Guia TP QBiol Veterinaria, UNRN 2016

UNIVERSIDAD NACIONAL DE RO NEGRO
SEDE ALTO VALLE Y VALLE MEDIO

ESCUELA DE VETERINARIA Y PRODUCCIN AGROINDUSTRIAL
CHOELE CHOEL
RESPONSABLE DE CTEDRA: Prof. Dra. MARTA S. AGERO

maguero@unrn.edu.ar
EQUIPO DOCENTE:
Prof. Dra. MARA BELN BUGLIONE mbuglione@unrn.edu.ar
AYUDANTE DE PRIMERA:
ING. AGR. FEDERICO MALDONADO maldonado516@hotmail.com
LIC. ALIM. FLORENCIA CAYOLO florenciacayolo@gmail.com
AYUDANTE ALUMNA: SOFA SENA sofiabelensena@hotmail.com
2016
QUMICA BIOLGICA. GUA DE TRABAJOS PRCTICOS 2016
FUNDAMENTACIN
La presente gua de Trabajos Prcticos pretende apoyar el aprendizaje de la Qumica Biolgica a

travs de la visualizacin y realizacin concreta de trabajos en el laboratorio, as como de la aplicacin
prctica de los conocimientos en la resolucin de problemas concretos elaborados a partir de
resultados publicados por diversos grupos de investigacin.
Los distintos trabajos prcticos de laboratorio, las guas de estudio y de resolucin de problemas y
los seminarios-taller han sido seleccionados siguiendo el programa de Qumica Biolgica de la
carrera Medicina Veterinaria, de la UNRN y se ajustan a los siguientes objetivos:
- Desarrollar en el estudiante la capacidad de trabajar en el laboratorio, formndolo en las

habilidades mnimas para el manejo del instrumental y materiales de laboratorio conforme a
normas de bioseguridad.
- Manejo y/o conocimiento de tcnicas e instrumental de probable uso por parte del Profesional
Veterinario y de aplicacin por el estudiante en distintas asignaturas de la Carrera.
- Desarrollar la capacidad de anlisis de problemas experimentales, planteo de hiptesis y

metodologas para su estudio, y anlisis de resultados obtenidos.
- Adquirir el lenguaje y terminologas propias de la asignatura, capacitando al estudiante en la

confeccin de informes de laboratorio que lo preparen para elaborar informes tcnicos y
comunicaciones cientficas (alfabetizacin acadmica).
1 Medicina Veterinaria
ALGUNAS REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD
Las medidas de seguridad en laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a

proteger la salud de los que all se desempean frente a los riesgos propios de su mbito de trabajo,
como hacia el exterior.
Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de prcticas de sentido comn realizadas en forma
rutinaria.
El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la informacin que permita reconocer y
combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada
tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con
que se trabaja.
1- Deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como
matafuegos, salida de emergencia, etc.
2- No comer, beber ni fumar mientras est en el sector de mesadas.
3- No guardar alimentos en el laboratorio, ni en heladeras que contengan drogas.
4- Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la
zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
5- Utilizar guardapolvos de mangas largas.
6- Utilizar guantes descartables o de las caractersticas adecuadas, siempre que se trabaje con
materiales peligrosos.
7- Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin en el laboratorio
y antes de retirarse del mismo.
8- No pipetear con la boca. Utilizar siempre propipetas o pipetas automticas.
9- Todo reactivo deber estar debidamente rotulado indicando el nombre de la sustancia y/o
frmula qumica, concentracin, fecha de preparacin, iniciales de la persona o grupo
responsable de la preparacin. En el caso de material peligroso, indicar en forma claramente
legible sus caractersticas en el envase.
10- No bloquear las salidas con elementos que entorpezcan la circulacin.
11- Las prcticas que pueden ser riesgosas por inhalacin debern realizarse bajo campana de
extraccin de gases.
12- Verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender un mechero. No se trabajar
con materiales inflamables o solventes sobre llama directa o cerca de las mismas.
13- El material de vidrio roto se depositar en recipientes especficos destinados a tal fin,
separados de los residuos comunes.
14- Para descartar soluciones a la pileta, siempre abrir antes la canilla de agua.
15- No descartar lquidos inflamables, txicos, corrosivos o material biolgico en las piletas.
16- Todos los Procedimientos de Trabajo deber estar escritos en un Protocolo, el cual debe ser
seguido meticulosamente para realizar un trabajo bueno y seguro (Buenas Prcticas de
Laboratorio). Dicho procedimiento incluye el registro de todos los pasos realizados y
novedades durante el desarrollo de la prctica.
17- En caso de algn problema AVISAR al docente a cargo.
2 Medicina Veterinaria
Trabajo Prctico N I:
INTRODUCCIN A TCNICAS DE ESPECTROFOTOMETRA
Objetivo general:
Iniciar al alumno en el estudio de los mtodos cuantitativos de absorcin de radiacin
electromagntica para determinar la concentracin de sustancias presentes en muestras de inters
biolgico.
Objetivos especficos:
Aprender los fundamentos, pasos experimentales, posibilidades y limitaciones de la tcnica de
espectrofotometra para la cuantificacin de compuestos en muestras incgnitas.
Aprender el manejo de espectrofotmetros.
Construir curvas de calibracin y comprender su importancia.
Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estndar.
Contenidos:
Espectrofotometra: Fundamentos. Concepto de espectro de absorcin de un compuesto, barrido
espectral. Curva de calibracin de soluciones patrones. Ley de Lambert y Beer. Concepto de muestra
incgnita, estndar, blanco de reactivo, blanco de muestra.
Introduccin Terica:
CONCEPTOS BSICOS DE ESPECTROFOTOMETRA
Propiedades de la luz
La luz es una radiacin que se propaga en forma de ondas electromagnticas.
En fsica, el trmino luz se usa en un sentido amplio e incluye todo el campo de la radiacin
conocido como espectro electromagntico, mientras que la expresin luz visible seala
especficamente la radiacin en el espectro visible.
La radiacin ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm) comprende
una pequea parte del espectro electromagntico, que incluye otras formas de radiacin como las de
radio, infrarrojo (IR), csmica y rayos X.
La radiacin o energa radiante se puede describir por su:

Naturaleza ondulatoria: consiste en un campo magntico y un campo elctrico perpendiculares
entre ellos que oscilan sinusoidalmente a medida que se propagan a travs del espacio.
Si representamos de forma simplificada una onda electromagntica, podemos describir ciertos
parmetros que la caracterizan:
Longitud de onda (): es la distancia entre dos mximos
sucesivos de una onda; se mide en nanmetros (nm) que equivale
a 10-9 m. La longitud de onda da idea del color de la radiacin y
de su contenido energtico.
Frecuencia (): es el nmero de mximos de una onda que pasa
en un punto del espacio en un segundo, se mide en Hertz que
corresponde a un ciclo por segundo (1/s). Su valor se relaciona
con la velocidad de la luz (c= 2.998108 m/s) y , del siguiente modo: = c/ .
3 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Naturaleza corpuscular: Compuesta de pequeos paquetes de energa (E) denominados cuantos

de luz o fotones. La energa de los fotones depende de la frecuencia de la radiacin y est dada por
la siguiente relacin: E (fotn) = h (fotn)= h c/
donde h: constante de Planck, : frecuencia de la luz, c: velocidad de la luz, : longitud de onda
La absorcin de la radiacin
El fundamento de la espectrofotometra se debe a la capacidad de las molculas para absorber
radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las
radiaciones que una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la
estructura atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, etc.), por lo que
esta tcnica permite la cuantificacin y caracterizacin de biomolculas.
Todas las sustancias absorben luz (energa) en alguna regin del espectro electromagntico:
visible, ultravioleta, infrarrojo, etc.
Las soluciones de diferentes compuestos absorben energa preferentemente en una ms
regiones del espectro electromagntico, siendo la absorcin inferior o nula en las dems regiones.
La absorcin de luz depende de la estructura qumica del compuesto absorbente, y en especial
de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las
caractersticas de su espectro de absorcin (figura 1)
El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica cantidad de luz absorbida
(Absorbancia) a diferentes valores de .
El espectro de absorcin se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda
para establecer la longitud de onda de mxima absorcin (max).
En el siguiente ejemplo, la max para el NAD+ es 259 nm y el NADH presenta dos picos de
absorbancia: max. 259 nm, que se superpone al espectro de absorcin del NAD+ y un segundo pico
de absorcin a max = 340 nm, exclusivo del NADH
Figura 1: Espectro de absorcin del NAD+ y del

NADH. Tanto el NAD+ como el NADH absorben
fuertemente en el ultravioleta, debido a la base
nitrogenada adenina. Por ejemplo, el NAD + presenta un
nico pico de absorcin a una longitud de onda de 259
nm. El NADH absorbe adems a longitudes de onda
mayores, con un segundo pico de absorcin a 340 nm,
mientras que la forma oxidada (NAD +) no presenta
absorcin a dicha longitud de onda.
A partir del espectro de absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la
mayor absorbancia (max). Dicha se utilizar para realizar determinaciones cualitativas y
cuantitativas del compuesto.
Aspectos tericos de espectrofotometra cuantitativa
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis cualitativo y
cuantitativo de molculas biolgicas. Parte de la identificacin de una molcula se determina por el
trazado del espectro de absorcin (figura 1) en la regin visible y ultravioleta. Mientras que la
cuantificacin de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna
regin del espectro) o indirecta (por modificacin del compuesto mediante una reaccin qumica).
Cuando la luz monocromtica (de una determinada longitud de onda) de intensidad I0,
atraviesa una disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz en una cubeta transparente, el
compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (I 0) y dejar pasar el resto (I t), de forma que
se cumple: I0 = Ia + It
donde I 0: intensidad de radiacin incidente, I a: intensidad de luz absorbida por el compuesto,
I T: intensidad de la luz transmitida (I T).
Se define transmitancia como la relacin entre las intensidades de la radiacin transmitida y
la incidente. T = I T / I0

La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas capaces de

absorber energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentracin aumenta.
La relacin entre I T e I 0 depender entonces de la longitud del trayecto ptico en el medio (b)
y de la concentracin (c) de la solucin que absorbe la luz.
Esto responde a la ley de Lambert y Beer:
-abc
I T = I0 10 a: coeficiente de extincin molar o absortividad molar
-abc
T = IT /I0 = 10 log T = log IT /I0 - log T = - log I0/ IT = a b c
El valor de transmitancia (T = IT / I0), sigue una relacin exponencial decreciente con la
concentracin y/o espesor de la muestra atravesada (ver figura 3), por lo es conveniente una
representacin de tipo lineal que facilite el trabajo con muestras de concentracin a determinar
(objetivo de la tcnica de espectrofotometra).
Si definimos la relacin de las intensidades log I0 / IT (lo que equivale a log (T)) como la
absorbancia (A) de la solucin, y lo representamos en funcin de la concentracin, obtenemos
entonces una relacin lineal segn:
Pendiente de la recta
A = - log T = log I0 / IT = a b c
Cabe aclarar que la ecuacin de una recta responde a la expresin: y = a x + b;
donde y: variable dependiente, x: variable independiente, a: pendiente = y/x, b: ordenada al origen.
T = (IT/I0) 100
A = log (I0 / IT)
Pendiente:
y/x
concentracin concentracin
Figura 3: Curvas de calibracin. Relacin de la Transmitancia (izquierda) y Absorbancia (derecha) con la
concentracin de una sustancia en solucin.
La absortividad molar (a) es una constante caracterstica del soluto en un disolvente dado
para una longitud de onda determinada, definido a una temperatura, pH y otras condiciones del medio.
Numricamente es igual a la absorbancia de una solucin 1 M de la sustancia en una celda con un
espesor de 1 cm, por lo que sus unidades son: M-1cm-1. (b) Corresponde al espesor de la cubeta que
generalmente es de 1 cm.
Si no se conoce el peso molecular de la sustancia se emplea el coeficiente de absortividad
especfico (E) y sus unidades dependen de las unidades de concentracin utilizadas, que pueden estar
en g/L o g/100 mL.

Si reemplazamos en la frmula de absorbancia y expresamos b en cm y c en concentracin

molar, nos daremos cuenta que A carece de unidades.
Se debe tener en cuenta que la absortividad es una propiedad de la sustancia a una dada,
mientras que la Absorbancia variar con la concentracin y con el espesor de la celda de medicin.
La ley de Lambert-Beer en general se cumple para soluciones diluidas. Para valores de
concentracin elevados, el coeficiente de extincin molar (a) vara con la concentracin, debido a
fenmenos de dispersin de la luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc.
Qu instrumentacin se utiliza?
La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en los espectrofotmetros,
aparatos que suministran luz de variables, y la luz monocromtica obtenida (en realidad un ancho
de banda monocromtica que puede ir de 8 a 20 nm segn la calidad del aparato), atraviesa la muestra
e incide en un dispositivo fotoelctrico que permite la medicin. All la energa luminosa transmitida
por la muestra es convenientemente amplificada y registrada por el aparato.
Aunque pueden variar en diseo, todos los espectrofotmetros constan de (figura 4):
Una fuente que genera una banda ancha de radiacin electromagntica: Puede ser una lmpara
halgena o de wolframio que suministra la luz de la zona visible del espectro (400-700 nm), o de
nen, argn o hidrgeno, para la zona ultravioleta (200-400 nm).
Un dispositivo monocromador, que selecciona una longitud de onda particular de la radiacin de
la fuente. Comnmente, se utilizan prismas y redes hologrficas de difraccin, que junto a una
rendija de entrada y otra de salida configuran el monocromador.
Un rea de muestra: Celda transparente a la radiacin incidente monocromtica que contiene la
muestra en estudio disuelto en un solvente adecuado. Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico
transparente. Para medir en UV se deben
usar las de cuarzo o slice fundido,
porque el vidrio no transmite la radiacin
UV. Suelen ser de 1 cm de espesor.
Un detector de luz y un amplificador
convertidor de las seales luminosas en
seales elctricas.
Un registrador o sistema de lectura de
datos.
Figura 4: Esquema de los componentes de un Monocromador

espectrofotmetro.
(Daz et al. 8. Espectrofometra: Espectros de
absorcin y cuantificacin colorimtrica de
biomolculas. Disponible en:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA
.pdf)
Determinacin de la concentracin de una sustancia por espectrofotometra

