MICROBIOLOGA GENERAL

2016

TRABAJO PRCTICO N 3

CRECIMIENTO BACTERIANO Y

EFECTO DE LOS ANTIBITICOS

 NDICE

CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBITICOS ............................................................... 1

1. CRECIMIENTO BACTERIANO ........................................................................................................ 1
1.1. Cintica del crecimiento ...................................................................................................... 1
1.2. Crecimiento balanceado...................................................................................................... 2
1.3. Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido ......................................... 4
2. EFECTO DE LOS ANTIBITICOS .................................................................................................... 6
2.1. Inhibidores de la biosintesis de la pared celular bacteriana ............................................... 7
2.2. Antibiticos que interfieren en la biosntesis de protenas ................................................ 9
TRABAJO PRCTICO ............................................................................................................................... 11
1. Medicin de la actividad antimicrobiana .................................................................................. 11
1.1. Mtodo de dilucin en tubo .............................................................................................. 11
1.2. Mtodo de la difusin en agar (Antibiograma) ................................................................. 11
2. Cintica de crecimiento ............................................................................................................. 12
3. Recuento de clulas viables ...................................................................................................... 12
CUESTIONARIO GUA ............................................................................................................................. 13
PROBLEMAS........................................................................................................................................... 14
 CRECIMIENTO BACTERIANO Y EFECTO DE LOS ANTIBITICOS

1. CRECIMIENTO BACTERIANO

Se define al crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los
elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que
eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin
se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares lo que ocurre es
un aumento de la poblacin.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:

cintica del crecimiento;
factores que afectan al tiempo de generacin (g);
factores ambientales que estimulan o limitan el crecimiento.

En este trabajo prctico estudiaremos las caractersticas cinticas de un cultivo bacteriano y los
efectos que tienen sobre el mismo el agregado de antibiticos y los cambios en las condiciones de
cultivo.

1.1. Cintica del crecimiento

El crecimiento de una poblacin o cultivo bacteriano se puede expresar en funcin de:
aumento de masa del cultivo
aumento del nmero de clulas
La medida de la masa bacteriana puede realizarse por mtodos directos como la determinacin del
peso hmedo o peso seco, o por mtodos indirectos, como la turbidimetra.

Mtodos directos:
a. Determinacin del peso hmedo:
1. se tara un tubo de centrfuga;
2. se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
3. se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su
vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

b. Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado
(105 C, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-
15% de los valores de peso hmedo.
Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastante error en la determinacin:
es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso
seco equivale aprximadamente a unas 5x109 bacterias.

-1-
Mtodos indirectos
a. Mtodos turbidimtricos (pticos):
La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o
transmitida a travs de un cultivo bacteriano.
Recordemos aqu que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula
pequea suspendida en agua. La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional al
nmero de clulas en suspensin y a la masa del cultivo.
Espectrofotmetro: Este equipo es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o
Bioqumica. El mismo hace incidir un haz de luz de una determinada longitud de onda () sobre una
muestra lquida y mide la cantidad de esta luz que es absorbida y/o dispersada por la muestra. La
fraccin de luz que es capaz de atravesar la muestra se denomina transmitancia (T). La absorbancia
(A) o densidad ptica (DO) se define como
DO = A = - log T
Es decir que la DO es una medida de la luz absorbida y/o dispersada por la muestra
Para medir turbidez utilizamos un haz de luz de =600 nm, ya que es sabido que los cultivos
bacterianos no presentan una absorcin significativa a esta longitud de onda. En estas condiciones el
valor de DO obtenido se deber completamente a la luz dispersada por la muestra, y se podr
correlacionar entonces la DO con la turbidez y por ende, con la concentracin de clulas en cultivo
Si uno quisiera determinar la masa bacteriana o el nmero de clulas a partir de mediciones pticas,
se debera realizar una curva de calibracin previa y determinar el grado de correlacin entre ambas
variables.

1.2. Crecimiento balanceado

Una poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen
constantes todos sus parmetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento
por unidad de tiempo de masa celular, no de clulas, ADN, ARN, protenas, etc., es un valor constante
y similar en cada caso.
Durante este crecimiento, una clula madre es capaz de originar dos clulas hijas, por lo que el
cultivo se comporta como una reaccin autocataltica de primer orden y sigue una cintica
exponencial:
velocidad de aumento del componente = K{cantidad del componente}
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el
que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera,
aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad
de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (), que es caracterstico para
cada cepa bacteriana cultivada en un medio determinado.
En trminos matemticos la velocidad de crecimiento de cualquier componente Z en un tiempo corto
puede expresarse como:
dZ/dt = . Z

-2-
Expresin matemtica del crecimiento balanceado:
Para deducirla vamos a aprovechar la definicin emprica anterior, atendiendo por un lado al
aumento de la masa celular, y por otro al incremento del nmero de individuos. En funcin del
aumento de masa celular:
Podemos decir que en condiciones de crecimiento exponencial:
(dM/M)/dt = dM/M = dt
Integrando esta ltima expresin, se puede deducir que:
ln[M/M0] = (t-t0)
ln M - ln M0 = (t-t0)
Despejando la variable M:
ln M = ln M0 + (t-t0)
Forma exponencial:
M= M0 e . (t-t0)
Se puede deducir que en condiciones de crecimiento exponencial existe una relacin lineal entre el
logaritmo de M y el tiempo.
A partir de las frmulas anteriores se puede calcular al coeficiente como:
= ln (M/M0) /(t-t0)
Supongamos que partimos de una clula, tras una divisin celular, tendremos 2, tras dos divisiones
tendremos 4, luego 8, etc. Esto constituye una serie geomtrica: 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n (donde n es es
nmero de generaciones transcurridas).
Si en vez de partir de una clula partimos de N0 clulas iniciales, la expresin se convierte en:
N = N02n N/N0 = 2n
Por otro lado, el nmero de generaciones se puede calcular fcilmente teniendo en cuenta el tiempo
transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin (g)
n = (t-t0)/g
Sustituyendo esta expresin en la frmula anterior tenemos:
N/N0 = 2 (t-t0) / g
Aplicando logaritmos neperianos obtenemos que:
ln (N/N0)= [ (t-t0)/g ] ln2
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemticas que
hemos deducido, basadas en la masa o en nmero de individuos son equivalentes, por lo tanto:
ln (M/M0) = ln (N/N0)
= ln (M/M0) / (t-t0) = [ (t-t0)/g ] ln 2 / (t-t0)
Simplificando el trmino (t-t0) en la expresin anterior:
= ln 2 / g = 0.693 / g (expresado en h-1 o min-1)
Esta es la expresin matemtica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del tiempo
medio de generacin (g), en condiciones de crecimiento exponencial.

