alm da origem embrionria, as clulas pigmentadas dos
vertebrados tambm apresentam em comum a morfologia e o controle hormonal
(SICHEL et al., 1997; BAGNARA e MATSUMOTO, 2006).
Os melanforos so encontrados em diversas vsceras, e em algumas espcies de
anuros h ocorrncia nos testculos, na regio subcapsular e em ntimo contato com as
clulas intersticiais, como descrito para Pleurodema fuscomaculatum (= Physalaemus
fuscomaculatus) (AOKI et al., 1969), Bombina bombina (GOLLMANN et al., 1993),
Physalaemus cuvieri e Rhinella schneideri (OLIVEIRA et al., 2002, 2003; MORESCO
e OLIVEIRA, 2009), Eupemphix nattereri, Physalaemus centralis, P. marmoratus, P.
olfersii e genus Pseudopaludicola (OLIVEIRA e ZIERI, 2005, ZIERI et al., 2007,
FRANCO-BELUSSI et al., 2009). Caracterstica pouco comum em Hilydae e em
Leptodactylidae, nos quais h relatos de pouqussimos melancitos nas estruturas
urogenitais (face dorsal dos rins, mesrquio, corpos adiposos e na cpsula testicular) e
quando presentes, a quantidade destas clulas muito baixa e de fcil enumerao,
Zieri et al., 2010

Captulo 2
66
embora ocorram em maior quantidade em outros sistemas orgnicos (OLIVEIRA e
ZIERI, 2005; FRANCO-BELUSSI et al., 2009) .
Os melancitos/melanforos so clulas grandes e irregulares, com o citoplasma
pobre em organelas portando grande nmero de melanossomos e longos processos
dendrticos, com abundncia de elementos do citoesqueleto como microtbulos e
filamentos de actina, importantes na disperso e agregao dos pigmentos celulares
(AOKI et al., 1969; ZIERI et al., 2007). Os melanforos testiculares de E. nattereri,
apresentam melanossomos de diferentes tamanhos e graus de melanizao, que sugere a
ocorrncia de atividade melanognica como descrito por Sichel et al. (1997) e Gallone
et al. (2002) em Rana esculenta. A melanognese nos testculos de E. nattereri pode ser
evidenciada tambm pela presena de cisternas do Golgi em associao com vesculas
de secreo.
Alteraes morfolgicas e fisiolgicas na colorao dos animais ectotrmicos
so primariamente reguladas por hormnios, especialmente o hormnio estimulante de
melancitos (MSH). Melatonina, hormnio concentrador de melanforo (MCH) comum
em peixes, catecolaminas e hormnios sexuais apresentam papis mais restritos no que
concerne pigmentao. Em E. nattereri, foi observado notvel aumento na rea
ocupada pelos melancitos testiculares mediante a presena do hormnio cipionato de
testosterona. Zieri (2010), constatou que o cipionato de testosterona tambm atua nos
melanomacrfagos hepticos de E. natterei, aumentando a pigmentao do rgo.
Trabalhos com -MSH in vitro em Xenopus, mostram que o -MSH possui uma
meia vida de cerca de 120 minutos, e que pode decair quando aplicado e analisado no
animal in vivo, pois a melanotropina est sujeita a ao do soro plasmtico ou o efeito
sinergista de outros hormnios plasmticos (CASTRUCCI et al., 1984; HADLEY et al.,
Zieri et al., 2010