A.- Empleando Curva de Calibracin
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de
onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla
para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro
caso se trabajar con los de un solo haz.
En la prctica se utilizan cubetas calibradas, con lo que la longitud del camino que atraviesa la
luz se transforma en una constante; por lo tanto, la Absorbancia es directamente proporcional a la
concentracin de la sustancia coloreada (Curva de calibracin, figura 3 y 5).
Luego de seleccionar la longitud de onda, se mide la absorbancia del blanco de solvente y se le
asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y

transmitida sean iguales (I0 = IT), y por tanto la absorbancia es cero. En ciertos casos, el disolvente
presenta un valor elevado de absorbancia por lo que se debe ajustar el cero de absorbancia con agua
destilada y registrar el valor de absorbancia del blanco de solvente y de la diferencia entre los valores
de absorbancia se obtiene el valor de la absorbancia corregida.
Si la sustancia que se quiere cuantificar es coloreada, se la puede dosar directamente en
solucin. Si no lo es, se debe utilizar alguna propiedad qumica de algn grupo funcional presente en
la molcula que al reaccionar cuantitativamente con un reactivo determinado, produzca una sustancia
coloreada.
Por consideraciones del error fotomtrico, debe procurarse que los puntos situados entre
valores de A de 0,1 y 1,0 (10% y 80% T) sean representados de la forma ms exacta posible al trazar
la grfica. Valores menores pueden estar por debajo de la sensibilidad del equipo y, a valores mayores,
la sensibilidad del equipo puede hacer que las lecturas resulten poco precisas.
Previamente a la lectura, el aparato es llevado a cero de Absorbancia con un tubo que
contiene solvente sin la sustancia problema y se denomina blanco de solvente. Este tubo puede
contener varias sustancias, adems de disolvente, a la misma concentracin en que se encuentra en el
tubo problema, excepto la sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada problema
se encuentra disuelta en agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendr NaCl al
1% e KOH al 2% en agua, sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es descontar
la absorcin de sustancias que no sean especficamente la sustancia problema y as poder medir la
absorbancia propia de la sustancia en estudio (absorbancia corregida).
Para realizar la curva de calibracin se necesitan un blanco y estndares. Existen distintos
tipos de blancos. Ya mencionamos el blanco de solventes. Suele utilizarse un blanco de reactivos, que
contiene todos los reactivos utilizados en el anlisis con la excepcin de la sustancia a medir. En otros
casos puede ser necesario un blanco de muestra, cuando sta presenta per se una cierta absorcin en
el rango de debida a la presencia de otras sustancias distintas a las que se pretende cuantificar. En
este caso, el blanco de muestra contendr la muestra y el solvente empleado hasta completar el mismo
volumen que en el resto de los tubos. El valor de absorbancia de los diferentes blancos debe
descartarse, para lo cual a los valores de absorbancia de las muestras problema y estndares se le resta
la absorbancia de los blancos correspondientes:
Para los estndares de la curva de calibrado:
Abs corregida = Abs estndar (Abs blanco de solvente + Abs blanco de reactivos)
Para las muestras problema:
Abs corregida = Abs muestra (Abs blanco de solvente + Abs blanco de reactivos + Abs blanco de muestra)
Los estndares, testigos o patrn contienen concentraciones conocidas de la misma
sustancia que se quiere cuantificar, disolviendo la droga pura en el mismo solvente que la solucin
problema, por ej. NaCl al 1% e KOH al 2% para el caso que se est analizando.
Segn la ley de Lambert y Beer, representando las absorbancias de los estndares en funcin
de la concentracin se obtiene la curva de calibracin y a partir de sta es posible determinar un
factor que permitir calcular la concentracin de la sustancia en una muestra incgnita a partir de la
pendiente de la recta resultante, o bien determinar la concentracin por interpolacin directa en el
grfico (figura 3).
En la prctica, suele ocurrir que la recta resultante no pase por el origen de coordenadas.
Tambin es difcil obtener un grfico en el que la relacin se mantenga lineal a lo largo de todo el
rango de lecturas (figura 5), apareciendo entonces desviaciones respecto de la ley de Lambert y Beer.
Estas pueden deberse a un gran nmero de razones, entre ellas las limitaciones del sistema ptico (
capaz de seleccionar el aparato). Tambin pueden producirse por altas concentraciones del compuesto
a medir, dada por agotamiento del reactivo o porque se produzcan agregados moleculares por
fenmenos de asociacin que modifican las lecturas esperadas.
Para construir una curva de calibracin, las concentraciones de los patrones deben de abarcar el
rango de concentracin esperado de las muestras de anlisis.

Todos los valores patrn medidos deben estar sobre una lnea recta, pero en la prctica, los valores
siempre presentan cierta dispersin.
Se debe de aplicar un mtodo estadstico para encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de
calibracin.
Figura 5: Curva de calibracin. Representacin de Absorbancia corregida en funcin de la

concentracin o de la masa del soluto presente en los tubos testigo o patrn. En este ejemplo, la Ley de
Lambert y Beer se cumple hasta 0.2 unidades de concentracin o masa.
B.- Empleando Factor de Calibracin
Una vez que se ha verificado que se cumple la Ley de Lambert y Beer, es decir, existe una
relacin lineal entre Absorbancia y concentracin, y el valor de concentracin de la muestra problema
est en el rango de la curva de calibracin, se puede calcular la concentracin de la muestra problema
empleando el factor de calibracin.
Dada una disolucin de concentracin desconocida a la que llamaremos problema y otra
disolucin de concentracin conocida a la que llamaremos testigo, aplicando la ley de Lambert y
Beer a cada disolucin se obtienen las siguientes expresiones:
Ap = a b cp At = = a b ct
Dado que el problema y el testigo son disoluciones de una misma sustancia cuyos valores
de absorbancia se determinan a la misma , los valores de absortividad (a) sern iguales. Adems,
dado que se utiliza la misma cubeta para medir la A, los valores de b tambin sern iguales.
En consecuencia, dividiendo miembro a miembro y simplificando:
Ap a b cp Ap ct Ap = Ap f
= cp =
At a b ct At
donde: Ap = absorbancia del problema, At = absorbancia del testigo, cp = concentracin del problema,
ct = concentracin del testigo, f = ct / At
Unidades:
Absorbancia (A): Adimensional (sin unidades)
Longitud (l): cm
Concentracin (c): molar (M), milimolar (mM), % m/v (g/100 mL), .
Coeficiente de extincin (a): molar () M-1 cm-1, o L moles-1 cm-1 o mL milimoles-1 cm-1
milimolar () mM -1 cm-1 o L mmoles-1 cm-1 o mL moles-1 cm-1
Especfico (E1%) dL g-1 cm -1 o (g/100 mL) 1 cm-1

Bibliografa Complementaria:
Daz, Nieves Abril, et al. 8. Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica
de biomolculas. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular. Facultad de Medicina.
Crdoba, Espaa. Disponible en:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
Conocimientos mnimos necesarios para realizar los trabajos prcticos
Diferenciar y manejar correctamente conceptos y unidades de concentracin y masa
Conversin de unidades (M, mM, mM, % v/v, etc.)
Representaciones grficas (ejes con potencias y/o decimales)
Para practicar los clculos:
Ejercicios de autoevaluacin sobre procedimientos bsicos de clculo en el laboratorio:
http://biomodel.uah.es/lab/inicio.htm#calculos
Diluciones http://biomodel.uah.es/lab/calculos/dilucion/inicio.htm
Conversin de unidades http://biomodel.uah.es/lab/calculos/conversion/inicio.htm
Absorbancia y concentracin http://biomodel.uah.es/lab/calculos/abs/inicio.htm
PARTE EXPERIMENTAL:
Objetivos Especficos:
Preparar diluciones de una solucin coloreada de KMnO4 de concentracin conocida y construir una
serie colorimtrica;
Construir una curva de calibracin espectrofotomtrica con soluciones de KMnO4 de concentracin
conocida.
Aplicar el anlisis cuantitativo colorimtrico en la determinacin de la concentracin de una
solucin incgnita.
Desarrollo Experimental:
I. Preparacin de diluciones a partir de una solucin de KMnO4 0.2 mM
1- A partir de la solucin 0.2 mM KMnO4, preparar las siguientes diluciones en tubos de ensayo.
2- Mezclar con agitador vortex
3- Completar la tabla calculando las concentraciones en diferentes unidades segn se indica.
KMnO4 Agua destilada Concentracin

Tubo
0.2 mM (mL) (mL) mM g/L mg/L (ppm)
1* 0 10
2 4 6
3 6 4
4 8 2
5 10 0

* Blanco de solvente, que en este caso tambin podra considerarse blanco de reactivos (el reactivo
en que se prepara la solucin de KMnO4 es el agua) ya que la solucin de permanganato es coloreada.
II. Anlisis instrumental de la relacin entre color y concentracin
Una forma de realizar el anlisis anterior de un modo ms exacto se basa en la medicin de la
intensidad de color de las soluciones con un espectrofotmetro.
Tcnica operatoria:
Calibracin del espectrofotmetro:
Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar al menos 15 minutos hasta que se
estabilicen las lecturas de absorbancia / transmitancia.
Elegir la longitud de onda deseada con el selector, = 525 nm para las soluciones de KMnO4.
Verificar 0% de Transmitancia. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro
en reemplazo de la cubeta.
Ajustar el 0 (cero) de Absorbancia utilizando agua destilada, trabajando con la tapa cerrada.
Determinacin instrumental de la relacin entre concentracin y absorbancia:

Reemplazar el blanco de reactivos por las muestras a analizar (en orden creciente de
concentracin) y leer el valor correspondiente de absorbancia.

Informe Trabajo Prctico I:

INTRODUCCIN A TCNICAS DE ESPECTROFOTOMETRA
Fecha: Integrantes:
Anlisis instrumental de la relacin entre color y concentracin

1. Construir una tabla en la que se visualice la concentracin de las soluciones expresada en mM y la
Absorbancia leda en el espectrofotmetro.
Absorbancia
Solucin Concentracin
= 525 nm
mM (mmoles/L) g/L ppm (mg/L)
1 0.000
2 0.258
3 0.350
4 0.442
5 0.543
Incgnita A 0.283
Incgnita B 0.723
Incgnita B
0.272
diluda 1:3 1
2. Construir un grfico de Absorbancia en funcin de concentracin en papel milimetrado. Esto es lo
que se denomina curva de
calibracin. Indicar nombres y
unidades de medida de las
variables en los ejes X e Y
1
Una "dilucin 1:3" indica que se mezcla un volumen de la disolucin inicial con tres volmenes de solvente.
Sera lo mismo que decir una dilucin 1/4 (una parte diluda en 4 partes final), o un factor de dilucin 4.

3. Determinacin de los parmetros de la recta de calibracin:

Ordenada al origen: Pendiente:
4. A partir de los valores de Absorbancia de las muestras incgnita representarlos en la curva de
calibracin, interpolar grficamente y calcular el valor de su concentracin.
A: B:
5. Obtener la concentracin de las soluciones incgnitas utilizando los parmetros de la recta de
calibracin. Comparar con los valores obtenidos en 5.
A: B:
6. Informar la concentracin de las muestras incgnitas A y B, en mM (mmoles/L), g/L y ppm (mg/L)
Muestra Concentracin
mM (mmoles/L) g/L ppm (mg/L)
A
B
Comentarios:
Conclusiones:
GUA DE AUTOEVALUACIN: ESPECTROFOTOMETRA

Entregar junto con el informe del TP
Objetivos:
Manejar conceptos de las tcnicas de fotocolorimetra y espectrofotometra para la determinacin
experimental de la concentracin de compuestos en una solucin.
Lograr la realizacin de los clculos necesarios para la correcta determinacin de una concentracin
incgnita en una muestra.
Preguntas para autoevaluacin:
1. En qu se basa la cuantificacin de un compuesto qumico mediante espectrofotometra?
2. Qu es la luz monocromtica?
3. Defina Transmitancia y Absorbancia, y establezca la relacin entre ambas magnitudes.
4. Cmo se elige la longitud de onda para la cuantificacin por espectrofotometra de un compuesto?
5. Qu establece la ley de Lambert y Beer?
6. Analice de qu puede depender el coeficiente de absortividad molar o de extincin.
7. Calibracin del equipo: qu es un blanco y qu es una solucin estndar o patrn de calibracin?
8. Analice los diferentes tipos de blanco, en qu consisten y cmo se preparan: blanco de solvente,
blanco de reactivos, blanco de muestra.
9. Cmo se realiza una curva de calibracin?
10. Cmo se utiliza una curva de calibracin para determinar concentraciones en muestras incgnitas?
11. Cmo puede procederse cuando una curva de calibracin no responde estrictamente a la ley de
Lambert y Beer?
12. Qu hara Ud. en el laboratorio si la absorbancia de una muestra arroja un valor superior al
mximo obtenido para la curva de calibracin o inferior al mnimo de la curva de calibracin?