-3-
En un medio ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es = mx, o sea, el mximo valor
posible del coeficiente para esa cepa en ese medio (Crecimiento balanceado no restringido).
En un medio donde la concentracin de algn nutriente sea limitante, el crecimiento balanceado es
de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al mximo, y se puede
calcular a partir de la frmula emprica siguiente:
= mx [S] / (KS + [S])
donde [S] es la concentracin del nutriente limitante; KS es la constante de saturacin,
correspondiente a la concentracin de nutriente en la cual el coeficiente es es equivalente a la
mitad del mx.
Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por ) es una funcin hiperblica de la
concentracin del sustrato (nutriente) limitante. Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de
energa, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.
En la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio,
tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o
se acumulan sustancias de desecho, entonces se establece un sistema cerrado cuyas caractersticas
se describen a continuacin:

1.3. Curva de crecimiento en un sistema cerrado en medio lquido

El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases.
Fase de retardo (fase "lag"): Es el perodo de tiempo durante el que el inculo bacteriano se adapta
a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un perodo de ajuste
metablico. Su duracin depende de varios factores:
tamao del inculo
estado metablico previo del inculo: si el inculo procede de clulas en fase estacionaria de
un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros
metabolitos celulares son bajos, y las clulas deben reponerlos en el medio fresco. Si las clulas
estn daadas por algn agente, el tiempo de esta fase ser mayor ya que necesitan reparar estos
daos para luego iniciar el crecimiento. Si las clulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en
fase logartmica, el lag ser ms corto ya que poseen un metabolistmo activo y niveles adecuados de
los metabolitos intracelulares.
medio del que procede el inculo: si el medio es similar al medio fresco, el lag ser ms
corto. Si el medio original del inculo era un medio rico y el medio fresco es nutricionalmente ms
pobre, la fase de retardo ser ms larga ya que las bacterias necesitarn un tiempo adicional para
activar la sntesis de las enzimas biosintticas que estaban reprimidas en el medio rico. Pero an
cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logartmica, cuyo medio sea idntico al
medio fresco, se observa siempre una fase lag. Por qu?:
necesidad de neutralizar sustancias txicas en el medio fresco.
diferencia en la temperatura de los medios.
porque puede producirse dilucin de metabolitos intracelulares.

Fase de crecimiento exponencial (fase logartmica). En el comienzo de este perodo, cada clula
entra en crecimiento exponencial con un cierto desfasaje respecto de sus compaeras. Ello
demuestra que las clulas del inculo no estn todas en las mismas condiciones fisiolgicas.

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El grfico superior muestra
una curva de crecimiento
tpica para un sistema
cerrado en medio lquido.
En este caso el crecimiento
es monitoreado a travs de
mediciones de Densidad
Optica (DO).

El grfico inferior resulta de

la aplicacin de la funcin
logaritmo neperiano para
cada punto de la curva de
crecimiento anterior.
Es en este grfico donde se
observa claramente la
extensin de la fase
exponencial como el lapso
en que el grfico se ajusta a
una recta. La pendiente de
esta recta corresponde al
valor de mx.

Durante la fase logartmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas

generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generacin (g) es caracterstico para cada
especie o cepa, en cada medio concreto:
El valor del tiempo de generacin (g) depende de:
composicin del medio
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos hetertrofos comnmente utilizados en el laboratorio suelen crecer ms

rpidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintticos, y dentro de estos ltimos,
mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono.

Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo
(= 0), pero an existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento se equilibra con la muerte
celular, visualizndose como un estancamiento en el crecimiento neto del cultivo.
En este perodo se agotan determinados nutrientes y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el
pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la transicin entre las fases exponencial y estacionaria (de
aceleracin negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes
alternativas (por ejemplo, puede recurrir a metabolizar aminocidos como fuente de carbono una
vez agotados los azcares).

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En la fase estacionaria an existen reacciones metablicas, pero el metabolismo general de la
bacteria es sustancialmente diferente al de la fase logartmica:
las clulas son ms pequeas, debido a que existe divisin celular despus de que se haya
detenido el incremento de masa.
el citoplasma se condensa.
en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma.
el nucleoide se condensa, por sustitucin de ciertas protenas que se unen a ADN.
la membrana citoplsmica se hace menos fluida.
suelen ser ms resistentes a agentes fsicos (temperatura, estrs osmtico) y qumicos.
existe un cambio en el patrn de expresin gentica: disminuye la expresin de cientos de
genes que haban estado expresndose durante la fase exponencial, mientras que se activan unos
50-100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria). Estos genes se transcriben
mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada del factor sigma S caracterstico de esta fase
de crecimiento.
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares.
baja el contenido en ARN.

Fase de muerte: Se da muerte y lisis masiva del cultivo. Se debe al agotamiento de reservas de
energa y la imposibilidad de llevar a cabo las reacciones bsicas para el mantenimiento de la clula.
Algunas veces las clulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost").
Dependiendo de la especie y el cultivo utilizado, la fase de muerte puede presentar una cintica
exponencial, caracterizada por un de muerte, que en este caso ser negativo. La pendiente de esta
curva tambin vara segn la especie (por ejemplo, en bacterias entricas es suave, mientras que en
Bacillus es ms acentuada).

2. EFECTO DE LOS ANTIBITICOS

Los antibiticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres vivos
(antibiticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibiticos semisintticos),
que a pequeas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas o microbiostticos).
La mayor parte de los antibiticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos
procariotas (Streptomyces, Myxococcus, Bacillus, entre otras) o eucariotas (hongos de los gneros
Penicillium, Cephalosporium, etc).
La mayor parte de los antibiticos comerciales se emplean para tratar enfermedades de etiologa
bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos presentan actividad
antitumoral.
La mayora de los antibiticos son molculas complejas, con regiones hidrofbicas que facilitan el
transporte al interior celular. Muchos poseen estructuras cclicas, claves en la interaccin de la
molcula con su diana macromolecular.
Para estudiarlos es ms til agrupar a los antibiticos no segn su naturaleza qumica, sino en
funcin de los blancos sobre los que actan y con los que interfieren:
A) antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular
B) antibiticos que actan sobre la membrana celular
C) antibiticos que inhiben la sntesis de protenas
D) antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos.
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Los antibiticos ms abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas de la
biosntesis del peptidoglicano de las eubacterias, y los que interfieren con la funcin del ribosoma.

2.1. Inhibidores de la biosintesis de la pared celular bacteriana

Fosfomicina (fosfonomicina)
Este antibitico de estructura muy simple est producido por
Streptomyces fradiae. Su accin inhibitoria es ejercida a nivel de la
primera reaccin de la sntesis del peptidoglicano (PG), a saber,
impidiendo la condensacin reductora del UDP-NAG con el PEP para dar
UDP-NAM. Ello lo logra unindose con la enzima transferasa correspondiente, inactivndola.
Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado aplicacin en la
clnica.

