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a secrecin de hormonas tiroideas est mediada directamente por

mecanismos de regulacin del hipotlamo. Cuando el organismo se ve en la


necesidad de aumentar los niveles de hormonas tiroideas, el hipotlamo
enva seales neuroendocrinas a la adenohipofisis induciendo la secrecin
de TSH, dicha hormona viaja por el torrente sanguneo hasta la tiroides,
donde provoca la secrecin de T3 y T4 al organismo. Es importante saber los
mtodos para medir los niveles de dichas hormonas en la sangre, ya que
esto puede servir de diagnostico de enfermedades y trastornos
hormonales(3).
Las hormonas tiroideas se determinan mediante mtodos de ELISA (Ensayo
de inmunoabsorcin ligado a enzimas, por sus siglas en ingles), el cual
consiste en el uso de antgeno y anticuerpos marcados con una enzima de
forma que el complejo antgeno-anticuerpo tenga actividad inmunolgica y
enzimtica. Dicho complejo quedar inmovilizado por un substrato, y
gracias a la accin de la enzima sobre el substrato, producir un color que
lograremos ver mediante la colorimetra (1).

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IMAGEN 1: Representacin de algunos mtodos ELISA

A continuacin sealaremos los mtodos que se utilizan para determinar las


hormonas tiroideas en sangre.
TSH
La liberacin de TSH en la adenohipfisis es regulada por una hormona TSH-
libre (TRH) producida por el hipotlamo. Aunque la concentracin de TSH en
sangre es extremadamente baja, sta es esencial para el mantenimiento de
la funcin tiroidea normal. La secrecin de TSH est mediada por
mecanismos de retroalimentacin negativa (2).
"La tcnica que se utiliza para determinar la concentracin de TSH srico es
de ELISA tipo sndwich. Debe su nombre al mtodo donde el antgeno (TSH)
va a interactuar con un anticuerpo especfico donde se va a fijar, y luego
otro anticuerpo, unido a una enzima, se conjuga al antgeno " (2). Con ms
detalle, este procedimiento consta de los siguientes pasos (2):

1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente


patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados
deficientemente o no fijados
2. Adicin de la muestra problema (sangre del paciente), de tal forma
que la TSH presente reaccione especficamente con los anticuerpos
fijados al soporte.
3. Adicin de anticuerpos especficos para la TSH conjugados con una
enzima, los cuales reaccionan con los antgenos (TSH) conjugados con
los otros anticuerpos.
4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora.
5. Lectura visual o colorimetra del producto fina.
Tiroxina (T4)
La tiroides segrega mayores concentraciones de hormonas tiroideas en
forma de T4 que de T3, a pesar de que esta ltima es la forma ms activa
de las dos. Por esto, T4 se convierte en T3 dentro de la clula. La tiroxina,
por ser una hormona esteroidea, y por lo tanto, con carcter hidrofbico, se
transporta dentro de la sangre mediante protenas transportadoras, y pocas
concentraciones estn en forma libre (0,03%) (3).
Por lo dicho anteriormente, la tiroxina se mide en forma de T4-Total, que
engloba tanto la Tiroxina Ligada a las Protenas, como la Tiroxina Libre (3).
Igualmente se puede medir en su forma libre, pero necesita de una
medicin ms sutil debido a las bajas concentraciones de esta en la sangre
(3).
La tcnica utilizada es de ELISA de tipo competitivo. Consta de los
siguientes pasos (1):

1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos de T4. Lavado


para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin en concentraciones conocidas de una mezcla de antgenos
(T4) del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una
enzima y antgenos desconocidos objeto del estudio. Paralelamente,
aadir nicamente antgenos del anticuerpo usando en el paso
anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos
que no hayan reaccionado.
3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora.
4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados.
Triyodotironina (T3)
Tambin, como en el caso de la Tiroxina, La Triyodotironina se encuentra en
sangre ligada a la globulina TBG (protena transportadora) y tambin en
este caso en una proporcin igualmente elevada (99.7%), circulando en
forma libre solo el 0.3 %. Realmente esta ltima es la fraccin hormonal
realmente activa (3).
La valoracin analtica de la T3 no es mucho ms compleja que la de la T4L
y se realiza por los mismos mtodos. La cuanta de esta hormona en sangre
es mucho mas baja que la de T4 y los tcnicas analticas son algo mas
imprecisas que las e valoracin de T4 o T4L. La valoracin de la T3 Libre es
bastante compleja y en la prctica se realiza solamente en centros de
investigacin (2).
"La valoracin de T3 en sangre puede no ser imprescindible y muchas veces
no se solicita, pero es la nica forma de descubrir lo que se denomina -
Hipertiroidismo-T3 - que es una forma muy poco frecuente de
Hipertiroidismo en el que slo hay elevacin de esta hormona " (1).
La tcnica utilizada es de ELISA de tipo competitivo. Similar a la utilizada
con la Tiroxina (T4) . Consta igualmente de los siguientes pasos (1):