Objetivos de los Anlisis Bioqumicos en Clnica Mdica Veterinaria

Los Anlisis Bioqumicos en sangre orina u otro liquido corporal nos informan sobre los cambios o
no de parmetros o valores normales para las diferentes especies. De esta forma se estudian las
concentraciones de varias sustancias qumicas disueltas en estos lquidos biolgicos y le permiten
mdico veterinario evaluar el estado de salud de un animal.
De los lquidos corporales el que mayor informacin nos brinda es la sangre. Es una suspensin que
tiene una fase slida de elementos formes, que incluye a los leucocitos (o glbulos blancos), los
eritrocitos (o glbulos rojos) y las plaquetas y una fase lquida, representada por el plasma sanguneo
(PS).
La mayora de las determinaciones se realizan en el suero sanguneo, componente de la sangre que
aparece luego de permitir la coagulacin y eliminar el cogulo. De esta manera no estarn presentes
las protenas involucradas en la coagulacin (fibringeno en su mayor parte).
El plasma sanguneo, componente lquido de la sangre con las protenas de la coagulacin adems de
transportar las clulas de la sangre, lleva los alimentos y las sustancias de desecho recogidas de las
clulas. El plasma es una mezcla de muchas protenas, aminocidos, glcidos, lpidos, sales,
hormonas, enzimas, anticuerpos, urea, gases en disolucin y sustancias inorgnicas como sodio,
potasio, calcio, cloruro, carbonato y bicarbonato, muchos de estos analitos son usados para
evaluaciones clnicas.
Para realizar un anlisis bioqumico, el veterinario deber recurrir a la anatoma y ubicar las diferentes
venas donde realizar la puncin. Para poder hacer la extrapolacin de los resultados debemos recordar
algunos conceptos aprendidos en biologa, histologa y fisiologa.
El plasma nos informa la concentracin de algunas sustancias en la sangre pero debemos recordar que
en ella hay un 99% de agua. En general en el organismo hay aproximadamente un 70% agua que se
distribuyen en dos compartimentos, el celular y el extracelular. El 30 % restante es materia orgnica,
macromolculas como las protenas (15%), cidos nucleicos (7%) polisacridos (3%), lpidos (2%),
molculas simples e iones inorgnicos (1%) que se organizan de forma particular para establecer tanto
la estructura celular y como la extracelular.
13 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

Por otro lado debemos ir reconociendo las diferencias entre especies, razas y tamaos de los animales
que estamos analizando. Sobre todo recordar que si bien el propsito es asegurar su salud no siempre
la consulta es para un individuo, nosotros los veterinarios tambin trabajamos con poblaciones.
Tambin los distintos tejidos tienen una distribucin particular del agua. As el plasma sanguneo, la
saliva y los jugos gstricos presentan un 99%, el tejido nervioso un 84%, el hgado un 73%, la piel un
71%, tejido conectivo un 60% y un 30% para el tejido adiposo.
Aproximadamente, el 60-70 % de la masa corporal de un animal est constituida por agua, la mayor
parte de este lquido (35-45%) se encuentra en el interior de las clulas, es el llamado lquido
intracelular (LIC), el resto (20-25 %) se encuentra fuera de las clulas y se denomina lquido
extracelular (LEC). Claude Bernard dio al LEC el nombre de Medio Interno (MI). El MI est
compuesto por lquido intersticial, linfa, sangre (plasma sanguneo) y un grupo de fluidos
denominados genricamente como lquido transcelular, donde consideramos, el lquido
cefalorraqudeo (LCR), el lquido sinovial, los humores vtreo y acuoso, los fluidos del odo interno
(endo y perilinfa) y los fluidos serosos de cavidades internas (lquidos pericrdico, pleural, folicular,
etc.)
En este medio se producen los intercambios de molculas para cumplir funciones vitales, secretar,
mantener la volemia y la presin arterial, excretar, termorregular, transportar. En el interior de las
clulas este lquido es el solvente para las reacciones qumicas, diluir y concentrar nutrientes y
electrolitos.
La sangre tiene un peso especfico (o densidad) de 1,055 g/ml, que vara segn especies (1.042 en la
cabra y 1.053 en el caballo), es una especializacin del medio interno y tambin el volumen vara
segn la especie.
Si se toma una muestra de sangre con anticoagulante y se centrifuga, se puede observar, como en el
fondo del tubo de ensayo queda una masa eritrocitaria aglomerada (glbulos rojos; GR), encima de la
cual se sita una fina capa de color blanquecino, constituida por glbulos blancos y plaquetas (capa
leucocitaria); mientras que el plasma sanguneo queda en el sobrenadante.
El plasma sanguneo es salado y de color amarillento, en el caballo es ms fuerte porque contiene ms
bilirrubina que el cerdo, perro y gato que se ubican en el otro extremo. El valor hematocrito, que se

determina centrifugando una muestra de sangre anticoagulada en capilares de vidrio (VH) o sea el
porcentaje de GR por volumen total de sangre. Los resultados de VH oscilan de un 25% y 55% segn
las especies. A travs de l se puede conocer la volemia y el volumen plasmtico. Tambin es un
osmmetro que nos informa sobre la concentracin de partculas osmticamente activas como el in
sodio (Na+).
Especie Gato Perro Bovino Ovino Equino Cerdo
Hematocrito % 25 - 45 37-55 24-46 27-45 32-48 36-43
Si bien las clulas producen cidos y bases para el correcto funcionamiento de la clula se requiere un
pH constante de 7,4. Determinadas sales actan como soluciones tampn. Un tampn es una mezcla
de un cido dbil y la sal correspondiente que es capaz de equilibrar el pH. La presencia de CO3H- y
PO4H2- son sistemas buffer del pH sanguneo.
El tejido animal que posee ms sales es el tejido seo (20%). Las sales disueltas mantienen la
concentracin inica del organismo. La diferencia de concentracin genera potenciales elctricos que
sirven de seales sobre el medio externo. Pueden intervenir en procesos biolgicos, el Ca 2+ por
ejemplo, es necesario para la contraccin muscular, la coagulacin de la sangre, liberacin de
neurotransmisores, transmisin del impulso nervioso.
Las sales minerales regulan la presin osmtica, que se ejerce cuando hay dos soluciones con
concentracin diferente separadas por una membrana semipermeable, que deja pasar el disolvente
(agua) pero no el soluto (iones). Esto nos lleva a recordar conceptos como las diferencias entre las
disoluciones inicas y moleculares.
La materia seca del plasma sanguneo (8%) est representada en 90% son protenas plasmticas, un
0,9% materia inorgnica y el resto materia orgnica no proteica.2
2
La determinacin de los componentes orgnicos del plasma sanguneo y su importancia se desarrolla
en el Anexo I de este texto ya que servir al estudiante para la interpretacin clnica de los trabajos
prcticos de laboratorio.

ANEXO I
Determinaciones bioqumicas en plasma y suero sanguneo
HEMATOCRITO: Volumen de eritrocitos en 100 ml de sangre, expresado en porcentaje.
BIOQUMICA COMPLETA: Na+, K+, Cl-, Calcio, Fsforo, Glucosa, Protenas totales, Alanina
Aminotransferasa o Glutmico Pirvico Transaminasa (ALT o GPT), Fosfatasa Alcalina (ALP),
gama-glutamiltransferasa (GGT), Bilirrubina total, Colesterol, CK (creatn quinasa), Proteinograma,
Urea y Creatinina.
PERFIL GERITRICO: Calcio, Fsforo, Potasio, Glucosa, Protenas totales, ALT, ALP
(perro)/GGT (gato), Colesterol, Urea y Creatinina.
PERFIL RENAL: Potasio, Calcio, Fsforo, Protenas totales, Proteinograma, Colesterol, Urea y
Creatinina.
PERFIL HEPTICO: Glucosa, Potasio, Protenas totales, ALT, ALP (perro)/GGT (gato),
Bilirrubina, Urea, Colesterol.
PERFIL PREOPERATORIO: Glucosa, Albmina, Protenas totales, Colesterol, ALT y Urea.
PERFIL DERMATOLGICO: Protenas totales, Proteinograma, ALT, ALP, GGT, Colesterol,
Urea, Creatinina y Glucosa.
IONOGRAMA: Na+, K+ y Cl-.
Protenas plasmticas
La tasa de protenas plasmticas totales en los mamferos adultos es de 6-8% y en las aves de 4-5%. Al
aumento de los valores normales se le denomina hiperproteinemia y al descenso, hipoproteinemia.
Hay dos grupos principales de protenas, las albminas (Alb) y las globulinas (Glb). El fibringeno
(1-globulina), por su importancia y elevada concentracin se lo suele considerar aparte. En algunos
animales domsticos (pequeos rumiantes y perro) y tambin en el hombre, el contenido de Alb es
superior al de Glb, mientras que en quidos, cerdo y vaca el llamado cociente Alb/Glb se iguala.
Entre las funciones que cumplen, las ms importantes es el mantenimiento y conservacin de la
presin onctica, a cargo de la fraccin Alb, retiene agua en vasos sanguneos y atrae el lquido
contenido en los espacios intersticiales.
Se entiende por presin onctica o coloidosmtica a la presin osmtica que ejercen las protenas de
una solucin, debido a la atraccin que ejercen stas sobre el medio lquido que las rodea. La Presin
onctica o coloidosmtica del plasma tiende a producir la osmosis de lquido hacia el interior del
capilar a travs de la membrana del mismo. Es producida por las protenas del plasma, que no
atraviesan la membrana capilar y a los cationes retenidos en el plasma por las mismas protenas (efecto
Donnan). El 80% de la presin coloidosmtica del plasma ejercida por las protenas se debe a la
albmina y el restante 20% a las globulinas
Las protenas plasmticas cumplen:
Funcin nutritiva, empleadas en el metabolismo proteico como fuente de aminocidos.
Coagulacin sangunea, el fibringeno y otras globulinas son factores de coagulacin de importancia
para la hemostasia sangunea.
Viscosidad sangunea, por su tamao y peso molecular.
Equilibrio cido-base, como sistema tampn por sus propiedades anfteras.
Inmunidad y defensa, de las -Glb.
Transporte de sustancias, y -Glb (transcortina, transferrina, etc.) participan en el transporte en
sangre de molculas de diferente naturaleza (hormonas, oligoelementos, etc.).
Otras protenas
Protenas que actan como enzimas y que en condiciones patolgicas pueden emplearse con fines
diagnsticos. Por ejemplo: glutmico-oxalacticotransaminasa (GOT), glutmico-pirvico-

transaminasa (GPT), creatn-quinasa (CK), -glutamil-transferasa (-GT), lctico-deshidrogenasa

(LDH), -amilasa y fosfatasa alcalina.
Sustancias nitrogenadas no proteicas (NNP)
La principal sustancia es la urea (balance ureico nitrogenado - BUN), le siguen aminas y aminocidos,
cido rico, creatinina, creatina y alantona.
Glcidos
Podemos encontrar monosacridos (glucosa, manosa y galactosa) libres en el PS y conjugados
(glucoprotenas) se designa con el trmino glucemia y se expresa en g/L o mg/dL. El aumento de la
concentracin de glucosa se denomina hiperglucemia y la disminucin hipoglucemia. Los niveles
normales de glucosa en las diferentes especies animales fluctan entre los 50 mg/dL de rumiantes, 70
mg/dL en quidos y carnvoros y 180 mg/dL en aves. Los niveles de glucemia se encuentran en un
equilibrio constante por la accin conjugada de mecanismos reguladores endocrinos.
Lpidos
La mayor parte de los lpidos estn constituidos por grasas neutras, colesterol, fosftidos, triglicridos
y cidos grasos libres, existe adems una fraccin unida a protenas (lipoprotenas). La lipemia
(concentracin de lpidos totales en sangre), en la prctica el trmino hiperlipemia suele referirse a
hipercolesterolemia o a hipertrigliceridemia. En cada especie, estos niveles estn influidos por la
alimentacin, edad y sexo principalmente. El colesterol y las lipoprotenas HDL, IDL, LDL y VLDL
(lipoprotenas de alta, intermedia, baja y muy baja densidad), son los lpidos hemticos de mayor
inters.
Pigmentos
Los principales pigmentos son los pigmentos biliares y el caroteno, este ltimo sobre todo en quidos
y bvidos. En algunas enfermedades hepticas y en la ictericia hemoltica se incrementan los niveles
de bilirrubina en sangre (bilirrubinemia).
cidos orgnicos y cuerpos cetnicos
Los cidos grasos voltiles (AGV) que pueden ser utilizados por la mayora de los tejidos como fuente
inmediata de energa. Por ejemplo, en rumiantes los AGV (acetato, butirato, propionato, etc.) cubren
entre el 60-80% de las necesidades energticas. Los cuerpos cetnicos (CC) son de inters para valorar
el grado de abastecimiento energtico en los rumiantes. La fraccin ms importante corresponde al
cido -oxibutrico. Situaciones de abastecimiento energtico reducido (gestacin gemelar, vacas con
alta produccin lechera) pueden movilizar AG de los tejidos adiposos, provocar un incremento en la
formacin de CC en hgado y aumentar los niveles de CC en sangre (cetonemia).
Vitaminas y hormonas
En sangre se encuentran todas las vitaminas y hormonas, aunque en concentraciones muy bajas.
Igualmente, con ayuda de mtodos especiales (radioinmunoensayo) pueden detectarse en sangre casi
todas las hormonas.
Componentes inorgnicos del plasma sanguneo
Oligoelementos
Hierro (Fe). Fundamental en la eritropoyesis al formar parte de la molcula de la hemoglobina (Hb)
en los glbulo rojos (GR).
Zinc (Zn). Principal componente de la enzima anhidrasa carbnica de los glbulos rojos (GR).
Cobre (Cu). Se encuentra en plasma sanguneo (PS) unido a una 2-Glb (ceruloplasmina).
Yodo (I). De importancia en las hormonas tiroideas (tiroxina y triyodotironina).
Cobalto (Co). Componente de la vitamina B12.

Iones
Los componentes inicos son los responsables de la presin osmtica de la sangre y proporcionan a las
clulas sanguneas un medio inico determinado, sometido a fluctuaciones muy reducidas. La
concentracin de los diferentes iones est regulada a nivel hormonal. La concentracin de cationes es
superior a la de aniones por lo que la sangre tiene una reaccin dbilmente alcalina. Entre los iones de
significacin fisiolgica tenemos:
Cationes: Na+, K+, Ca2+, Mg2+
Aniones: Cl-, PO4H2-, CO3H-, SO42-
Sistemas buffer
La presencia de CO3H- y PO4H- son sistemas buffer del pH sanguneo, son los sistemas carbonatado y
fosfatado:
- Sistema carbonatado: Formado por el cido carbnico y el bicarbonato sdico. Es el sistema tampn
ms importante, sobre todo para compensar desviaciones bruscas del pH hacia el lado cido. Con el
nombre de reserva alcalina definimos el volumen de CO2 en %, liberado por cada 100 ml de PS. Este
sistema acta como amortiguador del pH segn las siguientes reacciones:
ClH + CO3HNa CO3H2 + ClNa CO3H2 CO2 + H2O
NaOH + CO3H2 CO3HNa + H2O
- Sistema fosfatado: Formado por fosfato monosdico y fosfato disdico. Actan como
amortiguadores del pH segn las siguientes reacciones:
ClH + PO4HNa2 ClNa + PO4H2Na
NaOH + PO4H2Na PO4HNa2 + H2O
Esta qumica aplicada, los anlisis bioqumicos y su interpretacin nos permiten elaborar un
diagnstico de la situacin del paciente. Mediante anlisis bioqumicos se puede estudiar la funcin
del hgado y del rin, por ejemplo las determinaciones relacionadas con el rin son la urea y la
creatinina. Dado que una de las funciones primordiales del rin es la eliminacin de agua y de
electrolitos, el estudio de la funcin renal se complementa con el ionograma, que determina los niveles
de sodio, potasio y cloro.
La funcin del hgado se estudia midiendo valores de la actividades enzimticas como GOT/ALT,
GPT/AST y GGT que corresponden a lo que de forma genrica se conoce como transaminasas. Son
enzimas que se hallan en el interior de las clulas hepticas. Valores por encima de los normales
denotan que hay un proceso que provoca una inflamacin. Estos procesos pueden ser de ndole tan
variada como una hepatitis (aguda o crnica) o los efectos txicos del alcohol o de ciertos frmacos.
La fosfatasa alcalina es otra enzima que est presente en el hgado, adems de estarlo en otras zonas
como el hueso. Suele elevarse en problemas de obstruccin de las vas biliares y en algunas
alteraciones del hueso, como en la fase de consolidacin de una fractura o en infiltraciones tumorales.
Los niveles de bilirrubina tambin son indicadores de la salud del hgado. La bilirrubina se forma al
destruir la hemoglobina y la capta el hgado, que la elimina por la bilis. Cuando este no es capaz de
metabolizarla correctamente (como ocurre en diversas hepatopatas) o cuando hay algn problema en
la excrecin de la bilis (como piedras en la vescula), se detectan niveles elevados de bilirrubina. Si
son importantes, puede observarse un tinte amarillento de la piel, muy caracterstico, que se conoce
como ictericia.
Para el estudio del metabolismo podemos analizar las concentraciones de la glucosa y el colesterol. La
glucosa es el hidrato de carbono considerado como la principal fuente de energa para las clulas. Sus
niveles varan segn la ingesta y los ayunos prolongados. Los valores normales en el perro es de 60-
100 mg/dL, y en el gato 60-90 mg/dL, valores sostenidos sobre 150 mg/dL, debe ser considerado
diagnstico de diabetes. El umbral renal para la glucosa en perros es de 180 mg/dL mientras que en
gatos es ms alto 250 mg/dL, cuando se superan estos valores es posible detectar glucosa en orina
(glucosuria).