Captulo 2
67
1985). Essas consideraes podem ser uma explicao para a no responsividade dos
melanforos testiculares de E. nattereri frente ao -MSH.
Nos vertebrados, de modo geral, os hormnios esterides influenciam o padro
de pigmentao cutnea e tambm podem indicar o aparecimento de caractersticas
sexuais secundrias, principalmente em animais que possuem dimorfismo sexual, como
analisado no anuro Hyperolius viridiflavus (RICHARDS, 1982) e em H. argus (HAYES
e MENEDEZ, 1999). Em machos de E. nattereri, a expresso da pigmentao nas
clulas pigmentares dos testculos aumentam de acordo com o desenvolvimento e a
maturidade sexual, sendo que nos estdios iniciais de vida, o girino apresenta uma
colorao branca das gnada e o seu escurecimento pode estar relacionado com o
aumento do nvel de andrgeno masculino, indicando tambm maturidade sexual.
Segundo Bagnara e Matsumoto (2006), hormnios sexuais, podem influenciar o
desenvolvimento das clulas pigmentares, mas no so considerados fatores que
determinam ou modificam substancialmente o padro de pigmentao do adulto. Essas
consideraes podem explicar a ausncia ou fraca responsividade das clulas
pigmentadas nos rgos dos machos adultos em perodo reprodutivo, quando analisados
apenas seus aspectos morfolgicos, frente a aplicao dos homnios sexuais. Em
relao ao 17 -estradiol, tambm esperado uma baixa densidade de receptores nas
clulas testiculares para o andrgeno feminino em machos adultos de E. nattereri.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
68
Figura 1. Aspectos anatmicos e histolgicos do testculo de E. nattereri. A- Colorao escura, vista por
transparncia da tnica albugnea, na superfcie e principalmente na regio interlocular. Testculo (T),
Corpos adiposos abdominais (CA) na regio cranial da gnada. B- Seco testicular, mostrando o
interstcio e superfcie gonadal (seta) com clulas pigmentadas. C- Detalhe de um melancito testicular
de aspecto dendrtico com gros de melanina espalhados pelo citoplasma. (B e C) Colorao azul de
toluidina. D- Melancitos ao redor de vasos sanguneos (VS). Colorao HE.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
69
Figura 2. Aspectos ultraestruturais do testculo de E. nattereri. A- Melancito com citoplasma

dendrtico, repleto de grnulos de melanina. B- Melancitos com grnulos de melanina de diversos
tamanhos e graus de melanizao, apresentando diversos processos citoplasmticos (setas). C-
Fibroblasto (F) com ncleo grande e irregular e cromatina condensada na regio perifrica, prximo a
um melancito (M), rodeados por grande quantidade de colgeno (C). D- Detalhe do citoplasma do
melancito mostrando Complexo de Golgi. E- Detalhe do citoplasma do melancito mostrando
elementos do citoesqueleto: microtbulos (setas) e filamentos de actina (asterisco). N, ncleo; Nu,
nuclolo; M, melanossomo; F, fibroblastos; CG, complexo de Golgi; C, colgeno.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
70
Pigmentao testicular (m)

-3.2
-2.5
24h
-3.4 15d
-3.0
-3.6
-3.5
-3.8
-4.0
-4.0
-4.5
-4.2
-5.0
-4.4 -5.5
A B
-4.6 -6.0
Tratamento Controle Tratamento Controle
Figura 3. rea ocupada por melancitos nos testculos de E. nattereri, tratados com cipionato de testosterona. (A) -
Diferenas na pigmentao entre o grupo tratado com cipionato de testosterona e o grupo controle. (B) - Interao
entre tratamento e o tempo de recuperao em animais tratados com cipionato de testosterona. (Ponto = mdia; Barra
desvio padro).
Tratamento cipionato de testosterona
Grupo controle Grupo tratado 24h Grupo tratado 15 dias

Figura 4. Pigmentao testicular de E. nattereri tratado com cipionato de testosterona mostrando aumento da
rea pigmentada dos tratamentos em relao ao grupo controle com recuperao lenta.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
71
AGRADECIMENTOS
nos procedimentos morfolgicos, ao MSc. Michel Varajo Garey pelo suporte nas
anlises estatsticas e CAPES, Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel
Superior, pelo apoio financeiro.
Zieri et al., 2010

Captulo 2
72
Fish Biology. 24 (4): 471-488.
Mikroskopische Anatomie. 98 (1): 9-16.
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BAGNARA, J.T.; HADLEY, M.E. 1973. Chromatophores and Color Change: The
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BAGNARA, J.T.; MATSUMOTO, J. 2006. Comparative anatomy and physiology of
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Zieri et al., 2010

