ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHE

La leche es una secrecin natural de la glndula mamaria de los animales

mamferos. La denominacin de leche, sin indicacin de la especie, se refiere a la leche
de vaca.
Se entiende por leche natural el producto integro, no alterado ni adulterado y
sin calostros del ordeo higinico, regular, completo e ininterrumpido de vacas sanas,
y bien alimentadas (Decreto 2478/1966de 6 de octubre; B.O.E. 7-10-66).
Por su composicin y su elevada actividad de agua, la leche es un medio
excelente para el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos; composicin
y pH permiten el desarrollo de una amplia variedad de bacterias, hongos y levaduras.
El desarrollo microbiano en la leche origina una serie de modificaciones
qumicas que pueden dar lugar a:
Procesos tiles para la elaboracin de otros productos (queso, yogur)
Procesos alterativos con repercusiones sanitarias y comerciales.
El desarrollo incontrolado de microorganismos provoca defectos en la leche
causando una disminucin en sus propiedades nutritivas y organolpticas. Por otra
parte, puede ser adems vehculo de bacterias patgenas para el hombre
(Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Salmonella, Escherichia coli enteropatgena,
Listeria monocytogenes).
La leche, aunque proceda de vacas sanas y se haya obtenido en las mejores
condiciones de higiene, resulta siempre contaminada en mayor o menor grado por la
presencia de microorganismos saprfitos del pezn y de los canales galactforos,
considerando como carga mnima de un ordeo completo la tasa de 100-500 u.f.c./ml.
Posteriormente al ordeo puede haber fuentes adicionales de contaminacin por un
mal almacenamiento y/o manipulacin.
Tras el ordeo, durante la primera hora se produce una ligera disminucin de la
carga microbiana debido a la accin de sustancias inhibidoras presentes en la leche
(lactenina, lactoperoxidasa y lisozima). A continuacin, dependiendo de la
temperatura y del tiempo de conservacin va a haber un incremento diferencial de los
diferentes grupos de microorganismos:
- en refrigeracin: psicrotrofos (Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, especies
psicrotrofas de Bacillus), de modo que si el almacenamiento se prolonga en el tiempo
se produce finalmente un deterioro del producto.
- temperaturas superiores: principalmente bacterias cido lcticas (segn carga
microbiana el resto no puede competir) que producen cido lctico causando la
acidificacin y coagulacin de la leche. Si no se detiene el proceso, un descenso
excesivo del pH causa inhibicin de las bacterias cido lcticas a la vez que propicia el
crecimiento de otros microorganismos mas acidfilos (diversas bacterias y hongos)
provocando un proceso de putrefaccin.
Evaluacin de la calidad microbiolgica de una muestra de leche cruda

Prueba de la reductasa con azul de metileno. Es una medida indirecta de la

carga microbiana. Se observa el proceso de reduccin del colorante que vira de
azul a blanco y que es llevado a cabo por las enzimas bacterianas.
PROTOCOLO:
Se mezclan en un tubo estril 9 ml de leche cruda o pasteurizada y 1 ml de azul
de metileno (0,05g/100ml H2O) y se incuba a 37C
Cambio de color:
15-20 minutos: alta contaminacin
1 hora: contaminacin intermedia
2-3 horas: niveles de contaminacin aceptables

Recuento de microorganismos aerobios mesfilos. Refleja la calidad sanitaria

del producto pero tiene un valor limitado como indicador de la presencia de
patgenos. Salvo en productos que vayan a ser posteriormente fermentados,
es desaconsejable un valor alto, valores superiores a 10 6-107/ml son signo de
una inmediata alteracin del producto.
PROTOCOLO:
Tras realizar una serie de diluciones decimales (0,5 ml en 4,5 ml de agua de
triptona) a partir de la muestra de leche cruda, se siembra por mezcla 1ml de
las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 en medio slido PCA (Plant Count Agar PCA)
antes de que polimerice el agar. Los cultivos se incubarn a 30C durante 48
horas. Transcurrido el tiempo de incubacin se cuentan las colonias en aquellas
placas que muestren entre 30 y 300 colonias aisladas. Tras el recuento se
calcula la media, previamente corregidos los datos respecto a la dilucin, y se
determina el total de microorganismos por mililitro de la muestra de leche
analizada.

Recuento de psicrotrofos.
PROTOCOLO:
De igual forma, se siembra por mezcla 1 ml de las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 en
el mismo medio. Esta vez los cultivos se incubarn a 4C de 7-10 das.
Siguiendo el mismo mtodo que en el apartado anterior se determina el total
de microorganismos que han crecido por mililitro de la muestra de leche
analizada

Recuento de termorresistentes
PROTOCOLO:
Se calientan 5 ml de leche cruda a 70C durante 10 minutos. Nuevamente,
realizamos 4 diluciones decimales seriadas y sembramos por mezcla 1 ml de las
diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 en medio PCA (Plant Count Agar PCA). Los
cultivos se incubarn a 30C durante 48 horas.
Se determina el total de microorganismos que han crecido por mililitro de la
muestra de leche analizada
 Recuento de Enterobacterias lactosa-positivas (coliformes). Determina la
presencia de microorganismos pertenecientes a la Familia Enterobacteriaceae y
que se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con produccin
de cido y gas tras su incubacin a 30-37C. Estas bacterias estn presentes en
el intestino del hombre y diversos animales homeotermos, aunque tambin
pueden aparecer en otros ambientes como suelo, asociadas a plantas. .
Aunque su especificidad como indicadores no es alta, su presencia se utiliza
como ndice de contaminacin fecal.
PROTOCOLO:
Se siembra por extensin sendas placas de medio VRBL slido con 0,1 ml de las
diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 y se incuban a 37C durante 24 horas. Se determina
el total de microorganismos que han crecido por mililitro de la muestra de
leche analizada. El medio VRBL lleva en su composicin cristal violeta y sales
biliares que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram+. Adems la
fermentacin de la Lactosa acidifica el medio, esto hace que el indicador de pH
rojo neutro vire a rojo prpura (aparecen en la placa colonias prpuras) y causa
la precipitacin de las sales biliares que pueden generar un halo alrededor de
las colonias.

COMPOSICIN DE LOS MEDIOS A UTILIZAR

Plant Count Agar (PCA) (g/l):

Triptona 10
Extracto de levadura 2,5
Glucosa 1
Agar bacteriolgico 15

VRBL (g/l) (NO AUTOCLAVAR):

Triptona 7
Extracto de levadura 3
Lactosa 10
Sales biliares 1,5
Cloruro sdico 5
Rojo neutro 0,03
Cristal violeta 0,002
Agar bacteriolgico 15
MTODO DE DILUCIONES SERIADAS

0,5 ml
Dilution
0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml

4,5 ml

ml