Para el estudio de las grasas o lpidos, las tcnicas analticas determinan los valores del colesterol y los
triglicridos. Del colesterol se estudian sus niveles totales y algunas de sus fracciones, que se conocen
como colesterol "bueno" (HDL) y colesterol "malo" (LDL). El colesterol es un elemento
imprescindible para la vida, ya que es el precursor de algunas hormonas y de los cidos biliares. Dado
que es una sustancia grasa, no es soluble en el agua de la sangre y necesita una lipoprotena que la
transporte. Las lipoprotenas ms conocidas son la LDL y la HDL. La LDL es la responsable del
transporte del colesterol a los tejidos, si est elevada, contribuye a que se deposite mas colesterol en
las paredes de las arterias. Por el contrario, la HDL retira el colesterol de los tejidos y, por ese motivo,
se conoce de manera popular como colesterol "bueno".
El inters clnico en la determinacin de las protenas es para valorar insuficiencia hepatocelular,
sndrome nefrtico, sndrome inflamatorio agudo, trastornos de la coagulacin, desnutricin, y
sndrome de malabsorcin. La albmina es una protena de peso molecular 62.000 Da que acta como
protena de reserva, adems de importante transportador (cidos grasos, bilirrubina y frmacos) y
regulador osmtico. Es producida por el hgado. Su concentracin aumenta en casos de deshidratacin
y disminuye en casos de ascitis/edema y dao heptico severo.
Qumica Sangunea Veterinaria. Valores de referencia

Trabajo Prctico N II:

MTODO COLORIMTRICO PARA DETERMINAR PROTENAS TOTALES Y
ALBMINA EN SUERO
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Aplicar el anlisis cuantitativo colorimtrico (espectrofotometra) en el dosaje de protenas totales y
albmina presentes en suero sanguneo de distintas especies animales.
Aprender los fundamentos del mtodo colorimtrico aplicado en la determinacin de protenas
totales y albmina.
Aprender el manejo y cuidados a tener en cuenta en el manejo de pipetas automticas.
Construir curvas de calibracin para protenas totales y albmina, utilizando como patrn una
solucin de albmina y globulinas en estado nativo con una concentracin conocida de protenas y
albmina.
Realizar los clculos necesarios para la correcta determinacin de la concentracin de compuestos
en muestras incgnitas.
SIGNIFICACIN CLNICA
Las protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el
organismo y esenciales para la vida. Actan como elementos estructurales y de transporte y aparecen
bajo la forma de enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulacin, etc.
La protena ms abundante en plasma es la albmina. Es una protena globular y una de sus
funciones ms importantes es la de permitir el transporte de cidos grasos, hormonas esteroides,
bilirrubina, catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso.
La concentracin de albmina en plasma influye notablemente en el mantenimiento de la
presin coloidosmtica, lo que estara relacionado con su relativamente bajo peso molecular y los
cationes retenidos en la red de cargas negativas de las protenas que tienden a producir la osmosis de
lquido hacia el interior del capilar a travs de la membrana del mismo. Las albminas suponen cerca
de un 80% de la presin coloidosmtica ejercida por el plasma.
La capacidad de retencin de agua de la sangre depende de la concentracin de protenas en el
plasma. Si la cantidad de protenas disminuye por debajo del valor normal, alteracin conocida como
hipoproteinemia, se puede producir edema.
En condiciones patolgicas como insuficiencia heptica (dficit en su sntesis), sndrome
nefrtico (excrecin renal anormal), desnutricin, infecciones prolongadas, hemorragias, etc., suelen
presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma mltiple, endocarditis bacteriana y
hemoconcentraciones de diversos orgenes, se observan hiperproteinemias.
En general, ambas situaciones se ven acompaadas tambin por hipoalbuminemias. Los
aumentos anormales de albmina son ocasionales y se relacionan casi siempre con deshidratacin que
produce el consecuente aumento en el contenido proteico del plasma.
La relacin Alb/globulinas permite detectar estados patolgicos que junto con el anlisis de
otros signos y sntomas conducir a realizar un adecuado diagnstico.
Tanto en hiper como en hipoproteinemias, el cociente albminas/globulinas permanece
constante. Este cociente va a estar alterado si predomina una alteracin en una de las fracciones. Por
ejemplo:
a) Reduccin del cociente A/G por proteinuria renal y/o produccin de inmunoglobulinas por
estimulacin antignica.
b) Incremento del cociente A/G slo se podra dar por una falta de produccin de
inmunoglobulinas, ya que el cuerpo no produce albmina en exceso.
20 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

FUNDAMENTOS DEL MTODO COLORIMTRICO

Determinacin de Protenas Totales:
Se basa en la reaccin del Biuret caracterstica de grupos aminopeptdicos, con los que el
Cu (II) en medio alcalino forma enlaces de coordinacin, originando complejos de color violeta.
Si a una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se le aade a una solucin
de protena se forma un complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una
coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm, cuya intensidad es
proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra.
Las caractersticas ms importantes de la reaccin del Biuret son:
Permite la determinacin de todos los pptidos a partir de los tetrapptidos y protenas.
Su rango de sensibilidad es de 1 a 10 mg/mL de protenas.
No depende de la composicin de aminocidos.
Interferencias: algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) tambin reaccionan.
Complejo protena-Cu (II):
Determinacin de Albmina:
La albmina reacciona especficamente -sin separacin previa- con la forma aninica de la
3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon ftalena (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio
tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de Reactivos, es
proporcional a la cantidad de albmina presente en la muestra.
Reactivos:
Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/L en NaOH 875 mmol/L y alquil aril politer
(AAP).
Reactivo BCF: solucin de 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfonftalena (en polioxietiln lauril ter).
Desarrollo Experimental:
Se procesar una muestra de suero sanguneo proveniente de diferentes especies a fin de poder
determinar la concentracin de protenas totales, albmina y relacin albmina/globulinas.

A.- Determinacin de Protenas Totales (PT)

Condiciones de reaccin: Longitud de onda: 540 nm; temperatura de reaccin: 37C; tiempo de
reaccin: 15 min; volumen mximo de muestra 50 l; volumen de Reactivo EDTA/Cu 3,5 mL.
Diluciones del Estndar de Albmina y globulinas: La ctedra preparar una serie de diluciones del
suero patrn de acuerdo al siguiente esquema:
Estndar de Albmina y globulinas H2O destilada Concentracin

(...g/dL PT) (L) (L) PT (g/dL)
PT 1 240 360
PT 2 360 240
PT 3 480 120
PT 4 600 0
Esquema de la tcnica:
1er paso: Disponer una batera de tubos de ensayo de la siguiente manera:
Estndar de Albmina y globulinas H2O destilada Abs 540 nm

Tubo N
(L) masa (mg) (L)
1 Bco. React. 0 50
calibrado
Curva de
2 PT 1 50 0
3 PT 2 50 0
4 PT 3 50 0
5 PT 4 50 0
Muestra: indicar especie Suero (L) H2O destilada (L) Abs 540 nm
6 20 30
7 50 ---
8 (blanco de muestra 6) 20 30
9 (blanco de muestra 7) 50 ---
2do paso: Tubos 1 a 7: Agregar 3,5 ml de reactivo EDTA/Cu a cada tubo
Tubos 8 y 9: Agregar 3,5 mL de agua destilada (blancos de muestra)
3er paso: Mezclar con agitador vortex
4to paso: Incubar 15 min a 37 C
5to paso: Leer en espectrofotmetro a 540 nm y registrar los resultados en la ltima columna.
El color de la reaccin es estable durante 12 horas por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de
ese lapso.
1-2 3 4

5
B.- Determinacin de Albmina
Condiciones de reaccin: Longitud de onda: 625 nm; temperatura de reaccin: 15 a 28 C; tiempo de
reaccin: 10 min; volumen mximo de muestra 10 L; volumen de Reactivo BCF 3,5 mL.
Diluciones del Estndar de Albmina y globulinas: La ctedra preparar una serie de diluciones del
suero patrn de acuerdo al siguiente esquema:
Estndar de Albmina y globulinas H2O destilada Concentracin Alb
(..g/dL Alb) (L) (L) (g/dL)
Alb 1 30 90
Alb 2 60 60
Alb 3 120 0
Esquema de la tcnica:
1er paso: Disponer una batera de tubos de ensayo de la siguiente manera:
Estndar de Albmina y globulinas H2O

Tubo destilada Abs 625 nm
( g/dL Alb)
(L) masa Alb (mg) (L)
1 Bco. React. 0 10
calibrado
Curva de
2 Alb 1 10 0
3 Alb 2 10 0
4 Alb 3 10 0
Muestra: Indicar especie Suero (L) H2O destilada (L) Abs 625 nm
5 5 5
6 10 0
2do paso: Tubos 1 a 6: Agregar 3,5 ml de reactivo BCF a cada tubo
Tubos 7 y 8: Agregar 3,5 ml de agua destilada (blancos de muestra)
3er paso: Mezclar con agitador vortex
4to paso: Mantener los tubos en un bao termosttico entre 15 y 28 C durante 10 min
5to paso: Leer en espectrofotmetro a 625 nm y registrar los resultados en la ltima columna de la
tabla. El color es estable 20 minutos por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso.
En el siguiente cuadro se muestran los valores de referencia para distintos metabolitos dosados
en suero sanguneo de animales de distintas especies. Para este TP, tenga en cuenta los valores
enmarcados, correspondientes a Albmina y Protenas Totales.


Informe: TRABAJO PRCTICO N II

Determinacin de Protenas Totales y Albmina en suero.
Fecha: Integrantes:
Caracterizacin de la muestra:
Suero sanguneo de .. (Indicar especie con la que se trabaj)
Comentarios:
Dosaje de Protenas Totales:

Datos de medida de Absorbancia. Longitud de onda (nm):
Estndar de Albmina y globulinas

Tubo Abs 540 nm Abs corregida
(g/dL PT) (L) masa (mg)
1 Bco. React. 0
calibrado
Curva de
2 PT 1 50
3 PT 2 50
4 PT 3 50
5 PT 4 50
muestra (indicar especie): Suero (L) H2O dest. (L) Abs 540 nm Abs corregida
6 20 30
7 50 ---
Ejemplo de Clculo de masa de Protena/tubo para un tubo de estndar:
Grfico de Calibracin: Absorbancia

en funcin de Masa de Protena.
(Colocar nombres y unidades de
medida de las variables en los
ejes X e Y)
Comentarios:

Determinacin de los parmetros de la recta de calibracin:

Ordenada al origen:
Pendiente:
A.- Determinacin de concentracin de Protenas Totales en las muestras incgnitas:
Ejemplo de clculo:
Tubo N 6 Volumen de muestra:
Masa de protena en el tubo (mg):

Clculo de concentracin de Protenas Totales (g prot/dL)
Informar concentracin de protenas totales en suero para la especie analizada en g/dL:
B.- Determinacin de Albminas en suero:

Datos de medida de Absorbancia: Longitud de onda (nm):
Estndar de Albmina y globulinas

Tubo Abs 625 nm Abs corregida
(g/dL Alb) (L) masa Alb (mg)
1 Bco. react. 0
calibrado
Curva de
2 Alb 1 10
3 Alb 2 10
4 Alb 3 10
muestra: indicar especie Suero (L) H2O dest (L) Abs 625 nm Abs corregida
5 5 5
6 10 ---
Ejemplo de Clculo de masa de Albminas/tubo para un tubo de estndar:

Grfico de Calibracin: Absorbancia en funcin de Masa de Albminas.

(Colocar nombres y unidades de medida de las variables en los ejes X e Y)
Comentarios:
Determinacin de los parmetros

de la recta de calibracin:
Ordenada al origen:
Pendiente:
Ejemplo de clculo:
Masa de albmina en el tubo (mg):
Clculo de concentracin de Albminas Totales (g albminas/dL)

Informe la concentracin de albminas en suero de la especie analizada en g/dL:
C.- Calcular la relacin Albmina/Globulinas para cada especie: [Albmina] .