Captulo 2
73
FILADELFI, A.M.C.; VIEIRA, A.; LOUZADA, M.L. 2005. Circadian rhythm of
physiological color change in the amphibian Bufo ictericus under different
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Jahrbuecher Abteillung Fuer Systematik Oekologie und Geographie Der Tiere.
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Captulo 2
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MORESCO, R.M. 2009. Anlise dos Melancitos Viscerais em Anuros (Rhinella
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fmeas do gerbilo: avaliao estrutural, citoqumica e imunocitoqumica. 154f.
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TREVISAN, P., PEDERZOLI, A., BAROZZI, G. 1991. Pigmentary system of the
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Zieri et al., 2010

Captulo 2
76
Cytology. 61(4): 305-316.
Zieri et al., 2010

Captulo 3
77
Morfologia testicular com nfase na via seminfera
intratesticular de Eupemphix nattereri (anura)
Captulo 3
Zieri et al., 2010

Captulo 3
78
Morfologia testicular com nfase na via seminfera intratesticular de Eupemphix
nattereri (anura)
Rodrigo Zieri1
Lilian Franco Belussi1
Juliana Rodrigues de Souza2
1

2
Preto SP.
Zieri et al., 2010

Captulo 3
79
Resumo: De modo geral, os testculos de anuros apresentam epitlio germinativo
formado por lculos seminferos no interior dos quais encontram-se os cistos
espermatognicos. So rgos de natureza glandular, atuando na produo de
testosterona e de espermatozides. Este estudo caracterizou a via intratesticular de
conduo de gametas do anuro Eupemphix nattereri, mediante anlise histolgica e
ultraestrutural. Foram utilizados 10 machos adultos de Eupemphix nattereri, coletados
na regio de So Jos do Rio Preto, SP e submetidos aos procedimentos morfolgicos.
Em E. nattereri, os dctulos apresentam epitlio simples, no ciliado, e um reduzido
sistema de endomembranas no citoplasma das clulas ductulares, as quais apresentam
uma fraca colorao com (PAS), indicando que, diferentemente dos mamferos, os
dctulos esto relacionados exclusivamente com a conduo de smem.
Palavras-chave: Anura, Eupemphix nattereri, testculo, dctulos eferentes.
Abstract: In general, the anuran testis present a germ epithelium organized in
seminiferous locules, where cystic spermatogenesis occurs. The testis are glandular
organs that are responsible for testosterone and sperm production. The present study
aimed to characterize the morphology of intratesticular efferent ductules in the anuran
Eupemphix nattereri. Ten adult males were collected in the region of So Jos do Rio
Preto, So Paulo State, Brazil. Morphological studies using light and transmission
electron microscopy were carried out. In E. nattereri, the ductules present a simple and
ciliated epithelium with scarce system of endomembranes inside the ductular cells
cytoplasm. These cells exhibit weak PAS staining, indicating that the ductules are
exclusively related to semen conduction.
Keywords: Anuran, Eupemphix nattereri, testis, efferent ductules
Zieri et al., 2010