Cicloserina
Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibitico muestra cierto
parecido estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que acta
como inhibidor competitivo de las dos reacciones secuenciales de la sntesis
del PG donde aparece la D-ala:
inhibe la racemasa que cataliza la conversin de L-ala en D-ala;
inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para
dar el dipptido D-ala-D-ala).
La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos enzimas.
Es un antibitico de amplio espectro, pero apenas se emplea clnicamente, debido a su
neurotoxicidad. Se recurre a l slo para tratar ciertos casos de tuberculosis, en combinacin con
otros antibiticos.

Vancomicina
Es un glucopptido complejo producido por
Streptomyces orientalis. Se une rpida e
irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina
del pentapptido del precursor del PG que se halla
unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana
citoplsmica), de modo que inhibe la reaccin de
transglucosidacin.
Es un antibitico de espectro estrecho, bactericida
frente a muchas bacterias Gram-positivas.
Recientemente se est usando frente a infecciones
severas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus
pneumoniae que sean resistentes a otros antibiticos. Es la droga de eleccin ante colitis asociadas a
antibiticos ocasionadas por Clostridium difficile.

Ristocetina
Es un antibitico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual que la
vancomicina inhibe la transglucosidacin, siendo activo frente a Gram-positivas.

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Bacitracina
Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de
ah su nombre), es un antibitico polipeptdico
provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a
muchos Gram-positivos as como frente al Gram-
negativo Neisseria. Es demasiado txico (sobre todo
nefrotxico) como para ser administrado
sistmicamente, pero tiene uso tpico (p. ej., en
ciruga del colon).
Su mecanismo de accin estriba en que se une al
pirofosfato del undecaprenil-P-P, e impide su regeneracin hasta undecaprenil-P por la fosfatasa
especfica; por lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosinttico del PG.

Antibioticos -lactmicos
Todos los antibiticos de este grupo contienen un anillo caracterstico: el anillo -lactmico. La
importancia de las penicilinas radica en que fueron los primeros compuestos antibiticos naturales
en descubrirse. Con el paso del tiempo se fueron descubriendo otros compuestos que presentan el
mismo anillo -lactmico, pero que presentan variantes estructurales y por lo tanto se agrupan en
familias diferentes a la penicilina:

El poder de estos antibiticos reside fundamentalmente en su anillo -lactmico, por lo que el

mecanismo de accin de todos ellos es el mismo:
Inhiben el sistema enzimtico implicado en la reaccin de transpeptidacin del peptidoglicano
naciente, impidiendo los entrecruzamientos entre cadenas de PG.
Esta inhibicin de la reaccin de transpeptidacin causa:
acumulacin de precursores del PG, sin ensamblar;
activacin de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que hidrilozan el PG maduro
de la bacteria.
En Gram-positivas, adems, se produce desorganizacin de los cidos teicoicos y
lipoteicoicos. (En este tipo de bacterias son estos cidos los que regularan la activacin de
las autolisinas).

Por ello todas las penicilinas son bactericidas lticos sobre bacterias en crecimiento activo y
en medios hipotnicos respecto al interior celular.
En caso de que la bacteria se encuentre creciendo en un medio de cultivo isotnico, se
generar una clula sin pared denominada protoplasto, pero ste no se lisar.
Si la bacteria no se encuentra en crecimiento, no habr sntesis de pared celular ni
renovacin ("turn over") de la misma. En estas condiciones la penicilina no tendr una "diana" sobre
la que actuar y por lo tanto, la bacteria sobrevivir. Esta es la causa general de las "recadas" de

-8-
muchas infecciones, una vez que se ha dado por terminado prematuramente el tratamiento de un
paciente con un antibitico -lactmico.

2.2. Antibiticos que interfieren en la biosntesis de protenas

Los antibiticos que interfieren en la sntesis de protenas son muy variados y abundantes, y la
mayora de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los que se unen a protenas
ribosmicas y/o a alguno de los ARN ribosmicos. Nosotros vamos a detenernos principalmente en
aquellos antibiticos que afectan a la elongacin de la cadena naciente del polipptido. Obviamente,
los ms tiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procariticos,
pero no sobre los 80S eucariticos. Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento
de la elongacin de la cadena polipeptdica, podemos agruparlos segn la fase concreta de la
elongacin sobre la que actan:
inhibicin del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del ribosoma;
introduccin de errores en la lectura de los ARNm;
inhibicin de la reaccin de formacin del enlace peptdico;
inhibicin de la traslocacin del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.
bloqueo de los factores de elongacin.

Inhibidores de la fase inicial de la elongacion (del reconocimiento y entrada del aa-ARNt al sitio "A"
del ribosoma)

Tetraciclinas
Son antibiticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas,
Gram-negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas),
producidos por distintas especies de Streptomyces. Actan como
bacteriostticos, siempre y cuando las bacterias estn en
crecimiento activo. Como se puede ver por su espectro, son tiles
incluso contra bacterias que viven como parsitos intracelulares (como las Rickettsias), debido a que
su carcter hidrofbico facilita su difusin a travs de membranas.
Mecanismo de accin: Provocan que la unin del aa-ARNt al sitio A del ribosoma sea inestable y est
distorsionada, con lo cual se evita la elongacin de la cadena. In vitro actan tanto frente a
ribosomas 70S como frente a los 80S. Entonces, por qu in vivo slo inhiben a las bacterias? La
explicacin est en el hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma
"suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad 30S, se une a las
protenas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el efecto que hemos descrito en el prrafo
anterior.
Efectos secundarios:
Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la flora
autctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintticas evitan este problema.
Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daos a huesos y dientes, y tiendo los
dientes de amarillo en los nios.

Antibiticos inhibidores de la formacin del enlace peptdico

Se trata de un grupo variado y heterogneo de agentes antibacterianos que interfieren con el centro
peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma.

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Cloranfenicol (antes llamado cloromicetina)
Antiguamente la industria lo obtena a partir de Streptomyces
venezuelae, pero actualmente es ms barato fabricarlo por sntesis
qumica. Es un bacteriosttico de amplio espectro. Se absorbe bien
va oral y penetra bien en todos los tejidos, incluyendo cerebro y
lquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a meningitis
ocasionadas por Haemophilus influenzae, as como tratamiento de fiebres tifoideas y anaerobios
Gram-negativos.
Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresin de mdula sea
(aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en pases de Occidente, aunque se receta demasiado
en el Tercer Mundo.
Mecanismo de accin: Se une a varios sitios de la subunidad 50S, entre los cuales el ms importante
es la protena L16, que forma parte del centro peptidil-transferasa, cerca del sitio del ribosoma
donde encaja el extremo aminoacil del ARNt, en el sitio A.
El cloranfenicol ha sido muy til en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza los polisomas
rpidamente.