[Protenas totales] [Albmina]
DISCUSIN DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

GUA DE AUTOEVALUACIN:
CUANTIFICACIN DE PROTENAS TOTALES Y ALBMINA EN SUERO
1. Cul es el fundamento de seleccionar una longitud de onda diferente para determinar protenas
totales y albminas?
2. Cul es el fundamento qumico del mtodo de Biuret para cuantificar protenas?
3. Analice cmo podran modificarse los resultados de cuantificar el contenido de protenas totales y
de albmina si se emplea plasma sanguneo como muestra en lugar de suero.
4. Idem pregunta 3 empleando un suero que presenta un grado elevado de hemlisis (ruptura de
glbulos rojos).
5. Explique el concepto de blanco de muestra. Cul es su utilidad, qu informacin aportan? Indique
cmo se prepararan para las determinaciones de protenas totales y de albmina especificando los
componentes y volmenes que se deben agregar y cules no debera agregar. Justifique su
respuesta.
6. Idem pregunta 5 para un blanco de reactivos.
7. Explique el concepto de presin coloidosmtica y su relacin con el contenido de protenas en
suero.
8. Indique los valores de referencia esperados de albmina y de protenas totales en vaca, caballo,
perro y gato. Indique qu porcentaje de protenas totales se espera que est representado por
albmina e investigue acerca de patologas asociadas a variaciones en la fraccin de albminas o de
otras protenas.

Manejo de pipetas de precisin de volumen variable (micropipetas)

Este tipo de instrumento permite el pipeteo de pequeos volmenes de lquidos con precisin
y reproducibilidad. Es un instrumento de precisin que, como tal, es costoso y requiere de cierto
cuidado en su manejo. Las mismas son autoclavables y utilizan un cono, punta o tip descartable, con el
que se toman las muestras.
Requerimos leer atentamente este apndice para evitar una mala manipulacin de las mismas.
Descripcin general de una micropipeta tipo.
A- Push button, suele indicar el mximo Vol a pipetear

B- Tambor mvil, a partir del cual se puede ajustar el volumen a
dispensar. En un pequeo visor, se observa el volumen a calibrar.
C- Conducto principal-vstago
D- Eyector de tips, este es activado presionando el botn E.
F- Tip descartable
Tabla: Lmites operativos y lectura de volumen.

Modelo Rango de Volumen Lectura del indicador
de Volumen
P20 2 l - 20 l
P200 50 l 200 l
P1000 200 l 1000 l
1L= 10-3 mL
29 Gua de Uso de Micropipetas Medicina Veterinaria

Utilizacin:
Observar que el mbolo (push button) tiene tres posiciones. T0 (B-E), T1, primer tope (AC), T2 (D)
Para la carga:
1. Calibracin del volumen, tener mucho cuidado en NO SOBREPASAR los lmites operativos de
cada pipeta.
2. Colocar el tip.
3. Llevar el mbolo a la posicin de carga T1 (ver A).
4. Dentro del lquido a pipetear, liberar el mbolo lentamente hasta la posicin T0 (ver B).
5. Para la descarga bajar el mbolo suavemente, este debe pasar por primer tope, para la descarga total,
llegar hasta el final, posicin T2 (ver C y D).
6. Finalmente, fuera del lquido dispensado, liberar el mbolo hasta T0 (ver E).
7. Descartar el tip.
Algunas recomendaciones para el correcto pipeteado

Mantener en posicin vertical a la hora de aspirar el lquido, insertando la punta tan solo unos
milmetros.
Para evitar la contaminacin no se debe dejar la pipeta en posicin horizontal, especialmente con la
punta insertada.
Realizar un pre-rising antes de aspirar el lquido llenando y vaciando la misma de 3 a 5 veces. Esto es
especialmente importante cuando el pipeteado se realiza con lquidos con viscosidad y densidad mayor
a la del agua, o lquidos con gran capacidad de evaporacin (ej. Etanol).
Asegurarse que la pipeta, punta y lquido se encuentran a la misma temperatura. Cuando se dispensan
lquidos con temperatura diferente a la temperatura ambiente, es necesario cambiar la punta en cada
dispensado.
Sobre su mantenimiento
Las pipetas estn diseadas para un fcil mantenimiento en el laboratorio. Si la pipeta trabaja a diario,
se recomienda limpiar, descontaminar y comprobar rendimientos cada 3 meses. Cambiar el filtro de
seguridad regularmente (se recomienda cada 50 - 250 ciclos). Esterilizacin de la pipeta: se puede
esterilizar completamente en autoclave de vapor a 121C, durante 20 minutos. Luego se debe dejar
secar una noche completa antes de usar.
30 Gua de Uso de Micropipetas Medicina Veterinaria

Trabajo Prctico N III:

ENZIMAS: ENSAYO CUALITATIVO
OBJETIVOS ESPECFICOS
Caracterizar la actividad enzimtica de la -amilasa salival de forma cualitativa.
Determinar las propiedades de esta enzima, analizando la accin que ejercen distintas
concentraciones de la amilasa salival sobre el almidn, as como la influencia del tiempo y la
temperatura sobre la actividad enzimtica.
Reconocer la funcin de la enzima en el metabolismo de hidratos de carbono en animales
monogstricos y su utilidad clnica en el diagnstico clnico veterinario.
INTRODUCCIN TERICA
Cmo se mide la actividad de una enzima?
Dada una reaccin: Sustrato/s Producto/s
La actividad de la enzima puede evidenciarse ya sea detectando la aparicin del producto o
bien la desaparicin del sustrato. Para esto pueden usarse tcnicas colorimtricas cualitativas
comparando visualmente el color desarrollado o cuantitativas midiendo la absorbancia de la luz a
determinada longitud de onda, empleando sustratos marcados radiactivamente, etc., segn convenga
en cada caso.
Caracterizar la actividad de una enzima implica determinar cules son las condiciones ptimas para
su actividad (tiempo, concentracin de enzima, pH, temperatura, cofactores, etc.), si puede ser
activada o inhibida y cmo, etc.
Caractersticas generales de las amilasas
Las amilasas son enzimas que hidrolizan molculas de almidn dando como productos glucosa
y oligosacridos como maltosas, maltotriosas y dextrinas lmite.
Esta familia de enzimas hidrolticas est compuesta por las protenas catalticas: -amilasa,
-amilasa, glucoamilasa e isoamilasa. Se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos vegetales,
donde juegan un rol muy importante en la degradacin del almidn en la germinacin de las semillas;
en tejidos animales, cumpliendo una misin digestiva; y en diversas especies de microorganismos
como hongos y bacterias.
El almidn y el glucgeno son las
formas de reserva de combustible ms
importantes que encontramos en la naturaleza.
Se encuentran en el interior de la clula (vegetal
y animal) formando agrupaciones o grnulos de
gran tamao.
El almidn es un homopolisacrido
constituido por unidades de D-glucosa. Est
compuesto por dos tipos diferentes de
molculas, la amilosa y la amilopectina. La
amilosa est formada por largas cadenas
lineales de glucosa unidas por enlaces 1,4 y
se arrollan en forma helicoidal. La amilopectina
est formada por cadenas de glucosa con
uniones lineales 1,4 (como la amilosa) pero
con mltiples ramificaciones (uniones 1,6).
En solucin acuosa, la molcula de
almidn presenta una conformacin variable ya
que las uniones 1,4 le permite adoptar distintas conformaciones, siendo la helicoidal la ms comn y
la responsable de ciertas propiedades fsicas como la fijacin del yodo, adsorcin de lpidos y
31 TP III. Enzimas: Ensayo cualitativo Medicina Veterinaria

formacin de complejos con molculas orgnicas polares, compuestos que son conservados dentro de
la hlice. La amilosa fija el yodo dando un complejo de color azul, mientras que la amilopectina fija
menos el yodo que la amilosa dando una coloracin rojiza.
Esta caracterstica es especfica del almidn, debido a su estructura, y se debe a la adsorcin
del yodo por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa. Por tanto no es una reaccin
qumica, sino una interaccin fsica reversible por mtodos fsicos. Esto se puede comprobar
fcilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece (se produce desorcin), y al enfriarla
vuelve a aparecer.
En animales, la -amilasa es producida en las clulas excrinas del pncreas (amilasa P) y en
las glndulas salivales (amilasa S) y escinde los enlaces 1,4 glucosdicos de los polisacridos
(almidn y glucgeno) en el centro de la cadena de los polisacridos, por lo que se la conoce como
endoamilasa, produciendo glucosa, maltosa y oligosacridos.
Sin embargo, esta enzima slo es capaz de degradar parcialmente la amilopectina presente en
el almidn y el glucgeno (polmero de glucosa ramificado como la amilopectina) debido a que no es
capaz de desdoblar los enlaces glucosdicos 1,6 encontrados en los puntos de ramificacin de la
cadena de los polisacridos.
En los animales monogstricos, el almidn es el nico polisacrido altamente utilizable y tanto
ste como los disacridos presentes en la racin han de ser degradados hasta monosacridos para ser
absorbidos.
La digestin y absorcin del almidn tiene lugar en el primer tramo del intestino delgado y la
principal enzima que participa es la -amilasa segregada por el pncreas junto al jugo pancretico y
que acta en la luz intestinal.
La -amilasa rompe la cadena lineal de la amilosa dejando libres molculas de glucosa y
maltosa pero no puede romper las ramificaciones de enlaces 1,6 de la amilopectina por lo que como
primer paso de la digestin de los carbohidratos se genera en la luz intestinal una mezcla de glucosa,
maltosa y oligosacridos. Mientras la glucosa va siendo absorbida, los disacridos y oligosacridos
restantes son atacados por otras enzimas las y glucosidasas presentes en el borde de las
microvellosidades intestinales y responsables de la hidrlisis final de los disacridos.
La accin de la -amilasa salival se efecta mejor a un pH cercano a neutro. Adems de la
diferencia en concentracin, esta es otra de las causas por las que la amilasa pancretica es ms activa
que la salival, ya que en el estmago el pH es muy cido, pero a nivel del intestino delgado es
ligeramente alcalino.
Significacin Clnica
En el caso del hombre y del cerdo, la amilasa se produce principalmente en el pncreas y en
cantidad mucho menor en las glndulas salivales. Fuera del cerdo, el resto de los animales domsticos,
nicamente producen amilasa de origen pancretico.
En consecuencia, la deteccin de niveles aumentados en suero sanguneo permite sospechar
una disfuncin del pncreas y/o de la glndula partida. Sin embargo, como por s sola no permite
hacer una diferenciacin, se debe recurrir a exmenes complementarios o datos aportados de la
evaluacin clnica del animal para realizar un diagnstico diferencial desde el punto de vista
bioqumico.
Fundamento de la prctica
En este trabajo prctico, para medir la actividad de la -amilasa, vamos a usar un conocido
test colorimtrico que permite revelar la presencia de almidn en una solucin. Por lo tanto, vamos a
seguir la reaccin detectando la desaparicin del sustrato.
El almidn en presencia de una solucin de yodo (I) presenta una coloracin azulada debido
a la interaccin fsica entre el yodo y las molculas de amilosa. Cuando la -amilasa degrada el
almidn, elimina la propiedad de la amilosa de interactuar con el yodo y a medida que la hidrlisis
progresa se producen eritrodextrinas (llamadas as porque se tien de rojo si se usa Lugol, de modo
que el color azul va desapareciendo y cambia a rojizo o caf claro).

Dado que el I2 es muy poco soluble en agua, para aumentar su solubilidad se lo mezcla con el
anin ioduro (I-), obtenindose tri-ioduro, el cual, por estar cargado, es ms soluble en agua:
I2 + I - I3-
A esta mezcla se la conoce como solucin de Lugol y es una solucin 1% de yodo diatmico
(I2) en equilibrio con de ioduro de potasio (KI) 2% en agua destilada.
En este trabajo prctico se comprobar la influencia de la concentracin de enzima [E], tiempo
de reaccin y temperatura (T) sobre la actividad de la enzima -amilasa salival humana.
La temperatura afecta la velocidad de las reacciones enzimticas, las bajas temperaturas
inhiben el proceso hasta ser capaz de detenerlo y temperaturas muy elevadas pueden llegar a
desnaturalizar las protenas y anular la actividad enzimtica.
Se determinar el tiempo que debe transcurrir para que la enzima degrade el almidn capaz
de reaccionar con el reactivo de Lugol, es decir, para que no aparezca ms el color azul
caracterstico del complejo yodo + almidn.
La desaparicin del color azul corresponde al llamado efecto acromtico. Este tiempo,
que servir como referencia para evaluar el efecto de los distintos tratamientos, debe estar entre 3 y 8
min.
Desarrollo del TP
Reactivos y Materiales
Recoleccin de la saliva: Un voluntario de cada grupo recolecta una muestra de saliva (2-3 mL) en un
vaso de precipitado pequeo. Coloque un trozo de gasa sobre el embudo y haga pasar la saliva a
travs de la gasa, recibindola en un vaso de precipitado, cuidando que no haga espuma. Mantener
en bao de hielo y medir el pH con papel indicador y anotarlo.
Solucin de almidn al 1 %
Solucin de Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de yodo y 2 g de KI en 100 ml de agua destilada.
Tubos de ensayo, vasos de precipitado, bao de agua termostatizado, cronmetro y termmetros.
Experimento 1. Dilucin ptima de la concentracin de enzima y tiempo de referencia
a) Enzima: Diluir la saliva en un tubo de ensayo, 1:10 (1 mL saliva + 9 mL agua destilada). Tapar el tubo
con tapn de goma y mezclar por inversin suave varias veces (No agitar!). Medir y registrar el pH.
b) Determinacin de la actividad enzimtica
1. Preparacin del sustrato: Los docentes entregarn a cada grupo 1 tubo de ensayo rotulado como S
(sustrato) con 10 mL de solucin neutra (pH 7) de almidn 1% (m/v). Colocar el tubo en un bao
trmico a 37C durante por lo menos 2 min.
2. Preparacin de tubos con solucin de Lugol: Rotule 10 tubos de ensayo (1 al 10). Agregue a cada uno 5
mL de agua destilada + 3 gotas de reactivo Lugol y mantenga los tubos en una gradilla a temperatura
ambiente. El tubo 1 se tomar como control para tener como referencia el color del reactivo Lugol
por lo que no se le agregar la solucin de enzima.
3. Reaccin enzimtica: Manteniendo el tubo con el almidn (sustrato) a 37C, agregarle 1 mL de la
saliva diluida (enzima), tapar con tapn de goma y mezclar por inversin. Llamamos a esto t=0 o
tiempo cero (momento en que comienza la reaccin) por lo que en el momento de agregar la saliva
otro integrante del grupo comienza a cronometrar. Colocar inmediatamente el tubo en el bao a 37C
y mantener all hasta el final del experimento.
4. Test colorimtrico para revelar la actividad enzimtica: Retirar del tubo (sustrato + enzima), a t=0 y
cada 60 segundos, 3 gotas con una pipeta Pasteur y agregarlas a los tubos 2 al 10 (previamente
preparados!!!) que contienen la solucin de Lugol. Mezclar. Determinar y anotar el tiempo que debe
transcurrir para que la enzima degrade el almidn capaz de reaccionar con el reactivo de Lugol, es
decir, para que no aparezca ms el color azul caracterstico del complejo yodo+almidn. La
desaparicin del color azul corresponde al llamado efecto acromtico. Este tiempo, que servir
como referencia para evaluar el efecto de los distintos tratamientos, debe estar entre 3 y 8 min. Si no
es as, diluir ms (o menos, segn corresponda) la saliva y repetir el ensayo hasta encontrar la dilucin

ptima que nos permita alcanzar el efecto acromtico en el rango de tiempo antes mencionado. Anotar
el tiempo de referencia.
Tubo Tubos con Lugol Test colorimtrico Color azul
Agua dest. Lugol Tubo (S+E) (+, ++, etc.)
1-control 5 mL 3 gotas --- tiempo
Mezclar con agit. vortex