Captulo 3
80
INTRODUO
Nos anuros, os testculos so descritos como rgos pares, arredondados,
compactos, de cor geralmente amarelada, esbranquiada ou branco-leitosa. Podem
apresentar variaes anatmicas de forma e peso de acordo com o perodo reprodutivo
(DUELLMAN e TRUEB, 1994), alm de outras alteraes morfofuncionais associadas
reproduo (LOFTS 1974), como descrito para algumas espcies (MONTERO e
PISAN 1990, 1992, LAMPO e MEDIALDEA 1996, HUANG et al. 1997, OLIVEIRA
e VICENTINI 1998).
Quanto arquitetura morfolgica, os testculos so revestidos pela tnica
albugnea, que confina o parnquima testicular constitudo por tecido germinativo
arranjado em lculos seminferos delimitados por tecido conjuntivo frouxo (OLIVEIRA
e VICENTINI 1998, OLIVEIRA et al. 2002, OLIVEIRA et al. 2003, OLIVEIRA e
ZIERI, 2005).
Estudos referentes ao sistema reprodutor dos anuros Eupemphix nattereri
(OLIVEIRA e ZIERI, 2005; ZIERI et al., 2007) e Pleurodema fuscomaculatum (AOKI,
1969) evidenciam a presena de diferentes tipos celulares no interstcio testicular, como
melancitos, clulas miide e fibroblastos, que ocorrem juntamente com uma grande
quantidade de colgeno, alm da presena de ductos eferentes e vasos sanguneos
espalhados pelo tecido. Dentre as clulas intersticiais, destaca-se tipos celulares que
possuem organelas comparveis s descritas para as clulas de Leydig em mamferos,
evidenciando seu envolvimento na biossntese de hormnios sexuais (AOKI, 1969).
Em relao fisiologia testicular, os andrgenos so produtos testiculares de
grande importncia, sintetizados a partir do colesterol em uma srie de reaes de
hidroxilao e oxirreduo, catalisados por enzimas nas membranas mitocondrial e
microssomal das clulas de Leydig (HALL, 1994). Esses hormnios assumem um
Zieri et al., 2010

Captulo 3
81
importante papel na reproduo, influenciando o processo espermatognico, alm da
estreita relao que apresenta durante o desenvolvimento de caracteres sexuais
secundrios (DISTRIA et al., 1974; RASTOGI et al., 1976; SPECKER e MOORE,
1980; ITOH e ISHII, 1990).
A morfologia e fisiologia do sistema reprodutor, principalmente relacionados a
via de transporte de gametas e tambm no que se refere a influncia de hormnios na
estrutura gonadal dos anfbios foram realizados em salamandras (WILLIAMS et al.,
1984; PUDNEY et al., 1983; FRAILE et al., 1989; SPERONE et al., 2009) e anuros
(HIRAGOND e SAIDAPUR, 2000; SAIDAPUR et al., 2001; CANOSA e CEBALLOS,
2001; DENARI e CEBALLOS, 2005; CANOSA et al., 2003; ROSEMBLIT et al., 2006;
FERREIRA et al., 2009). Devido ao fato de existirem poucos trabalhos sobre a
morfologia dos rgos e estruturas do aparelho reprodutor masculino dos anuros,
especialmente nos animais de regies neotropicais, o propsito deste trabalho foi
caracterizar a via seminfera intratesticular de conduo de gametas do anuro
Eupemphix nattereri.
MATERIAL E MTODOS
Preto, SP, em atividade reprodutiva, nas estaes chuvosas de 2008 (Licena IBAMA:
14731-1). Os exemplares foram aclimatados durante 7 dias, em terrrios individuais, no
Laboratrio de Anatomia Comparativa do Instituto de Biocincias, Letras e Cincias
Exatas de So Jos do Rio Preto, SP, onde foram anestesiados, eutanasiados e
submetidos aos estudos morfolgicos. A manipulao e os experimentos foram feitos
Zieri et al., 2010

Captulo 3
82
de acordo com o guia tico da Universidade Estadual Paulista (UNESP) seguindo o guia
de cuidados e uso de animais de laboratrio.
Os animais foram pesados e dissecados por meio de inciso mediana na regio
ventral, expondo os rgos no interior da cavidade celomtica. Aps esse procedimento,
o testculo direito foi removido, pesado e imediatamente imerso em soluo fixadora
Karnovsky (tampo fostato Srensn 0,1M, tampo fosfato pH 7.2 contendo
paraformaldedo 5% e glutaraldedo 2.5%) e encaminhado rotina histolgica
(RIBEIRO e LIMA, 2000) para serem desidratados em srie alcolica e includos em
historesina (Leica-historesin embedding kit). Seces de 3m foram coradas com
hematoxilina-eosina (HE), periodic acid-Schiff (PAS) e reticulina de Gomori para
observao em microscopia de luz.
RESULTADOS
As gnadas masculinas do anuro Eupemphix nattereri apresentam geralmente
formato ovide, podendo ocorrer assimetrias em relao ao tamanho, colorao e
Zieri et al., 2010