1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos de T3. Lavado


para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
2. Adicin en concentraciones conocidas de una mezcla de antgenos
(T3) del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una
enzima y antgenos desconocidos objeto del estudio. Paralelamente,
aadir nicamente antgenos del anticuerpo usando en el paso
anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos
que no hayan reaccionado.
3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora.
4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas
pruebas y comparar los resultados.

5. Valores sanguneos de triyodotironina y tiroxina en


vacas
frisn negro a pastoreo
6. Blood values of thyroxine and triiodothyronine in
grazing
Friesian cows
7. P. A. CONTRERAS, M.V., M.PHIL.; F. WITTWER, M.V., M.V.Sc.; V. RUIZ, M.V.;
A. ROBLES, M.V.;
8. H. BRHMWALD, T.M.
9. Instituto de Ciencias Clnicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile,
Casilla 567, Valdivia, Chile.
10. SUMMARY
11. In order to establish the plasma thyroid hormones concentrations in grazing
Frisian cows, 110 blood samples were analysed for tri-iodothyronine (T3)
and thyroxine (T4). Samples were selected from dairy herds that requested
the university's metabolic profile service and were restricted to those which
presented no abnormalities in blood composition.
12. Blood samples were obtained from early lactation (n=55) and late
pregnancy (n=55) cows. Plasma values of T3 and T4 were determined by
radioimmunoassay technique using the commercial kit Coat-A-Count total T3
and Coat-A-Count total T4 for T3 and T4 respectively. Significance among
the means of different groups were determined using the Student's t test
(p<0.05), with a 95% confidence interval.
13. The mean (S.D.) plasma T3 value was 1.400.43 nmol/L, similar to those
in the literature. Lactating cows had higher T3 values (1.540.43 nmol/L)
than late pregnancy cows (1.250.37 nmol/L) (p<0.05). T4 values
(meanS.D.) were 41.011.6 nmol/L, with no differences between lactating
and pregnant cows. These values were lower than the reference values given
in the literature.
14. It is concluded that it is possible to measure T3 and T4 in cows using the
RIA technique and the values obtained can be used as reference values.
Allowance for differences due to physiological condition, may have to be
made.
15. Palabras claves: Tiroxina, Triyodotironina, concentraciones plasmaticas,
vacas, pastoreo.
16. Key words: Thyroxine, Triiodothyronine, plasmatic concentrations, grazing
cows.
17. INTRODUCCION
18. Las hormonas que secreta la glndula Tiroides son Tiroxina (T4),
Triyodotironina (T3), y la Calcitonina (Hedge y col., 1987). T3 y T4 se unen
en la sangre a prealbminas, albminas y especialmente a la globulina
transportadora de tiroxina, siendo liberadas al alcanzar las clulas tisulares
(Guyton,1994). No todos los tejidos responden con igual intensidad a los
estmulos tirodeos, esta variacin est relacionada al nmero de receptores
presentes en el DNA celular. T4 se une a ellos diez a veinte veces menos que
T3, por ello a nivel celular la hormona tirodea propiamente tal es T3
(Silva,1984). Frandson y Spurgeon (1995) establecen que T4 puede ser
activa, pero que comenzara a actuar con ms lentitud que T3. Un gran
porcentaje de T4 se excreta va fecal y otra fraccin se metaboliza a cido
tetrayodoactico, el cual tendra bajo poder biolgico (Ingbar y Braverman,
1975).
19. Las funciones de T4 son aumentar el metabolismo celular, el nmero de
mitocondrias, la sntesis de ATP (Hedge y col., 1987; Cunningham,
1992; Guyton, 1994). En relacin al metabolismo energtico T3 y T4
promueven la absorcin de glucosa, la gliclisis, la gluconeognesis, la
secrecin de insulina y la liplisis (Cunningham, 1992;Guyton, 1994).
Adems estimulan y regulan la cantidad de receptores adrenrgicos (Lewis
y Lefkowitzt, 1977;Cunningham, 1992; Guyton, 1994).
20. En bovinos, por la dificultad analtica para medir T3, las concentraciones