2 5 mL 3 gotas 3 gotas 0
Mezclar con agit. vortex

3 5 mL 3 gotas 3 gotas 1 min
A tiempo 0 agregar 1 mL dilucin saliva

(enzima), mezclar y cada 60 seg sacar 3 gotas y
realizar test colorimtrico
Experimento 2. Efecto del pre-tratamiento de la enzima con calor (100C)

- Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de la saliva a la dilucin ptima encontrada e incubarlo 10 min en
un bao de agua a 100C.
- Dejar enfriar a temperatura ambiente.
- Medir luego la actividad enzimtica como se detall en el punto b).
- Determinar el tiempo necesario para que se produzca el efecto acromtico.
- Comparar con el tiempo de referencia.
Experimento 3. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica
- Medir la actividad enzimtica como en el punto b) empleando 1 mL de la saliva a la dilucin ptima
pero incubando a temperaturas diferentes de 37C:
a) 0C (bao de agua y hielo), b) temperatura ambiente, c) 70C.
- Determinar en cada caso el tiempo necesario para que se produzca el efecto acromtico.
- Comparar con el tiempo de referencia.
Dilucin ptima
enzima
Sustrato: Sustrato: Sustrato:

almidn almidn almidn
1% 1% 1%
Bao a 0 C a T amb Bao a 70C

Informe: TRABAJO PRCTICO N III. ENZIMAS: ENSAYO CUALITATIVO

Caracterizacin de la actividad -amilasa salival
Fecha: Integrantes:
Caracterizacin de la muestra:
pH salival:
Dilucin ptima:
Efecto Acromtico, tiempo de referencia (min):
Pre Tratamientos y Tratamientos Tiempo Efecto Acromtico

Calentamiento de la enzima a 100C
Temperatura de incubacin de la mezcla S+E:
- 0C
- T Ambiente
- 70C
GUA DE AUTOEVALUACIN: TP III Enzimas. Ensayo cualitativo

Objetivos:
Manejar conceptos de las tcnicas para la determinacin experimental de la actividad enzimtica en
forma cualitativa.
Analizar las caractersticas estructurales del almidn que permiten su identificacin mediante las
disoluciones de yodo.
Aplicar los conceptos tericos en la interpretacin de los factores que afectan la actividad enzimtica
como dilucin de la enzima [E], tiempo de incubacin, temperatura, sustrato.
Lograr la interpretacin de los resultados obtenidos en el desarrollo del trabajo prctico para la
determinacin cualitativa de la actividad -amilasa en una muestra de saliva.
Cuestionario de Autoevaluacin
1. Describa qu caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante las
disoluciones de yodo.
2. Mencione los productos obtenidos a partir de la hidrlisis del almidn. Por qu debe hidrolizarse el
almidn para ser absorbido en el intestino de los animales?
3. Explique el efecto de la -amilasa salival sobre los enlaces del almidn, especificando las
condiciones en que se produce el efecto acromtico.
4. Analice y explique si el efecto acromtico indica que el almidn se ha degradado completamente.
5. Indique para qu se determina la dilucin ptima y el tiempo de referencia.
6. Explique, desde el punto de vista terico: qu efectos tienen y cmo podran afectar afectan la
actividad enzimtica:
a) El tratamiento enzimtico a temperaturas superiores a 70C ?
b) Realizar la reaccin enzimtica a 0C, temperatura ambiente, 37C o 70C ?
7. A qu temperatura esperara Ud. que la -amilasa tuviera su actividad ptima? Por qu?
8. Indique los resultados que esperara obtener en el tubo en que la enzima se hierve antes de incubarlo
a 37C en presencia de almidn.
9. Investigue acerca del pH ptimo de la actividad de la -amilasa y luego describa y analice, desde el
punto de vista terico, el efecto que tendra la utilizacin de un medio de incubacin con pH muy
cido o muy bsico en la realizacin del trabajo prctico de determinacin de actividad amilasa.

Trabajo Prctico N IV:

ENZIMAS: ENSAYO CUANTITATIVO
Objetivos
- Analizar cuantitativamente la variacin de la actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina de suero
sanguneo en funcin de la concentracin de sustrato.
- Establecer las condiciones adecuadas para que la determinacin de la velocidad de reaccin sea
proporcional a la concentracin de enzima.
- Determinar la actividad enzimtica especfica.
- Afianzar los conceptos sobre condiciones ptimas de medida de la actividad enzimtica en fluidos
biolgicos o tejidos como herramienta para el diagnstico de muchas enfermedades.
Introduccin
Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un
complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima libre (E):
E+S ES E+P
La mayora de las reacciones biolgicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las
enzimas hacen que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rpidamente. Varios factores como
el tiempo de incubacin; la concentracin de enzima; la temperatura del medio; el pH y la
concentracin de sustrato influyen en el transcurso de la reaccin.
Las tcnicas de determinacin enzimtica, y en particular las de inters clnico, son
mayoritariamente espectrofotomtricas. En estos casos es posible cuantificar la desaparicin del
sustrato (-S/t) o la aparicin del producto (P/t) por espectrofotometra, de tal manera que se
puede medir la actividad de una enzima por la variacin de color producida.
La fosfatasa alcalina tiene una baja especificidad de sustrato por lo que es capaz de hidrolizar
una amplia variedad de fosfosteres orgnicos. El aceptor del fosfato liberado por accin de la enzima
puede ser cualquier solvente que contenga un grupo OH, habitualmente una molcula de agua:
R-O-PO 2- + H-O-H R-O-H + H-O-PO 2-
3 3
El trmino alcalina se refiere al pH ptimo de la enzima que es altamente bsico. Esta enzima
presenta mltiples isoformas y est presente en muchos tejidos, de modo tal que sus valores
sanguneos se alteran fundamentalmente en procesos que afectan el sistema hepatobiliar o el tejido
seo (de aqu su inters en medicina clnica).
Determinacin cuantitativa de la actividad fosfatasa alcalina en suero
La medida de la actividad enzimtica se refiere a la capacidad de la catlisis en condiciones
ptimas, es decir cuando la enzima acta a su mxima velocidad. Esto se obtiene estandarizando las
condiciones del medio -pH, temperatura, cofactores- y utilizando un exceso o concentraciones
saturantes de sustrato.
Cuando la concentracin de sustrato no es saturante, la velocidad de la reaccin enzimtica
(V0) depende de la concentracin de sustrato [S], de acuerdo a la ecuacin de Michaelis-Menten (para
enzimas Michaelianas):
V0 = Vmax [S] .
Km + [S]
Constantes cinticas
Km (constante para cada enzima): Es la [S] en la que la V0
= Vmax. Medida inversa de la afinidad del enzima por S.
Vmax (constante para cada concentracin de enzima): Se
alcanza cuando todos los centros activos estn ocupados
con sustrato, es decir en condiciones saturantes de sustrato.
36 TP IV. Enzimas: Ensayo cuantitativo Medicina Veterinaria

Los valores de Km y Vmax se pueden estimar a partir

del grfico de V0 vs. [S], aunque calcularlos a partir de este
grfico no es fcil.
Una forma ms exacta para calcular las constantes
cinticas es utilizar la transformacin lineal de Lineweaver-Burk:
1/V vs. 1/[S]
Se obtiene una recta en la cual:
la pendiente es Km/Vmax
abscisa al origen es - 1/Km
la ordenada en el origen es 1/Vmax
Fundamentos de la determinacin
El sustrato fenilfosfato de sodio, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser
hidrolizado por esta enzima. La fosfatasa alcalina desdobla al fenilfosfato de sodio en medio alcalino
tamponado con aminometil propanol (AMP). El fenol liberado se determina por reaccin con 4-amino-
antipirina y ferricianuro como agente oxidante. El color desarrollado se cuantifica por la medida de
absorbancia a 520 nm.
Para los clculos, es decir, para determinar la actividad enzimtica a partir del producto
formado, se utiliza un factor (la inversa de la pendiente de la recta de calibracin obtenida al
representar Abs. corregida vs. UI/L). Este factor permite cuantificar la concentracin de producto en la
solucin de la siguiente forma:
Formacin de producto (UI/L) = factor x Abs. corregida
Reactivos provistos por kit Wiener Lab Fosfatasa alcalina optimizada (Cd. 1361003).
Buffer: 4-aminoantipirina 29 mmol/L en solucin de aminometil propanol 3 mol/L pH 10 (a 37C).
NaFF: fenilfosfato de sodio (sustrato), 1,4 mmoles. Diluir en 50 mL de buffer pH 10: 28 mM.
Frmula lineal: C6H5PO4Na22 H2O PM: 254.09. Se prepararn diluciones en buffer pH 10 para
obtener concentraciones de: 2.8, 5.6, 11.2, 16.8, 22.4 y 25.2 mM.
Reactivo de color: ferricianuro de potasio, 10 mmol/L. Disolver el contenido del envase en 500 mL
de agua destilada.
Standard: solucin de fenol (producto) equivalente a 200 UI/L.
Precauciones: Los reactivos son para uso diagnstico "in vitro". El reactivo de color es txico.
Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:
Los reactivos provistos son estables en refrigerador (2-10C) hasta la fecha de vencimiento indicada
en la caja.
Sustrato: una vez preparado es estable durante 5 meses en refrigerador (2-10C).
Reactivo de color: una vez preparado es estable durante 5 meses a temperatura ambiente y al abrigo de
la luz.
Indicios de inestabilidad o deterioro de los reactivos: Valores de blanco de reactivos mayores a
0,120 unidades de absorbancia indican contaminaciones, debindose descartar los reactivos.
Muestra: Suero
a) Recoleccin: debe usarse nicamente suero fresco, no hemolizado (la ruptura de los glbulos rojos
hemlisis- interfiere en la determinacin porque en el interior de los glbulos rojos la actividad de
la fosfatasa alcalina es abundante).

b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas: los anticoagulantes producen inhibicin de la reaccin en un 50
a 90%.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: si la determinacin no puede ser efectuada en un
plazo de 6 horas, la muestra debe conservarse congelada (- 4C) ya que a temperatura ambiente o en
refrigerador (2-10C) hay aumento de actividad de 30 a 50 % en 24 horas
Condiciones de reaccin
- Longitud de onda: 520 nm
- Temperatura de reaccin: 37C
- Tiempo de reaccin: 10 minutos
- Volumen de muestra: 50 L
- Volumen final de reaccin: 3,05 mL
Estabilidad de la mezcla de reaccin final: El color de la reaccin es estable durante 30 minutos por
lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese lapso.
Procedimiento Experimental
a) Curva de calibracin (los datos sern aportados por la ctedra)
Standard solucin de fenol (producto): 50 L equivalente a 200 UI/L.
1 UI = Cantidad de enzima que cataliza la formacin de 1 mol de Producto/min
Estandar, Buffer, Reactivo Absorbancia Abs. UI/L
Tubo
L L color, mL 520 nm corregida1
1 0 500 2,5 Mezclar de
2 10 490 2,5 inmediato cada tubo
3 25 475 2,5 y leer absorbancia a
4 50 450 2,5 520 nm. Llevar a
5 75 425 2,5 cero de absorbancia
6 100 400 2,5 con agua destilada.
: Abs. corregida = Abs. estndar Abs. blanco reactivos (tubo 1)
1
b) Variacin de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato (trabajar

solamente con los tubos 3 a 11, los valores de absorbancia de los blancos sern aportados por la
ctedra)
Tubo Sustrato Buffer Suero Absorbancia Abs. corregida
mM mL mL L
1A
Preincubar en bao de agua a
0 0 0,5 0
37C unos minutos. Luego
2B 0 0 0,5 50
3 2.8 0,5 0 50
4 5.6 0,5 0 50
agregar:
5 11.2 0,5 0 50
6 16.8 0,5 0 50
7 22.4 0,5 0 50
8 25.2 0,5 0 50
9 28 0,5 0 50
10C 5.6 0,5 0 0
11C 28 0,5 0 0
- Iniciar la reaccin con el agregado de enzima en forma secuencial.
- Incubar todos los tubos a 37C durante 10 minutos exactos (usar cronmetro).
- Agregar 2,5 mL del reactivo de color, retirar el tubo del bao termostatizado y agitar.
- Leer la absorbancia a 520 nm de todos los tubos frente a blanco de agua destilada (color de la
reaccin estable 30 minutos).

1A Corresponde al blanco de reactivos. 2B Corresponde al blanco de muestra.