Captulo 3
83
posio dentro da cavidade corporal. A gnada direita possui cerca de 4,82mm 0,78
de comprimento e pesa cerca de 0,17g 0,06 (Fig. 1A).
Os testculos apresentam uma conspcua colorao marrom escura sob a cpsula
testicular, visualizadas por transparncia da mesma, e ao redor epitlio seminfero, em
contato com as demais clulas intersticiais, quando analisadas pela microscopia de luz
(Fig . 1A-C).
Histologicamente, os testculos de Eupemphix nattereri apresentam, em
determinadas regies, estroma mais desenvolvido, onde so observadas maior
quantidade clulas intersticiais, vasos sanguneos, melancitos e o sistema de conduo
dos espermatozides formados pelos dctulos eferentes intratesticulares (Fig. 1B). O
epitlio germinativo constitudo por lculos seminferos de dimetro varivel, no
interior dos quais observa-se clulas no mesmo estdio de diferenciao que se agrupam
em estruturas denominadas cistos espermatognicos ou espermatocistos (Fig. 1C).
Quando empregado a tcnica de PAS, foi observada uma forte marcao das
clulas de Sertoli, localizadas na base do epitlio germinativo, entretanto, os dctulos
eferentes, localizados no estroma, apresentaram uma fraca marcao quando analisados
com PAS (Figs. 2A, B e D). No estroma, ao redor dos dctulos eferentes, tambm se
observa uma grande quantidade de fibras colgenas e reticulares, detectadas pela tcnica
de reticulina de Gomori (Fig. 2C).
Os dctulos seminferos apresentam-se longos e dispersos no estroma,
constituindo uma via muito ramificada (Figs. 2B e C), compondo o sistema de dctulos
eferentes intratesticulares (Fig. 2A), e quando localizados na regio prxima cpsula
testicular, em maior densidade, constituem a via subcapsular (Fig. 2B).
Zieri et al., 2010

Captulo 3
84
Morfologicamente, os dctulos eferentes apresentam um epitlio simples, com
altura uniforme, comumente circundados por fibroblastos e melancitos (Figs. 2D e E).
Estes ltimos tipos celulares conferem ao testculo uma tonalidade escura (Fig. 1A).
Ultraestruturalmente, o ncleo das clulas epiteliais multilobulado,
polimrfico, volumoso e localizado na regio central da clula, com um nuclolo bem
evidente (Figs. 2E e F). No citoplasma observa-se vesculas lipdicas e reduzido sistema
de endomembranas de secreo celular, como retculo endoplasmtico rugoso e
complexo de Golgi (Fig. 2F).
DISCUSSO
Nos vertebrados, de forma geral, as gnadas so descritas como rgos pares,
de aspecto alongado em animais com corpo delgado (maioria dos peixes, ceclias e
urodelos) ou como uma estrutura compacta, ovide ou cilndrica e em alguns peixes
cartilaginosos, anuros e amniotas. Em relao ao par de testculos, no rara a
ocorrncia de assimetrias de tamanho, posio e colorao (HILDEBRAND, 1995;
OLIVEIRA e VICENTINI, 1998; OLIVEIRA e ZIERI, 2005; FRANCO-BELUSSI et
al., 2009), como observado em Eupemphix nattereri.
Histologicamente, os testculos so constitudos por uma rede de estruturas
seminferas convolutas circundadas externamente pela tnica albugnea. Entre os
elementos seminferos, encontram-se no estroma testicular, vasos sanguneos, nervos,
clulas de Leydig, fibroblastos, melancitos, dctulos eferentes, alm de outros
elementos do tecido conjuntivo (LOFTS 1974, ROMER e PARSONS 1985,
DUELLMAN e TRUEB 1994, HILDEBRAND 1995; ZIERI et al., 2007). Essa
arquitetura histolgica verificada em E. nattereri, e apresenta similaridades com a
morfologia testicular descrita para outras espcies de anuros, dentro da famlia
Zieri et al., 2010