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 TRABAJO PRCTICO

1. Medicin de la actividad antimicrobiana

1.1. Mtodo de dilucin en tubo
La actividad antimicrobiana se mide determinando la concetracin ms pequea del agente
que se necesita para inhibir el crecimiento de un organismo control, valor que se conoce como
concentracin inhibitoria mnima (CIM). A partir de este dato puede determinarse si es posible
tratar una infeccin causada por ese microorganismo con ese antimicrobiano, o no. Si la CIM es
menor que la concentracin de antimicrobiano que se alcanza en los tejidos de cuerpo humano, el
tratamiento puede tener xito, y el microorganismo se considera sensible; en caso contrario
fracasar, y el microorganismo se considera resistente.

a) Preparar un tubo de hemlisis con 1 mL de LB lquido, con una concentracin de

cloranfenicol de 200 g/mL. A partir del mismo preparar 5 diluciones seriadas al medio. En el ltimo
tubo, los 0.5 mL sobrante debe descartarse de manera de que todos los tubos tengan el mismo
volumen.
Inocular todos los tubos de la serie
con la cepa de Bacillus subtilis MC530.

b) Repetir la preparacin de las

diluciones partiendo de una
concentracin inicial de cloranfenicol
de 25g/ml.
Inocular todos los tubos de la serie
con la cepa de Bacillus subtilis JH642.

En ambos se agregarn 2 tubos de

hemlisis con 0.5 mL de LB cada uno:
Uno se inocular con la cepa de B.
subtilis correspondiente (Control
positivo) y uno se dejar sin inocular (Control negativo).

Despus de la incubacin a 37C con agitacin durante una noche, observar en qu tubos no ha
habido crecimiento (indicado por turbidez visible) e informar la CIM de cada una de las cepas.
1.2. Mtodo de la difusin en agar (Antibiograma)
Un antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un
microorganismo ante distintos compuestos antimicrobianos. Las
distintas especies y variantes microbianas presentan distintos grados
de sensibilidad a los diversos agentes, de ah que sea necesario hacer
una evaluacin para poder seleccionar el compuesto ms apropiado
para el tratamiento de una infeccin bacteriana.
a) Preparar el inculo: suspensin del microorganismo al cual
se le determinar la sensibilidad al antibitico (B. subtilis JH642 o
MC530).

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 b) Sembrar 100 l del inculo de la cepa bacteriana a ensayar con esptula de Drigalsky en
una placa de LB.
c) Aplicar un set de discos de antibiticos sobre la placa (agregar a cada disco 5 l de distintas
concentraciones de Cloranfenicol 40 mg/ml, 5 mg/ml y 2.5 mg/ml, y 10 l de Kanamicina 10 mg/ml,
antes de aplicar sobre la placa)
d) Incubar 16 horas a 37C y observar el desarrollo de crecimiento.

Durante la incubacin el agente difunde desde el papel de filtro al agar: cuanto ms se aleja del papel
menor es la concentracin del agente. A una cierta distancia del disco se alcanza la CIM. Pasado ese
punto hay crecimiento, pero ms cerca del disco no lo hay. Se crea por lo tanto una zona de
inhibicin, y el dimetro de esta zona es proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano
aadida al disco y a la efectividad del agente.

Este mtodo se utiliza rutinariamente para ensayos de sensibilidad a los antibiticos de los
microorganismos patgenos.

2. Cintica de crecimiento
a) Inocular un erlenmeyer con 80 ml de medio LB lquido con un cultivo saturado de E. coli, de
manera de lograr una DO inicial de 0.1. Incubar a 37 C con agitacin.
b) Cuando el cultivo haya alcanzado una DO aproximada de 0.3 dividir en 4 alcuotas de 15 ml
cada una:
cultivo control: Sin agregados
Cultivo Ap200: se le agregar el antibitico ampicilina en cantidad suficiente para alcanzar
una concentracin final de 200 g/ml.
Cultivo Cm40: se le agregar el antibitico cloranfenicol en cantidad suficiente para alcanzar
una concentracin final de 40 g/ml.
Cultivo Tc100: se le agregar el antibitico tetraciclina en cantidad suficiente para alcanzar
una concentracin final de 100 g/ml.
c) Continuar la incubacin y tomar alcuotas de 1 ml cada 30 minutos. Sobre estas alcuotas se
medir la DO.
d) Graficar DO en funcin del tiempo para cada uno de los cultivos.
e) Graficar ln DO en funcin del tiempo para cada uno de los cultivos.
f) Discutir los efectos de cada uno de los antibiticos sobre el crecimiento del cultivo.
g) Calcular los parmetros mx y g para el cultivo sin agregado de antibiticos.

3. Recuento de clulas viables

a) Realizar diluciones seriadas hasta un orden de 10-7 a partir de un cultivo de E. coli a DO 0.3-
0.5
b) Sembrar las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 en placas de LB utilizando esptula de Drigalsky.
c) Incubar una noche a 37C y hacer el recuento de colonias en la placa que corresponda.

- 12 -
 CUESTIONARIO GUA

1. Qu tcnicas pueden utilizarse para medir el crecimiento bacteriano? Cules son las ventajas y
desventajas de cada una de ellas?

2. A qu se denomina metabolito secundario? Puede utilizarse su produccin para evaluar el

crecimiento de un cultivo?

3. Que fenmenos ocurren durante la fase lag de crecimiento? Qu factores afectan la duracin del
perodo lag?

4. Qu factores influyen sobre la velocidad de crecimiento?

5. Cmo se calcula la velocidad mxima de crecimiento en un cultivo cerrado? y el tiempo de

generacin?

6. Cmo se puede mantener un microorganismo en fase exponencial de crecimiento por un perodo

continuado de tiempo?

7. Cmo se calcula el rendimiento celular?

8. Si luego de 2 das de cultivo no se obtiene desarrollo de un dado microorganismo ni a 10C ni a

45C, puede concluir que ese microorganismo no crece a esas temperaturas?

9. Por qu deben realizarse diluciones para realizar el recuento de clulas viables?

10. Cuando se realiza un recuento de clulas viables, qu es lo que se cuenta y qu es lo que se

asume?

11. Cmo diferencia un agente bactericida de un bacteriosttico?

12. Cul es el blanco de los antibiticos betalactmicos? Cul es su mecanismo de accin?

13. Para qu realizara un antibiograma en un diagnstico clnico?

14. Cmo se podra determinar si los microorganismos contenidos dentro una zona de inhibicin del
crecimiento estn muertos o solo inhibidos?