10C y 11C Blancos de reaccin enzimtica. Ambos tubos se emplean para descontar la hidrlisis
qumica (no enzimtica) del sustrato. Como la concentracin del mismo vara entre tubos, se procede a
realizar una curva de velocidad de hidrlisis qumica con ambos valores ms el cero y se interpola el
valor para cada concentracin de sustrato.
c) Determinacin de actividad especfica
A partir del valor de velocidad mxima obtenido en apartado anterior y considerando el valor
de concentracin de protenas en la muestra de suero, calcular la actividad especfica.
Aplicacin en Veterinaria:
La determinacin de actividades enzimticas en el plasma o suero sanguneo se basa en la idea
de que cuando se producen cambios en el rgano o tejido donde se encuentran, se liberan enzimas que
entran en el torrente sanguneo y constituyen una herramienta diagnstica de la funcionalidad del
mismo.
Estos anlisis, sobre todo si van junto con otros procedimientos de investigacin, como el
examen fsico y los antecedentes del animal enfermo, pueden ser de extremo valor para el veterinario,
en sus criterios de diagnostico y pronostico, as como para ponderar los resultados del tratamiento.
Si bien la fosfatasa alcalina tiene muy poca especificidad, ya que puede encontrarse elevada en
mltiples situaciones, tiene dos aplicaciones clnicas muy tiles:
- En enfermedad hepatobiliar.
- En enfermedad metablica sea.
La enzima de origen seo suele estar aumentada (menos de tres veces el valor normal) en
animales jvenes y animales preados. El crecimiento seo fisiolgico eleva la tasa de fosfatasa
alcalina srica en el perodo de crecimiento, observndose elevaciones transitorias durante la fase de
curacin de fracturas seas.
En todos los procesos patolgicos que cursan con actividad osteoblstica3 incrementada
(raquitismo, tumores seos) aumentan las cifras de fosfatasa alcalina en el plasma al igual que en
todos los trastornos del flujo biliar dentro y fuera del hgado.
La respuesta del hgado a cualquier forma de obstruccin del rbol biliar es sintetizar ms
fosfatasa alcalina. La obstruccin intraheptica del flujo biliar aumenta los niveles sricos de esta
enzima. En neoplasias de las vas biliares se produce un incremento constante y marcado. En
enfermedad parenquimatosa heptica la elevacin es en general muy discreta.
Valores de
referencia:
3
Involucrada en el desarrollo y crecimiento de los huesos por parte de los osteoblastos

Informe: TRABAJO PRCTICO IV

ENZIMAS: ENSAYO CUANTITATIVO
Fecha:
Integrantes:
Datos de la muestra: Suero de (indicar especie)
Concentracin de protenas: mg/mL
a) Curva de calibracin:
Realizar la curva de calibracin a partir de la informacin aportada por la ctedra. (Abs corregida vs.
UI/L). Calcular el factor como la inversa de la pendiente de la recta de calibracin.
b) Variacin de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato

Sustrato, Absorbancia Absorbancia Formacin de Actividad fosfatasa
Tubo
mM 520 nm corregida 1 producto total 2, UI/L alcalina 3, UI/L
1A 0
2B 0
3 2.8
4 5.6
5 11.2
6 16.8
7 22.4
8 25.2
9 28
10C 5.6
11C 28
1
Abs. corregida = Abs. muestra (Abs. blanco reactivos + Abs. blanco muestra)
2
Formacin Producto total = P formado por hidrsis qumica + P formado por hidrlisis enzimtica)
3
Activ. Fosfatasa = Formacin Producto total - P formado por hidrlisis qumica (para cada
concentracin de sustrato)

Ejemplo de clculo de actividad enzimtica empleando el factor:

Formacin de producto UI/L = factor x Abs. corregida
Representar en un mismo grfico hidrlisis qumica e hidrlisis total (hidrlisis qumica +

hidrlisis enzimtica) vs. [S], especificar unidades
Representar actividad fosfatasa alcalina vs. [S], especificar unidades.

Realizar la transformacin lineal 1/V vs. 1/[S]
Calcular los parmetros cinticos: Km y Vmax
Calcular la actividad especfica
Comentarios
Conclusiones

GUA DE AUTOEVALUACIN: ENZIMAS: ENSAYO CUANTITATIVO

1. Cmo se puede analizar cuantitativamente la actividad enzimtica? Mencione y describa las
tcnicas conocidas.
2. A qu se denomina especificidad de la enzima?
3. Por qu se dice que la fosfatasa alcalina tiene baja especificidad?
4. Cmo se determina la actividad de la fosfatasa en este TP?
5. Por qu se denomina fosfatasa alcalina a la enzima de este TP? Cul es el origen del nombre?
6. Cul es el significado clnico de la cuantificacin de esta enzima?
7. Cules son las variables que se necesita contemplar para verificar las condiciones ptimas de
actividad enzimtica?
8. Cmo se relaciona la velocidad de reaccin enzimtica con la concentracin de sustrato?
9. Qu significan las constantes cinticas Km y Vmx? Cmo pueden determinarse?
10. A partir del grfico de la recta de Lineweaver-Burk: (1/V vs. 1/[S]), cmo se pueden determinar
Km y Vmx? Cul es la pendiente de la recta, la ordenada al origen y la abscisa al origen?
11. Sabiendo que el sustrato de la reaccin es el fenilfosfato de sodio, sealar sobre qu unin actuar
la fosfatasa y el tipo de reaccin catalizada.
12. En este trabajo prctico, para qu se necesita un reactivo de color? Cul es?
13. Para qu se necesita un estndar? Cul es?
14. Cul es la temperatura de reaccin en este TP? Por qu considera que es sa?
15. Qu tipo de unidad es UI?
16. A qu se denomina blanco de reactivos? Cmo estar integrado en este TP?
17. A qu se denomina blanco de muestra? Cmo estar integrado en este TP?
18. A qu se denomina blanco de reaccin? Cmo estar integrado en este TP?
19. Qu es la hidrlisis qumica? Por qu es necesario contemplarla en los clculos?

Trabajo Prctico N V:
DETERMINACIN DE UREMIA
Objetivos
Reconocer la funcin de la urea en el metabolismo de las protenas.
Interpretar los datos de uremia en funcin de diferentes patologas veterinarias.
Valorar la utilidad de la determinacin de uremia en el diagnstico Clnico Veterinario.
Marco terico
En la mayora de los animales, el grupo amino de los aminocidos se separa del esqueleto carbonado
para convertirse en urea (Fig. 1), mientras que la cadena carbonada residual se convierte en
importantes intermediarios metablicos como Acetil-CoA, piruvato, intermediarios del ciclo de Krebs,
etc4. De modo que, a partir de stos se puede llegar a la sntesis de lpidos, cuerpos cetnicos, glucosa
y sus derivados u obtener directamente CO2, H2O y energa.
Figura 1: molcula de urea

Formacin de urea
La urea es el principal metabolito de las protenas. Como se muestra en la Fig. 2, la urea se forma en el
citosol celular a partir de amonaco5 a travs de una serie de reacciones que tienen lugar en la
mitocondria y el citosol.
ENZIMAS:
1: Carbamoil-P sintetasa,
2: Ornitina transcarbamoilasa,
3: Arginosuccinato sintetasa,
4: Arginosuccinasa,
5: Arginasa
Figura 2: Ciclo de la urea
4
Los peces pueden eliminar amonaco directamente y las aves lo convierten en cido rico.
5
El mecanismo de formacin de urea fue descubierto en 1932 por Hans Adolf Krebs, premio Nobel por el descubrimiento
de la Coenzima-A y el Ciclo de Krebs.
44 TP V. Determinacin de Uremia Medicina Veterinaria

El amoniaco es una molcula formada por la degradacin de compuestos nitrogenados, extrayendo el

grupo amino a travs de reacciones de desaminacin. El amoniaco se combina con bicarbonato (HCO3-)
para la formacin de carbamilfosfato, la molcula que dar lugar al comienzo del ciclo de la urea.
El carbamilfosfato reacciona con la ornitina para transferir su grupo carbamilo y dar lugar a la citrulina,
realizndose la catlisis enzimtica por medio de la Ornitina transcarbamilasa (2).
La citrulina se transporta al citoplasma celular, donde se condensar con el aspartato y, por medio de la
Argininsuccinato sintetasa (3) formar argininsuccinato. Este producto a su vez se hidrolizar gracias a
la argininsuccinasa (4) para dar arginina y fumarato (ste ltimo servir como intermediario metablico
en otras rutas principales, como el ciclo de Krebs o la gluconeognesis tras oxidarse en oxalacetato).
La arginina sufrir una hidrlisis (catalizada por la arginasa (5)), de modo que se formarn dos
productos, la ornitina y la urea, cerrndose el ciclo.
La urea es el principal producto del catabolismo del nitrgeno.
Del total del aporte nutricional, el 95% del nitrgeno se excreta por orina y el 5% restante lo hace por
heces. Para aquellos animales cuyas dietas son ricas en protenas, la urea sintetizada en el hgado y
depurada por los riones constituye el 80-90% del nitrgeno excretado.
Como producto del metabolismo extraheptico tambin se genera amonaco, siendo su exceso
transportado al hgado para ser convertido en urea y posteriormente eliminado por va renal.
La concentracin de urea depende de la relacin entre la produccin de urea (ingestin y catabolismo
proteico) y su excrecin. Los valores normales de urea oscilan dependiendo del animal que se trate,
entre 0,10 y 0,40 g/L de plasma o suero y del tipo de animal. Las variaciones en la ingesta proteica
pueden causar oscilaciones en los valores normales, que las condiciones de ayuno para la toma de
muestra no pueden eliminar. Otro factor importante a tener en cuenta en este sentido, son las
variaciones en el volumen de orina, que a su vez depende de la cantidad de lquidos ingeridos por el
animal.
Los trastornos metablicos en el ciclo de la urea producen intoxicacin por amonaco. Los
sntomas ms importantes incluyen: vmitos, ataxia, irritabilidad, letargo, y retraso mental (en caso de
humanos).
Significacin clnica de la determinacin de uremia.
Una elevacin de la concentracin srica de urea, se interpreta generalmente como una posible
disfuncin renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de que los valores sricos de urea se
encuentran ntimamente relacionados con la dieta y el metabolismo proteico, por lo que cualquier
alteracin en estas variables se traducir en un cambio de la concentracin de urea en suero.
Mtodo enzimtico especfico para la determinacin cuantitativa de urea en sangre
Fundamentos del mtodo

El mtodo enzimtico que utiliza la enzima ureasa es especfico para la determinacin cuantitativa de
urea en sangre y orina. La ureasa descompone especficamente a la urea produciendo dixido de
carbono y amonaco. ste reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito de sodio (NaClO)
para dar indofenol de color verde, que se determina colorimtricamente a 570 nm.
H2N
ureasa
C=O + H20 2 NH3 + CO2
NH2
NH3 + hipoclorito y salicilato indofenol (verde)

Reactivos
Reactivo A: solucin concentrada conteniendo buffer fosfato 200 mmol/L, cido saliclico 750
mmol/L, nitroprusiato de sodio 20 mmol/L y EDTA 10 mmol/L
Reactivo B: solucin concentrada de hipoclorito de sodio 10 mmol/L en hidrxido de sodio 0,1
mol/L.
Reactivo C: ureasa 75 U/mL en solucin glicerinada.
Standard: solucin de urea 0,60 g/L (28,04 mg/dL de BUN).6
Preparacin de los reactivos:
Reactivo A: mezclar 1 parte del reactivo A con 4 partes de agua destilada.
Reactivo B: mezclar 1 parte del reactivo B con 4 partes de agua destilada.
Reactivo C: mezclar 1 parte del reactivo C con 4 partes de agua destilada.
Reactivo A + C: mezclar 100 mL del reactivo A con 4 mL del reactivo C.
Precauciones
Los reactivos son para utilizar guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de
anlisis clnicos.
Valores de Blanco superiores a 0,150 unidades de Absorbancia son indicio de deterioro de los
reactivos. En tal caso desechar.
Muestra: Suero, plasma u orina
a) Recoleccin: obtener de la manera usual.
b) Aditivos: en caso de que la muestra a usar sea plasma se recomienda el uso de Anticoagulante W
de Wiener lab (solucin equilibrada de sales sdicas y potsicas de EDTA (0,342 mol/L) pH 7,2)
c) Sustancias interferentes conocidas:
- Los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la accin de la ureasa.
- La hemlisis intensa puede producir resultados falsamente elevados que no sobrepasan el 5%. Esta
interferencia puede corregirse con un Blanco de suero.
- No se observan interferencias por hemlisis ligeras o moderadas y bilirrubina hasta 400 mg/L.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la urea en suero o plasma es estable varios das
en refrigerador o 6 meses en congelador, sin agregado de conservantes.
- Longitud de onda: 570 nm
- Temperatura de reaccin: 37C
- Volumen de reaccin: 2 mL
- Volumen de muestra: 10 L
Procedimiento experimental para determinar uremia

Standard solucin de urea 0,60 g/L.
1. Diluir el estndar de acuerdo a las especificaciones de la tabla y calcular la masa de Urea.
Tubo Estndar urea 0,60 g/L Agua destilada [Urea], g/L BUN, mg/dL
(28,01 mg/dL de BUN)
S1 1000 L 0 L
S2 800 L 200 L
S3 600 L 400 L
S4 400 L 600 L
S5 200 L 800 L
S6 100 L 900 L
6
BUN: sigla en ingls de Nitrgeno Ureico en Sangre. El valor normal es de 7 a 20 mg/dL

2. Rotular 7 tubos: B (blanco de reaccin) y S1 a S6 (diluciones del estndar de la tabla anterior).
B S1 S2 S3 S4 S5 S6
Standard 0 L 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L
Reactivo A+C 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Mezclar. Incubar 5 minutos a 37C.
Reactivo B 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Leer Absorbancia en espectrofotmetro a 570 nm
Absorbancia
b) Determinacin de uremia
En tubos marcados B (Blanco), y T1, T2, (diluciones del suero), colocar
B T1 T2
Suero - 5 L 10 L
Agua destilada - 5 L -
Reactivo A+C 1 mL 1 mL 1 mL
Reactivo B 1 mL 1 mL 1 mL
Leer Absorbancia en espectrofotmetro a 570 nm
Absorbancia
Estabilidad de la mezcla de reaccin final

El color de la reaccin es estable durante 2 horas por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de ese
lapso.
Clculo de los resultados
El BUN es la urea plasmtica dividida por 2,14. Esto proviene de contemplar que la urea (PM: 60)
tiene dos tomos de nitrgeno (PA del N: 14,0067). Por lo tanto, haciendo la relacin urea/nitrgeno,
se obtiene 60/28,01=2,14.
Para convertir un resultado de BUN en mg/dL a un resultado de urea en mmol/L, hay que multiplicar
el resultado de BUN por 0,357.
Para convertir un resultado de urea en mmol/L a mg/dL, hay que multiplicar el resultado en mmol/L
por 6.
Para convertir un resultado de urea en mg/dL a g/L, hay que dividir el resultado en mg/dL por 100.
Masa de Urea (g) = Abs x f

Abs: absorbancia corregida de la muestra en la que se determin la uremia
f: factor que se calcula a partir de la curva de calibrado (inversa de la pendiente)