Captulo 3
85
Leiuperidae (AOKI et al., 1969; OLIVEIRA et al., 2002), Hylidae (TABOGA e
DOLDER, 1991; LEE e KWON, 1992; MONTERO e PISAN, 1992; OLIVEIRA e
VICENTINI, 1998; OLIVEIRA et al. 2003; SANTOS e OLIVEIRA, 2008), Bufonidae
(OLIVEIRA et al., 2007) e Leptodactylidae (FERREIRA et al., 2009).
Nossos resultados mostram que a via seminfera intratesticular de E. nattereri,
analisados durante o perodo reprodutivo, formada por um proeminente sistema
ductular, interligado e distribudo por todo o tecido intersticial. Nas proximidades da
regio subcapsular, onde o estroma mais desenvolvido, h ocorrncia de maior
quantidade de ductos. Em Dendropsophus minutus (SANTOS e OLIVEIRA, 2007) e
Scinax fuscovarius (OLIVEIRA e VICENTINI, 1998) os lculos seminferos
apresentam elevada proximidade, quando analisados durante o perodo reprodutivo,
dificultando a visualizao dos dctulos no escasso tecido intersticial.
Anlises da morfologia testicular do anuro Polypedates maculatus
(Rhacophoridae), mostra que a existncia de um desenvolvido sistema de dctulos com
disposio longitudinal no interior dos testculos, semelhante ao descrito para E.
nattereri, pode ter se desenvolvido juntamente com a organizao radial do lbulos
seminferos de urodelas (LOFTS, 1984), e podem representar uma primitiva rede
testicular (KANAMADI e JIRANKALI, 1992).
Quanto a morfologia dos dctulos eferentes, vrios trabalhos indicam que existe
variaes de uma espcie para outra, e ainda entre os segmentos na mesma espcie,
podendo em alguns casos existir at trs segmentos distintos, com base em seu contedo
e tipo celular, como ocorre em alguns mamferos (AIRE e MERWE, 2003). Tais
caractersticas tambm so encontradas nos testculos do lagarto Sitana ponticeriana
(AKBARSHA et al., 2007) e de Caimam crocodilus (GUERRERO et al., 2004), os
quais compartilham muitas caractersticas em comum com outros rpteis, aves e
Zieri et al., 2010

Captulo 3
86
mamferos. No anuro E. nattereri, os dctulos apresentam epitlio simples, no ciliado,
e um reduzido sistema de endomembranas no citoplasma das clulas ductulares, as
quais apresentam uma fraca colorao com (PAS), indicando que, diferentemente dos
mamferos, os dctulos esto relacionados exclusivamente com a conduo de smem.
AGRADECIMENTOS
nos procedimentos morfolgicos e CAPES, Coordenao de Aperfeioamento de
Pessoal de Nvel Superior, pelo apoio financeiro.
Zieri et al., 2010

Captulo 3
87
Figura 1. Aspectos anatmicos e histolgicos do testculo de Eupemphix nattereri. A- Testculos

pigmentados (T), localizados na cavidade abdominal e presos pelo mesrquio (seta clara). B-
Seco testicular evidenciando os dctulos eferentes intratesticulares (setas claras) e estroma
desenvolvido, contendo melancitos (m). C- Seco testicular mostrando a organizao locular
do epitlio germinativo (setas) e a presena de cistos espermatognicos (crculo), com escasso
tecido intersticial. (ca)= corpos adiposos; (R)= rim; (b)= bao; (Ez)= espermatozides; (L)=
lmen.
Zieri et al., 2010