15. Explique la importancia de incluir controles positivos y negativos en un ensayo de CIM.

- 13 -
 PROBLEMAS

1. Se desean estudiar las caractersticas de crecimiento de dos especies bacterianas Q.O.T. aisladas a
partir de una muestra de suelo. Las especies en cuestin, denominadas cepa A y cepa B, fueron
caracterizadas nutricionalmente hallndose que la cepa A posee una auxotrofa para el aminocido
(L)-leucina y mientras que la cepa B es prottrofa para este aminocido y es productora de al menos
una sustancia con actividad antibitica, sintetizada desde el comienzo de la fase exponencial tarda
de crecimiento. Luego de cultivarse por separado las cepas A y B en medio sinttico mnimo, se
obtuvieron los resultados dados a continuacin.
ln D.O.
Tiempo (h)
Cepa A Cepa B
0 0.095 0.182
1 0.139 0.182
2 0.530 0.405
3 0.910 0.693
4 1.609 1.029
5 2.300 1.386
6 2.990 1.568
7 3.400 1.609
8 3.690 1.705
9 3.800 1.705
10 3.850 1.723
11 3.850 1.740
12 3.850 1.723

a) Calcule la mxima de crecimiento y el tiempo de generacin (g) para cada cepa bacteriana.
b) Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo apto para el crecimiento de cada cepa
bacteriana por separado.

- 14 -
 A continuacin los microorganismos A y B son crecidos juntos en el mismo medio de cultivo
sinttico mnimo obtenindose los datos siguientes:
ln (N cl. viables / ml)
Tiempo (h)
Cepa A Cepa B
0 11.51 11.61
1 11.61 11.61
2 12.07 11.95
3 12.30 12.30
4 12.90 12.64
5 13.59 13.00
6 14.28 13.33
7 14.40 14.15
8 14.00 15.42
9 13.59 16.70
10 13.22 17.97
11 12.21 19.24
12 9.21 20.51

c) Confeccione un medio de cultivo sinttico mnimo para el crecimiento conjunto de las cepas A y B.
d) Calcule mxima de crecimiento de las cepas A y B. Cmo explica Ud. los resultados obtenidos al
comparar estos datos con los de la respuesta a la pregunta 1, anterior situacin en la cual los
microorganismos A y B fueron crecidos separadamente?

2. Se desea conocer el nmero de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml), de un

cultivo de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se realizaron tres diluciones 1:100, y una
dilucin 1:10. Se sembraron con esptula de Drigalski 0,1 ml de la tercera y cuarta dilucin, por
triplicado. En la tercera dilucin se contaron 50, 55 y 48 colonias, mientras que en la cuarta el
recuento arroj 1, 3 y 3 colonias.
a- Qu significado tiene el trmino UFC/ml?
b- Cul de las dos diluciones se usa para calcular el nmero de UFC/ml? Justifique.
c- Calcule en nmero de UFC/ml del cultivo original.
d- Este mtodo de cuantificacin de microorganismos determina:
I. nmero total de microorganismos.
II. nmero de microorganismos viables.
III. nmero de microorganismos muertos.

- 15 -
3. Para estudiar el efecto y mecanismo de accin de un antibitico se llevaron a cabo los siguientes
experimentos:

a. Recuento del nmero de clulas viables.

El ensayo del antibitico (ATB) se realiz sobre una cepa de Bacillus subtilis sensible (S) y una
resistente (R); el antibitico fue agregado en una concentracin de 100 g/ml, 150 minutos despus
de iniciado el cultivo.
Los valores informados son unidades formadoras de colonias por mililitro de cultivo.

S y R con antibitico.
TIEMPO (minutos) S sin antibitico S con antibitico
S sin antibitico
0 1.0 x 103 1.1 x 103 1.1 x 103
30 1.0 x 103 1.2 x 103 1.2 x 103
60 1.5 x 103 1.3 x 103 1.2 x 103
90 4.0 x 104 4.2 x 104 4.1 x 104
120 4.0 x 105 4.1 x 105 4.0 x 105
150 4.0 x 106 3.9 x 106 3.8 x 106
180 4.2 x 107 4.1 x 107 4.0 x 106
210 3.7 x 108 3.6 x 108 9.0 x 105
240 4.3 x 108 4.2 x 108 2.0 x 105
270 5.0 x 108 4.9 x 108 8.0 x 104
300 5.1 x 108 5.0 x 108 4.0 x 104
330 5.2 x 108 5.1 x 108 2.1 x 104
360 5.2 x 108 5.2 x 108 1.0 x 104
390 5.2 x 108 5.2 x 108 5.0 x 103
Osmolaridad del medio ISOSMOTICO HIPOSMOTICO HIPOSMTICO

b. Se ensay tambin el efecto de distintas concentraciones del antibitico sobre el

crecimiento de una cepa sensible en condiciones hiposmticas, para lo cual se adicion el
mismo a distintas alcuotas de un cultivo de DO=0,6 y se midi la DO final alcanzada luego
de 1 hora de adicionado el antibitico.

CONCENTRACIN (g/ml) DO final alcanzada

10 1.2
50 0.9
100 0.2
200 0.2

c. Para analizar cul era el metabolismo afectado se ensay el antibitico en cuestin y otros
de actividad conocida sobre una cepa sensible en presencia de precursores marcados
radiactivamente, y se midi su incorporacin a distintas biomolculas. Los valores
informados (en cuentas por minuto totales) fueron:

- 16 -
 [14C] UDP
ANTIBIOTICO [35S] metionina [3H] timidina [3H] uracilo
NAcGluc
ATB 14900 14000 14900 17000
Cloranfenicol 3100 16300 16100 111000
Actinomicina 14000 2500 15500 120000
Rifampicina 13900 16000 170 115000
Vancomicina 14800 16500 16000 20000
Sin antibitico 15000 17000 16500 120000

d. Con el fin de localizar el sitio de accin del antibitico se realiz un experimento en el cual
se utilizaron precursores radioactivos de la sntesis de murena, midindose la
incorporacin de los mismos a la pared celular en un medio isosmtico, luego de 2 horas
de cultivo, en presencia de 200 g/ml del antibitico.

PRECURSOR S sin antibitico S con antibitico R con antibitico

N-AcGlucosamina 20000 1500 18000
D-Alanina 23000 1300 17900
UDP NAc Mur pentapptido 19000 1600 19000

e. Para estudiar el mecanismo de resistencia de la cepa R se realiz el siguiente experimento:

Se cultiv la cepa R en presencia del antibitico hasta una DO de 0,5, se separaron las clulas
por centrifugacin, y se adicion el sobrenadante a un cultivo de la cepa sensible S, partiendo
de una DO inicial de 0,15.
Los resultados se informan como DO final alcanzada luego de 3 horas de cultivo.

MEDIO FRESCO / SOBRENADANTE DO FINAL ALCANZADA

Sin agregado del medio de cultivo de R 0.80
40 0.81
20 0.72
10 0.74
4 0.71

i. Grafique ln(Nv) versus tiempo para las cepas en estudio.

ii. Esquematice los resultados esperados en el caso de medir DO en lugar de Nv.
iii. Calcule la mx. para la cepa control sin antibitico en medio isosmtico.

- 17 -
iv. Indique el posible sitio de accin del antibitico y mecanismo(s) de resistencia para la cepa R.