[Urea] = Calcular a partir de la masa de urea obtenida en el volumen de suero empleado, expresar
en g/L
BUN = Calcular a partir de la [urea], expresar en mg/dL BUN
Valores de referencia:

Informe: TRABAJO PRCTICO V. DETERMINACIN DE UREMIA

Fecha:
Integrantes:
Datos de la muestra: Suero de ..(indicar especie)
Realizar la curva de calibracin a partir de la informacin aportada por la ctedra. Indicar
las unidades de los ejes de abscisas y ordenada.
Tubo Estndar urea 0,60 g/L Agua Concentracin BUN, mg/dL

(28,01 mg/dL de BUN) destilada urea, g/L
B 0 1000 L
S1 1000 L 0 L
S2 800 L 200 L
S3 600 L 400 L
S4 400 L 600 L
S5 200 L 800 L
S6 100 L 900 L
Tubo Estndar Masa urea Absorbancia Absorbancia

(g) corregida
B 0 L
S1 10 L
S2 10 L
S3 10 L
S4 10 L
S5 10 L
S6 10 L
Calcular el factor (f) como la

inversa de la pendiente de la
recta de calibracin, indicar
unidades.
factor (f) =

b) Cuantificacin colorimtrica
Absorbancia Absorbancia Masa de urea Concentracin BUN, mg/dL

corregida en tubo (g) urea (g/L)
Blanco
T1
T2
c) Clculo de los resultados
Uremia (g/L) =
Conversin de unidades al sistema SI
1. Calcular la uremia, expresada en mmol/L
Urea (mmol/L) =
2. Expresar la uremia como BUN (mg/dL) =

GUA DE AUTOEVALUACIN: TP V Determinacin de uremia

(Entregar con el Informe del TP)
1. Justifique la obtencin de urea a partir de los aminocidos.
2. Indique el rgano en el cual se sintetiza la urea y cmo se elimina.
3. Cul es la significancia de dosar el nivel srico de urea (uremia)?
4. Niveles altos de urea, que consecuencias metablicas pueden ocasionar?
5. Cul es el mtodo que se utiliza en el TP para dosar urea en sangre?
6. Cul es el fundamento de la reaccin?
7. Cmo est constituido el blanco de reactivos de la experiencia?
8. Qu precauciones deben tenerse en la obtencin de la muestra?
9. Explique los clculos matemticos que justifican la siguientes afirmaciones:
a) Para convertir un resultado de BUN en mg/dL a un resultado de urea en mmol/L, hay
que multiplicar el resultado de BUN por 0,357.
b) Para convertir un resultado de urea en mmol/L a mg/dL, hay que multiplicar el
resultado en mmol/L por 6.
10. Describa los esquemas que observa a continuacin
a)
b)

Trabajo Prctico N VI:

DETERMINACIN DE CREATININA EN SANGRE
Objetivos
Reconocer la funcin de la creatinina en el metabolismo muscular.
Interpretar los datos de creatinina en funcin de diferentes patologas veterinarias.
Valorar la utilidad de la cuantificacin de la urea y la creatinina en el diagnstico Clnico
Veterinario.
Marco terico
La creatina es elaborada en el organismo a partir de los aminocidos glicina, arginina y metionina,
principalmente en el hgado, los riones y el pncreas. De all es transportada en el torrente sanguneo
a todas las clulas del cuerpo. Ya que la creatina participa en todos los procesos que requieren energa,
las clulas musculares, cerebrales y nerviosas contienen mucha creatina.
La creatinina (Fig. 1) es un compuesto orgnico generado a partir de la degradacin de la creatina. Es
un producto de desecho del metabolismo normal de los msculos que usualmente es producida por el
cuerpo en una tasa muy constante (dependiendo de la masa de los msculos), y normalmente filtrada
por los riones y excretada en la orina.
La creatinina se filtra libremente a travs del rin y no se reabsorbe, por lo que refleja
la capacidad del rin para llevar a cabo el proceso de eliminacin. La cuantificacin
de la creatinina es la manera ms simple de monitorear la correcta funcin de los
riones.
Figura 1: Estructura qumica de la creatinina
La creatinina se forma en msculo a partir del fosfato de creatina por una deshidratacin no enzimtica
para formar su amida cclica y prdida del fosfato. La creatinina se transporta desde los msculos por
medio de la sangre hacia el rin (Fig.
2 y Fig. 3). Los riones filtran la
mayora de la creatinina y la eliminan
en la orina.
Figura 2: Sntesis y eliminacin de la

creatinina.
52 TP VI. Determinacin de Creatinina Medicina Veterinaria

Figura 3: Eliminacin de productos finales del metabolismo nitrogenado
Significacin clnica de la determinacin de creatinina.

La creatinina, compuesto sumamente difusible, se elimina del organismo casi exclusivamente por
filtracin renal. Su determinacin en suero constituye un parmetro importante para el diagnstico de
diversas afecciones renales.
Junto con la cuantificacin de uremia, la determinacin de creatinina resulta importante tanto en el
diagnstico como en el pronstico de nefropatas, obstrucciones urinarias (por afecciones de prstata,
vejiga, urter) y anurias reflejas (secundarias a clculos uretrales, por ejemplo) que pueden producir
elevaciones de creatinina, reversibles luego de reparada la afeccin.
La creatinina est aumentada tambin en presencia de enfermedades musculares severas incluyendo la
distrofia muscular, atrofia y miositis. En el hipertiroidismo, tambin est aumentada, esto puede
atribuirse a la atrofia muscular que se observa en esta enfermedad.
Mtodo colorimtrico para la determinacin cuantitativa de creatinina en sangre
Fundamentos del mtodo (Reaccin de Jaff)

La creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa desproteinizacin con
cido pcrico, obtenindose un cromgeno que se mide a 510 nm.
El uso de cido pcrico como desproteinizante elimina los cromgenos no creatinina disminuyendo al
mnimo las interferencias. La acidez del medio impide la prdida de creatinina por sobre las protenas
precipitadas. La reaccin de color final est tamponada a su pH ptimo y sigue la ley de Beer hasta 40
mg/L.

Reactivos
Reactivo 1: cido pcrico 41,4 mmol/L.
Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/L, pH final 12,4.
Standard: solucin de creatinina 20 mg/L.
Precauciones
Los reactivos son para utilizar guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de
anlisis clnicos. El reactivo 2 es custico.
Muestra: Suero, plasma u orina

a) Recoleccin: obtener de la manera usual.
b) Aditivos: no se requieren. Se recomienda no usar plasma.
c) Sustancias interferentes conocidas: hemlisis ligera a moderada no interfiere, pero no debe
emplearse sangre total ya que aproximadamente el 60% del material Jaffe-reactivo de los eritrocitos no
es creatinina.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: es conveniente utilizar el suero recin obtenido.
Si esto no es posible puede mantenerse hasta 24 horas en refrigerador (2-10C) sin variaciones de los
resultados.
- Longitud de onda: 510 nm en espectrofotmetro
- Temperatura de reaccin: temperatura ambiente, que no debe exceder los lmites de 15 y 30C.
- Volumen de muestra: 0,7 mL
- Volumen final de reaccin: 3,5 mL
Procedimiento Experimental
Standard solucin de creatinina 20 mg/L.
1. Rotular 5 tubos: B (blanco) 7 y S1 a S4 (diluciones del standard).
B S1 S2 S3 S4
Standard - 0,25 mL 0,50 mL 0,75 mL 1 mL
(creatinina 20 mg/L)
Agua destilada 1 mL 0,75 mL 0,50 mL 0,25 mL -
Reactivo 1 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Reactivo 2 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Mezclar por inversin. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Leer en espectrofotmetro a 510 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada.
Absorbancia
b) Desproteinizacin del suero

A 0,70 mL de suero agregar 3,5 ml de Reactivo 1. Mezclar por inversin.
Dejar reposar 10 minutos y centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos como mnimo.8
7
B es el blanco de reactivos.
8
Luego de la desproteinizacin del suero con Reactivo 1 pueden observarse partculas en el sobrenadante, las
que no interfieren en la reaccin.

c) Determinacin de creatinina en suero desproteinizado

En tubos marcados B (Blanco) y T (suero), colocar:
B T1 T2
Suero desproteinizado - 1 mL 2 mL
Agua destilada 1 mL 2 mL 1 mL
Reactivo 1 2 mL - -
Reactivo 2 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Mezclar por inversin. Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Leer en espectrofotmetro a 510 nm, llevando el aparato a cero con agua destilada.
Absorbancia
Estabilidad de la mezcla de reaccin final

El color de la reaccin es estable durante 10 minutos por lo que la absorbancia debe ser leda dentro de
ese lapso. El Blanco y el Standard pueden leerse hasta los 60 minutos.
Clculo de los resultados
Corregir las lecturas de las diluciones del estndar S y del suero T restndoles el Blanco (B).
Creatinina en suero (mg/L) = Abs x f f: factor que se calcula a partir de la curva de calibrado (es la
inversa de la pendiente)
Abs: absorbancia de la muestra en la que se desea determinar
creatinina
Valores de referencia:

GUA DE AUTOEVALUACIN: TP VI Determinacin de creatinina en sangre

(Entregar con el Informe del TP)
1. A travs de esquemas, explique cmo y dnde se sintetiza la creatinina. Cules son los
metabolitos involucrados en dicha sntesis y cules las enzimas.
2. Cul es la significancia clnica de la determinacin de creatinina?
3. Cules son los factores que determinan la concentracin normal de creatinina?
4. Por qu los valores normales de creatinina de un perro pequins difieren de los de un
equino?
5. Cul es el fundamento del mtodo usado en el trabajo prctico?
6. Al tratar la muestra con cido pcrico, qu se logra? Cul es la importancia de hacerlo?
7. Por qu razn en los tubos de reaccin se colocan cantidades distintas de muestra y de
estandard?
8. Cmo estn constituidos los blancos de la experiencia? Describa cada uno de ellos.
9. Qu relacin puede hacerse entre hallazgos de valores anormales de urea y de creatinina?

Informe:
TRABAJO PRCTICO VI. DETERMINACIN DE CREATININA EN SANGRE
Fecha:
Integrantes:
Datos de la muestra: Suero . (indicar especie)
Realizar la curva de calibracin a partir de la informacin aportada por la ctedra. Indicar las
unidades de los ejes de abscisas y ordenada.
Calcular el factor (f) como la inversa de la pendiente de la recta de calibracin
b) Cuantificacin colorimtrica de creatinina

Calcular la masa de creatinina en los tubos empleando el factor y por extrapolacin en la
curva de calibracin. Analizar y comparar resultados.
Absorbancia Absorbancia Vol. suero Masa de creatinina en tubo (mg)

corregida desproteinizado con factor por extrapolacin
T1
T2

c) Determinacin de concentracin de creatinina (mg/dL) en las muestras incgnitas:

Ejemplo de clculo:
Especie:
Tubo T1: Volumen de suero desproteinizado:

Volumen de suero:
Masa de creatinina en el tubo T1 (mg):

Clculo de concentracin de Creatinina (mg/dL) =
Tubo T2: Volumen de suero desproteinizado:
Volumen de suero:
Masa de creatinina en el tubo T1 (mg):

Clculo de concentracin de Creatinina (mg/dL) =
Informar concentracin promedio (si corresponde) de creatinina en suero en mg/dL:
d) Conversin de unidades al sistema SI

Calcular la concentracin de creatinina en suero, expresada en mmol/L
Creatinina (mmol/L) =
Indicar clculos realizados y unidades empleadas:
e) Discusin de resultados y conclusiones

Guia TP QBiol Veterinaria, UNRN 2016

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SEDE ALTO VALLE Y VALLE MEDIO

RESPONSABLE DE CTEDRA: Prof. Dra. MARTA S. AGERO

La presente gua de Trabajos Prcticos pretende apoyar el aprendizaje de la Qumica Biolgica a

- Desarrollar en el estudiante la capacidad de trabajar en el laboratorio, formndolo en las

- Desarrollar la capacidad de anlisis de problemas experimentales, planteo de hiptesis y

- Adquirir el lenguaje y terminologas propias de la asignatura, capacitando al estudiante en la

ALGUNAS REGLAS BSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD

Las medidas de seguridad en laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a

La radiacin o energa radiante se puede describir por su:

3 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Naturaleza corpuscular: Compuesta de pequeos paquetes de energa (E) denominados cuantos

Figura 1: Espectro de absorcin del NAD+ y del

4 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas capaces de

A = log (I0 / IT)

5 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Si reemplazamos en la frmula de absorbancia y expresamos b en cm y c en concentracin

Figura 4: Esquema de los componentes de un Monocromador

Determinacin de la concentracin de una sustancia por espectrofotometra

6 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

7 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Figura 5: Curva de calibracin. Representacin de Absorbancia corregida en funcin de la

8 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

KMnO4 Agua destilada Concentracin

9 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Determinacin instrumental de la relacin entre concentracin y absorbancia:

10 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Informe Trabajo Prctico I:

Anlisis instrumental de la relacin entre color y concentracin

11 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

3. Determinacin de los parmetros de la recta de calibracin:

GUA DE AUTOEVALUACIN: ESPECTROFOTOMETRA

12 TP I. Espectrofotometra Medicina Veterinaria

Objetivos de los Anlisis Bioqumicos en Clnica Mdica Veterinaria

13 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

14 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

15 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

16 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

transaminasa (GPT), creatn-quinasa (CK), -glutamil-transferasa (-GT), lctico-deshidrogenasa

17 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

18 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

19 Objetivos Anlisis Bioqumicos Medicina Veterinaria

Trabajo Prctico N II:

20 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

FUNDAMENTOS DEL MTODO COLORIMTRICO

Complejo protena-Cu (II):

21 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

A.- Determinacin de Protenas Totales (PT)

Estndar de Albmina y globulinas H2O destilada Concentracin

Estndar de Albmina y globulinas H2O destilada Abs 540 nm

22 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

Estndar de Albmina y globulinas H2O

23 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

24 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

Informe: TRABAJO PRCTICO N II

Dosaje de Protenas Totales:

Estndar de Albmina y globulinas

Ejemplo de Clculo de masa de Protena/tubo para un tubo de estndar:

Grfico de Calibracin: Absorbancia

25 TP II. Determinacin de Protenas y Albmina en suero Medicina Veterinaria

Determinacin de los parmetros de la recta de calibracin:

Tubo N 7 Volumen de muestra:

Clculo de concentracin de Protenas Totales (g prot/dL)