Captulo 3
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Figura 2. Seces do testculo de Eupemphix nattereri. A- Estroma mostrando os dctulos intratesticulares

(di) (setas) e clulas de Sertoli marcadas com PAS (asterisco). B- Dctulos intratesticulares (di) (setas) e
estroma desenvolvido (asteriscos) (PAS). C- Dctulos intratesticulares (di) em corte longitudinal com fibras
colgenas ao redor (reticulina de Gomori). D- Seco tranversal mostrando fraca marcao com PAS e
fibroblasto ao redor do dctulo (cabea de seta). E- Ultramicrografia do dctulo intratesticular mostrando
um epitlio simples e uniforme, rodeado por fibroblastos (cabea de seta) e melancitos (seta clara). (L)=
lmen; (C)= colgeno. F- Ultramicrografia do dctulo mostrando a membrana basal (setas) e citoplasma
com gotculas de lipdio (asteriscos escuros) e reduzido sistema de endomembranas (asteriscos claros). (N)=
ncleo; (nu)= nuclolo.
Zieri et al., 2010
Captulo 3
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Zieri et al., 2010

Captulo 3
94
Zieri et al., 2010

Concluses
95
2. CONCLUSES
As mudanas de colorao que ocorrem em todos os vertebrados podem ser
classificadas em morfolgicas ou fisiolgicas. As mudanas fisiolgicas dependem de
mecanismos celulares de disperso e agregao de pigmentos dentro dos cromatforos,
resultando respectivamente no escurecimento ou clareamento da pele em curto tempo.
Em anfbios, a adaptao cromtica est sujeita exclusivamente ao controle hormonal.
Pouco se sabe a respeito da pigmentao interna e geralmente considera-se que
essas clulas pigmentares so pouco responsivas em comparao aos melanforos
cutneos. Sendo assim, foram feitas algumas consideraes respeito do sistema
pigmentar extracutneo de E. nattereri, submetidos aos experimentos com os hormnios
sexuais e -MSH, e morfologia dos rgos nos quais se encontram esses pigmentos.
1. As clulas de Kupffer presentes no fgado, apresentam morfologia tpica e
apresentam diferentes tipos de grnulos citoplasmticos, os quais podem
indicar substncias qumicas diversificadas, incluindo a melanina, sendo por
essa razo tambm denominadas de melanomacrfagos.
2. A melanossntese no interior das clulas de Kupffer e nos melancitos
testiculares pode ser evidenciada pela presena de grnulos de pigmento com
diferentes graus de melanizao.
3. As clulas de Kupffer e os melancitos responderam ao tratamento com
cipionato de testosterona e, o aumento da pigmentao, pode ser decorrente
do aumento da atividade melanossinttica, do aumento do nmero de
clulas, ou ambos.
4. Os melancitos testiculares so clulas grandes e irregulares, com o
citoplasma pobre em organelas portando grande nmero de melanossomos e
longos processos dendrticos, com abundncia de elementos do citoesqueleto
Zieri et al., 2010

Concluses
96
como microtbulos e filamentos de actina, importantes na disperso e
agregao dos pigmentos celulares.
5. A arquitetura histolgica dos testculos apresenta similaridades com a
morfologia testicular descrita para outras espcies de anuros.
6. A via seminfera intratesticular formada por um proeminente sistema
ductular, interligado e distribudo por todo o tecido intersticial. Em regies
onde estroma mais desenvolvido, h ocorrncia de maior quantidade de
ductos.
Zieri et al., 2010