4. Para analizar el efecto de diferentes concentraciones de un antibitico sobre el crecimiento de una

cepa de Streptococcus se determin tanto la DO del cultivo, como el recuento de clulas viables a
diferentes tiempos. Los datos indicados en la columna 1 (cultivo 1) fueron obtenidos en ausencia del
antibitico. Los cultivos 2 y 3 muestran crecimiento de cultivos a los cuales se les adicion a los 150
minutos el antibitico en estudio a una concentracin final de 1 y 100 g/ml respectivamente.
Cultivo 1: ausencia de antibitico
Cultivo 2: a los 150 minutos se agreg el antibitico a una concentracin final de 1 g/ml y se
continu midiendo la DO del cultivo.
Cultivo 3: se realiz el mismo procedimiento que para el cultivo 2 excepto que el antibitico se
agreg a una concentracin final de 100 g/ml.

Tabla 1. Medida de DO

Tiempo Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3

(min) D.O. ln D.O D.O. ln D.O D.O. ln D.O
0 148 5 148 5 148 5
60 149 5 149 5 149 5
90 181 5.2 181 5.2 181 5.2
120 330 5.8 330 5.8 330 5.8
150 600 6.4 600 6.4 600 6.4
180 1097 7 600 6.4 600 6.4
210 2000 7.6 600 6.4 600 6.4
240 3640 8.2 600 6.4 600 6.4
300 5400 8.6 600 6.4 600 6.4
360 5430 8.6 600 6.4 600 6.4

Tabla 2. Recuento de clulas viables x 108 (Nv).

Cultivo 2 Cultivo 3
Tiempo (min)
Nv ln Nv Nv ln Nv
0 2.7 19.4 2.7
60 2.7 19.4 2.7
90 3.3 19.6 3.3
120 6.0 20.2 6.0
150 11 20.8 6.0
180 11 20.8 5.8
210 11 20.8 3.2
240 11 20.8 2.5
300 11 20.8 2.0
360 11 20.8 1.8
- 18 -
a. Calcule mx y g e indique durante que lapso el cultivo se encontraba en la fase exponencial.
b. Fundamente cual es el efecto del antibitico para cada concentracin (bacteriosttico, bactericida
o bacterioltico).
c. Calcule, si corresponde, la velocidad especfica de muerte, sabiendo que la muerte celular sigue
una cintica exponencial similar a la de crecimiento celular.

5. Con el fin de analizar el efecto de los antibiticos X e Y sobre el crecimiento de E. coli se

determin el nmero de clulas viables por mililitro (Nv/ml) a diferentes tiempos, en ausencia (Tabla
1) y en presencia de dichos antibiticos (Tabla 2: antibitico X; Tabla 3: antibitico Y). Se indican las
diluciones realizadas a cada tiempo para el contaje de clulas viables, el volumen sembrado para
cada dilucin y el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) contadas en cada dilucin.

Tabla 1. Valores obtenidos en ausencia de antibiticos.

Tiempo (hs) Dilucin Vol. de siembra (ml) UFC
-2
10 0.1 30
0
10-3 0.1 1
-2
10 0.2 61
1 -3
10 0.2 3
10-2 0.1 60
2 -3
10 0.1 8
-3
10 0.1 410
4
10-4 0.1 38
-6
10 0.2 49
6 -7
10 0.2 4
10-5 0.1 922
7 -6
10 0.1 145
-6
10 0.1 290
8
10-7 0.1 25
-7
10 0.2 58
9
10-8 0.2 1
Tabla 2. El antibitico X fue agregado a T = 4 hs.

Tiempo (hs) Dilucin Vol. de siembra (ml) UFC

10-4 0.1 54
5
10-5 0.1 5
10-3 0.1 630
7
10-4 0.1 55
10-3 0.2 1200
9
10-4 0.2 108

- 19 -
Tabla 3. El antibitico Y fue agregado a T=4 hs.

Tiempo (hs) Dilucin Vol. de siembra (ml) UFC

10-4 0.2 108
5
10-5 0.2 9
10-3 0.1 120
7
10-4 0.1 24
10-3 0.2 54
9
10-4 0.2 2

a. Calcule UFC/ml del cultivo para cada tiempo, en ausencia y presencia de los antibiticos X e Y.
b. Grafique ln Nv/ml vs tiempo en ausencia y presencia de los antibiticos.
c. Calcule mx y g.
d. Puede, en base a los datos de Nv, indicar el efecto de los antibiticos X e y sobre E. coli?
(bacteriosttico, bactericida o bacterioltico). En caso negativo, indique qu otros datos necesitara
para determinarlo.

6. Se quiere determinar el sitio de accin de un antibitico, para lo cual se utiliza la bacteria Gram (+)
Bacillus subtilis. Alcuotas de esta bacteria son incubadas con el agregado de precursores radioactivos
en presencia o en ausencia del antibitico. Luego se van tomando muestras a distintos tiempos y se
determina la incorporacin de radioactividad en cada caso, obtenindose los siguientes grficos:
a) Incubacin realizada en presencia de UDP (14C) Glc-Nac

% de radioactividad
en la pared celular

1 2 3
Tiempo (Hs.)
Sin antibitico
Con antibitico

- 20 -
 b) Incubacin realizada en presencia de (14C) D-alanina.

% de radioactividad
en la pared celular

1 2 3 4
Tiempo (Hs.)
Sin antibitico
Con antibitico

c) Incubacin realizada en presencia de (14C) D-alanina.

% de radioactividad
en la fraccin de
membrana

1 2 3 4
Tiempo (Hs.)
Sin antibitico
Con antibitico

Indique los posibles sitios de accin de este antibitico. Grafique DO en funcin del tiempo
para un cultivo al que se le agrega este antibitico. Justifique sus respuestas.

7. Se estudi el mecanismo y lugar de accin de un antibitico activo contra bacterias Gram (+), para
ello se realizaron los siguientes ensayos:

Ensayos de biosntesis de macromolculas: se cultiv la bacteria Staphylococcus aureus en presencia

de distintos precursores de macromolculas marcadas radioactivamente, en presencia de distintos
antibiticos conocidos y del nuevo antibitico X. Luego se prepararon los extractos celulares segn la
macromolcula que se quera estudiar y se determin la cantidad de radioactividad de cada una
segn la siguiente tabla:
- 21 -
 % de inhibicin sobre la biosntesis
Protena DNA RNA Murena
X 2 1 1 92
Cloranfenicol 85 0 2 2
Actinomicina 1 91 15 0
Rifampicina 0 1 92 1
Vancomicina 1 0 0 84

Incorporacin de radiactividad proveniente de precursores unidos a UDP en presencia de distintos

antibiticos. Posteriormente se separa el pptidoglicano cido insoluble y se determina su
radiactividad para cada condicin de cultivo segn se ve en la siguiente tabla:

Radiactividad
Precursor radioactivo Antibitico (/ml) (incorporada en % Inhibicin
murena)
Sin agregado 20000 -
X 200 99
UDP-GlcNac
D-cicloserina 250 98.5
Ristocetina 400 98
Sin agregado 5000 -
X 4500 5
UDP-MurNac-pentapptido
D-cicloserina 4250 7.5
Ristocetina 500 90

En base a los datos suministrados:

a. Interpretar cada uno de los resultados presentados.
b. Indicar los posibles lugares de accin del antibitico.

- 22 -
8. Las tetraciclinas representan una familia de antibiticos introducidos a fines de la dcada del 40, a
partir de su aislamiento de diferentes cepas de Streptomyces.
Cuando una de estas cepas es cultivada en un medio de cultivo adecuado se obtienen los resultados
observados en la siguiente tabla:

TIEMPO (hs) PESO SECO (g/l) ln PESO SECO

1 4.5 1.50
3 5.0 1.61
6 6.3 1.84
10 12.5 2.53
14 25.0 3.22
18 40 3.70

Por encima de las 20 hs. no se observa aumento apreciable del peso seco.
Paralelamente se determina la concentracin de tetraciclina (Tc) producida por esta especie
bacteriana en el sobrenadante del medio de cultivo. (Figura 1)

Figura 1.

Cc de Tc
producida

5 10 15 20 25 30 Tiempo (hs)

a. Calcular la velocidad de crecimiento especfica mxima y el tiempo de generacin.

b. Se podran utilizar los datos numricos de produccin de Tc (en caso de contar con ellos) para
calcular la velocidad pedida? Justificar.

9. Se realizaron investigaciones acerca del mecanismo de resistencia a Tetraciclina, desarrollado por

una cepa mutante de Staphyloccus faecalis. Se emplearon para este fin tres cepas de este

- 23 -
microorganismo: una sensible al antibitico (A), una cepa resistente ya conocida (B), y la mutante en
estudio (C). Para detectar el origen de la resistencia adquirida por esta cepa, se realizaron los
siguientes ensayos:
a) Efecto de la tetraciclina sobre el crecimiento de las cepas (A), (B) y (C). (Figura 1). La flecha indica
el momento de agregado del antibitico (100 g/ml).

Figura 1.

Log DO (590 nm)

S. faecalis (A)
S. faecalis (B)
S. faecalis (C)

2 4 6 8
Tiempo (Hs.)
b) Actividad biolgica de la Tetraciclina recuperada del sobrenadante (esterilizado por filtracin)
donde se desarrollaron las cepas (B) y (C) (Fig. 2).
El sobrenadante de un cultivo de S. faecalis (B) y (C), al que se cultiv ON en presencia de Tetraciclina
(100 g/ml), fue recuperado y utilizado para ensayar su capacidad inhibitoria remanente a distintas
concentraciones, sobre una suspensin de bacterias (A). El crecimiento fue observado y medido a las
15 hs de la adicin del sobrenadante. El control se realiz incorporando en un tubo cantidades
variables de Tetraciclina fresca.

Figura 2.

Log DO (590 nm)

2 4 6 8 Tetraciclina (g/ml)
1 1 1 1 Diluciones del
/16 /8 /4 /2 1
sobrenadante

Cepa (A) + distintas diluciones del sobrenadante de (B)

Cepa (A) + distintas diluciones del sobrenadante de (C)
Cepa (A) + cantidades variables de Tetraciclina

- 24 -
 b) Efecto de la Tetraciclina en la sntesis in vitro de protena, medida como porcentaje de
Actividad (incorporacin de 14C aminocidos)
Los extractos de las cepas (A), (B) y (C) fueron preparados y se enfrentaron con distintas
concentraciones de Tetraciclina (Figura 3).

100

% actividad
sntesis proteica

S. faecalis (A)

50 S. faecalis (B)
S. faecalis (C)

5 10 15 20 25 Tetraciclina (g/ml)
Figura 3.

Establezca qu tipos de mecanismos podran ser responsables de que las cepas B y C no sean
afectadas por la Tetraciclina. Justifique.

10. Indique cmo se comportar un cultivo de la bacteria Gram (-) E. coli K12, ante el agregado de
los siguientes antibiticos, por separado, en los momentos indicados por las flechas, ya sea en
un medio hipotnico (caldo peptonado) o isotnico (caldo peptonado + sacarosa).
1- Penicilina
2- Estreptomicina
3- Polimixina
4- cido Nalidxico
D.O. D.O.

1, 3, 4

3,1,4 3, 4

1, 2, 3 1, 2, 3
3, 2

Tiempo Tiempo
MEDIO ISOTNICO MEDIO HIPOTNICO
- 25 -
11. Hasta el presente se han descripto distintos mecanismos de resistencia bacteriana a tetraciclinas.
Para estudiar uno de estos mecanismos de resistencia mediado por la protena Tet (0) en una cepa
de E. coli denominada JM107 productora de esta protena, se realizaron los siguientes ensayos:

a. Captacin de 3H-tetraciclina: se cultivaron las cepas JM107 y HB101 (cepa de E. coli resistente a
tetraciclina mediante un proceso de expulsin activo de la droga) hasta la fase exponencial de
crecimiento, se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo fresco con el agregado de 3H-
tetraciclina. A distintos tiempos se tomaron alcuotas y se determin la radioactividad presente
en las bacterias.

Captacin
de (3H)-Tc JM107
8

4
HB101
2

15 30 45 60 75 90
Tiempo (min)

b. Efecto de Tet(0) sobre la actividad de la tetraciclina: se utiliz un sistema de traduccin in vitro

a partir de ARNm sinttico (poliU) cuya traduccin da polifenilalanina. Dicho sistema de
traduccin utiliza fracciones ribosomales provenientes de E. coli HB101 o JM107 TcR en
14
presencia de C-fenilalanina y distintas concentraciones de tetraciclina en un medio por lo
dems completo. A los 60 minutos se precipita la polifenilalanina con cido tricloroactico al
10% y se mide la radioactividad incorporada en el precipitado. En la figura 2 se grafica el
porcentaje de inhibicin alcanzado.

% de 100 HB101
Inhibicin
80

60

40
JM107
20

25 50 75 100 125 150

[Tc] M

- 26 -
c. Por ltimo se midi la unin de 3H-tetraciclina a una fraccin de ribosomas provenientes de la
cepa HB101 o de la cepa JM107. Para ello se incub una alcuota conteniendo ribosomas en un
buffer adecuado en presencia de distintas concentraciones de 3H-tetraciclina durante 15
minutos a 37C. Posteriormente se colectaron los ribosomas, se lavaron, y se determin la
radioactividad unida en cada caso. Se obtuvieron los siguientes resultados:

(3H)-Tc HB101
unida 2.0

1.5

1.0
JM107
0.5

20 40 60 80 100 125 150 [Tc] M

En base a los datos mostrados, indique el posible mecanismo de resistencia de la cepa JM107.
Justifique su respuesta analizando en cada caso los datos mostrados.