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INFLUNCIA HORMONAL SOBRE O SISTEMA PIGMENTAR EM

Eupemphix nattereri (ANURA): EFEITOS DO ALPHA-MSH,

INSTITUTO DE BIOCINCIAS, LETRAS E CINCIAS EXATAS

SO JOS DO RIO PRETO - SP

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOLOGIA ANIMAL

INFLUNCIA HORMONAL SOBRE O SISTEMA PIGMENTAR EM EUPEMPHIX NATTERERI

(ANURA): EFEITOS DO ALPHA-MSH , ESTRADIOL E TESTOSTERONA

Tese apresentada para obteno do ttulo

ORIENTADOR: PROF. DR. CLASSIUS DE OLIVEIRA

CO-ORIENTADOR: PROF. DR. SEBASTIO ROBERTO TABOGA

Orientador: Classius de Oliveira

1. Clulas pigmentares viscerais. 2. Anuro - Morfologia. 3. Eupemphix

Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE

Influncia Hormonal sobre o Sistema Pigmentar em Eupemphix nattereri (Anura):

Efeitos do alpha-MSH , Estradiol e Testosterona

Prof. Dr. Classius de Oliveira

Prof. Dr. Rejane Maira Ges,

Prof. Dr. Patrcia Simone Leite Vilamaior

Prof. Dr. Selma Maria Almeida Santos

Prof. Dr. Wagner Jos Fvaro

Prof. Dr. Maria Terclia Vilela de Azeredo Oliveira

Prof. Dr. Silvana Gisele Pegorin de Campos

Prof. Dr. Sandra Regina de Carvalho Marchesin

So Jos do Rio Preto, 01 de junho de 2010

Aos meus pais, Maria e Alcio, lies de vida.

Isabella. Estarei sempre ao seu lado.

Pequena Jlia, que teu caminho seja pleno de alegrias.

Zieri et al., 2010

Nesse especial e particular momento, fruto de trabalho, alegrias, tropeos,

sonhos e principalmente amizades, exponho a minha ntima e honesta gratido a cada

fizeram ou ainda fazem parte de minha vida.

fundamental importncia para minha formao acadmica e pessoal. Devo-lhe muita

Exemplo a ser seguido.

Juliana Rodrigues de Souza, Juliane S. Freitas, Mariana Navarro, Silvia Rosana

pelo aprendizado e companheirismo.

Especialmente s amigas Lia Raquel de Souza Santos e Lilian Franco Belussi,

pela amizade e cumplicidade. Obrigado pela oportunidade de termos crescidos juntos da

maneira mais harmnica possvel. Contem sempre comigo.

Ao meu co-orientador Sebastio Roberto Taboga, pelos ensinamentos e

disposio para ajudar sempre. timo profissional. Serei eternamente grato.

Ao Centro de Microscopia, coordenado pelo Professor Dr. Sebastio Roberto

importncia para a realizao deste trabalho.

Ao tcnico do Centro de Microscopia e amigo Luiz Roberto Falleiros Junior,

pela assistncia laboratorial, pela convivncia e pelos momentos de descontrao. Muito

Zieri et al., 2010

Aos professores que participaram de minha formao, sinceros reconhecimentos

Ao amigo Michel Varajo Garey, pelo grande auxlio com as anlises

estatsticas. Obrigado irmo (Man).

Aos meus queridos e atuais companheiros de Repblica S/N ou Tromba

e Adriano Mondini (orgulho). Desejo vocs um futuro brilhante e espero nunca

desfazer esse lao que fizemos. Amo todos vocs.

Aos amigos da extinta Repblica Toca do Largato pelos muitos anos de

convivncia, sofrimentos, alegrias e festas (que no foram poucas). Uso novamente

por mim. Irmo caula assim mesmo. Amo vocs.

mais alegria. To pequena e j to importante.

Ao meu sobrinho, concebido pouco. Ser muito bem vindo.

Ao primo Arlindo Pedro Santana e ao cunhado Paulo H. Carminati, pela ajuda e

de Aguiar, Angelita Capobianco, Bianca C. Lisboa, Carmlia, Carolina Panin Candeira,

Zieri et al., 2010

memorian), Gabriel Queirz Pereira, Glaura S. Fernandes, Isabella Mariana de Assis,

Renata Ferrari, Renato Romero, Rita L. Peruquetti, Tiago da Silveira Vasconcelos,

trupe, Adriano Mondini, Aline Chimello Ferreira, Ana Carolina Buzzo