- 27 -
12. En el curso de la bsqueda de nuevos antibiticos producidos por microorganismos se detect
que una cepa de Bacillus subtilis produce un novedoso antibitico macrocclico llamado Dificidina. A
los efectos de caracterizar este compuesto se realizaron los siguientes experimentos:

a. Una cepa de E. coli fue cultivada en medio sinttico hasta D.O. 0,1. En ese momento se
fraccion el cultivo en 4 partes, y a los 60 minutos a cada fraccin se le adicion un
compuesto diferente (Fig. 1).

b. Clulas de E. coli fueron cultivadas en medio M9 hasta fase logartmica y en ese

momento se adicion Dificidina. Se tomaron alcuotas del cultivo desde el agregado del
antibitico, con el objeto de detectar la viabilidad celular (Fig. 2).

FIGURA 1 FIGURA 2

Abs (590nm) ln N Clulas

Agregado
de droga
0,8 20

0,6 15
Agregado
de droga
0,4 10

0,2 5

50 100 150 200 50 100 150 200

Tiempo (min) Tiempo (min)

Control sin droga Control sin droga

Cloranfenicol 100g Dificidina

Dificidina 200g Dificidina

Penicilina

En base a estos dos experimentos, qu conclusiones extrae sobre el efecto de Dificidina sobre
el crecimiento de E. coli? Fundamente su respuesta.

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 A continuacin es realizada una serie de experimentos para determinar el proceso metablico
primario inhibido por Dificidina (ejemplo: sntesis de murena, de protenas, de ARN, de ADN). En
todos los casos E. coli se cultiv en medio M9 en presencia de algn precursor radioactivo como se
indica en cada caso, y se determin la radioactividad (cpm) incorporada por las clulas (Figuras 3-6).

Incorporacin de Incorporacin de
[3H] Aminocidos [3H] Uracilo

CPM 1 CPM 1

4 7
2

2y5 6

Tiempo Tiempo

Figura 3 Figura 4

Incorporacin de Incorporacin de
[3H] Timidina [3H] DAP

CPM 1 CPM 1
6 3
5
2 2

3
4

Tiempo Tiempo

Figura 5 Figura 6

1) sin agregado 5) Estreptomicina

2) Dificidina 6) Rifampicina
3) Ac. Nalidxico 7) Cloranfenicol
4) Cicloserina

Qu conclusin extrae de estos ltimos experimentos acerca del o de los posibles blancos de accin
de la Dificidina? Explique su respuesta.

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13. Se quiere caracterizar un nuevo antibiotico llamado BQ14. Para ello se realizan los siguientes
experimentos utilizando una cepa sensible al mismo:
Se cultiva la cepa sensible en medio de cultivo LB hasta DO= 0.3. En este momento el cultivo
se divide en 2: A la mitad se le adiciona BQ14 100 g/mL y a la otra se la deja sin tratamiento
(Control). Se obtienen el siguiente resultado:

En los tiempos T1 y T2 se realiza el recuento de viables en el cultivo al cual se le agreg BQ14,

obtenindose los siguientes resultados:

Volumen
Muestra Dilucin Colonias
sembrado
10-4 0.1 1000
T1 10-5 0.2 230
10-6 0.2 18
10-3 0.2 150
T2 10-4 0.1 6
10-5 0.1 0

Se evala la incorporacin de distintos sustratos marcados radiactivamente por parte de la

cepa sensible, en presencia y ausencia del antibitico BQ14

[35S] metionina [3H] timidina [3H] uracilo [14C] DAP

+ BQ14 14900 1100 15900 110000
Sin antibitico 15000 17000 16500 120000

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 Teniendo en cuenta los resultados anteriores:
a) Sabiendo que el max= 0.5 h-1 para el cultivo sin antibitico: Calcule el tiempo de
generacin.
b) Describa brevemente los pasos a seguir para hacer un recuento de clulas viables.
c) Calcule UFC/mL en los tiempos T1 y T2 para el cultivo tratado con BQ14.
d) Clasifique a BQ14 segn su actividad sobre la cepa estudiada. Justifique
e) Qu procesos metablicos se ven afectados en presencia de BQ14? Justifique

14. Se necesita cuantificar la carga bacteriana de un polvo medicinal coloreado hidrosoluble. Para
ello disuelve 5 g de polvo en 5 ml agua estril, logrando disolucin completa. A partir de la mezcla
inicial realiza una primera dilucin 1/20 y a partir de ella, 4 diluciones seriadas al dcimo (1/10) ms.
Luego inocula, por triplicado, 0,2 ml de cada una de las diluciones al dcimo sobre placas
conteniendo medio de cultivo. Luego de la incubacin, los resultados obtenidos fueron:

Nmero de colonias
Seriada 1 520 480 530
Seriada 2 60 54 62
Seriada 3 3 6 4
Seriada 4 0 1 0

a) De las siguientes opciones seleccione que medio de cultivo utilizara en las placas. Justifique su
eleccin.
i. sintetico, slido y diferencial
ii. complejo, slido y selectivo
iii. complejo y semislido
iv. complejo, slido, selectivo y diferencial
v. complejo y slido
vi. sinttico y slido
vii. sintetico y semislido

b) Calcule el nmero de UFC/ml en la disolucin inicial del polvo Qu esperara observar si siembra
la primera dilucin 1:20. Justifique.

15. Usted dispone de una muestra que contiene dos especies bacterianas (X: colonias pequeas,
circulares, de borde regular, e Y: colonias grandes, de borde aserrado) y desea evaluar la sensibilidad
de ambas frente al antibitico tetraciclina (Tc). Para ello realiza un ensayo de concentracin
inhibitoria mnima (CIM) para cada cepa, con Tc = 200 g/mL como concentracin inicial (tubo 1) y 5

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diluciones al medio del mismo en medio de cultivo adecuado. Luego inocula cada uno de estos tubos
con cultivos puros de cada cepa, incuba a 37C con agitacin por una noche y luego evala el
crecimiento en cada uno. Adicionalmente se incuba tambin un tubo que contiene slo medio de
cultivo (C).

Tubo 1 2 3 4 5 6 Sin Tc C
X - - - - + + + -
Y - - + + + + + -
[Tc]
(g/mL)
(+) Crecimiento (-) No crecimiento
a) Describa brevemente cmo procedera para obtener cultivos puros de cada cepa a partir
de esta muestra. Dado los siguientes medios de cultivo, cul elegira para realizar este ensayo?
Justifique

Medio 1 Medio 2 Medio 3

0.2 % Glucosa 1 % Peptona 1 % Peptona
1 % Peptona 0.5 % Extr. de levadura 0.5 % Extr. de levadura
0.5 % Extr.de levadura 1 % NaCl 1 % NaCl
Violeta Cristal 1.5 % Agar

b) Indique la CIM para las cepas X e Y. Para qu se realizan los tubos Sin Tc y C?
c) Qu cepa es ms resistente a la Tc? Cul podra ser el mecanismo que confiere esta
resistencia?

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