sanguneas de T4 se han utilizado para evaluar la actividad tirodea (Blum y
col., 1979). Posteriormente Burton (1992) mide en bovinos las
concentraciones sanguneas de T3 y T4, observando valores en el rango de
0.8 - 1.9 nmol/l y de 57 - 129 nmol/l respectivamente.
21. En humanos, bovinos y otras especies, durante el ltimo tercio de la
gestacin, las hormonas tirodeas presentan concentraciones mayores a los
valores habituales (Heitzman y Mallinson, 1972; Hart y col., 1978;Weeke,
1983). Cowie y col. (1980), sealan que las hormonas tirodeas son
galactopoyeticas, por ello diversos autores indican que al inicio de la
lactancia en vacas, las concentraciones plasmticas de T4 estn disminuidas
(Mixner y col., 1962, Heitzman y Mallinson, 1972; Vanjonack y Johnson
1975, Magdub y Johnson, 1977;Thilstead, 1985). Tambin el balance
energtico negativo y la hipomagnesemia se asocian a disminucin de las
concentraciones de T4 y T3 (Heizman y Mallison, 1972; Kunz y col.,
1985; Nikolic y col., 1997; Mullei y Daniel, 1988).
22. En consideracin a la alta frecuencia de presentacin de balances
energticos negativos e hipomagnesemia que afectan a los rebaos bovinos
del sur de Chile (Wittwer y col., 1987; Contreras y col., 1996), y a la falta de
antecedentes sobre las concentraciones de las hormonas Tiroxina (T4) y
Triyodotironina (T3) en vacas de rebaos lecheros a pastoreo, es
conveniente establecer las concentraciones sanguneas de ambas hormonas
en vacas al inicio de la lactancia y en el tercio final de la gestacin.
23. MATERIAL Y METODO
24. Animales seleccionados. Se seleccionaron 110 muestras de sangre de vacas
Frison Negro Chileno, clnicamente sanas y cuya condicin corporal fue de 2-
3 (escala 1-5), provenientes de rebaos lecheros que solicitaron el servicio
de perfil metablico al Laboratorio de Patologa Clnica Veterinaria de la
Universidad Austral de Chile, y que no presentaban desequilibrios en la
concentracin de metabolitos. De las muestras seleccionadas 55 pertenecan
a igual nmero de vacas al inicio de lactancia y 55 a igual nmero de vacas
en el perodo final de gestacin.
25. Alimentacin y manejo. Los rebaos correspondan, en proporcin
semejante, a aquellos con lactancias de primavera-verano y lactancias de
otoo-invierno, con producciones lecheras que variaban entre 4.500 - 6.500
litros de leche por lactancia. La alimentacin preferente era en base a
pastoreo sobre pradera natural fertilizada, asociada a alimentos conservados
(heno o ensilaje de las mismas praderas), concentrados y sales minerales
comerciales. Variando el recurso forrajero, ms gravitante en la racin, de
acuerdo a las disponibilidades de forraje de la pradera.
26. Muestras de sangre y anlisis de T3 y T4. Las muestras de sangre se
obtuvieron por puncin yugular o coccgea en tubos heparinizados. El plasma
obtenido por centrifugacin se mantuvo a -20 C hasta el anlisis. Las
concentraciones de T3 y T4 se midieron por radioinmunoensayo, RIA,
utilizando el test diagnstico Coat-a-Count total T3 para Triyodotironina y
Coat-a-Count total T4 para Tiroxina (Diagnostic Products Corporation,
DPCR). La tcnica de RIA se realiz en duplicado, de acuerdo a las
indicaciones dadas por el fabricante, empleando un contador gamma (Mini
Instrument Ltd. USA.
Modelo 6-20) y confeccionando la curva de calibracin mediante estndares
aportados por el mismo fabricante. La precisin intraensayo del mtodo,
establecida con 10 medidas de un mismo suero de valor medio, fue de 5.2%
y 4.5% para T3 y T4 respectivamente, mientras que la precisin interensayo
de muestras analizadas en 8 ensayos fue de 6.8% y 6.1% respectivamente.
Como control de exactitud se emple un suero control de valor conocido,
permitindose un error < 2D.E.
27. Anlisis estadstico. Establecida la normalidad de los datos se determin el
promedio y la desviacin estndar (D.E.) por grupos y la significancia de las
diferencias se estableci por el test de "t" de Student, considerndose
significativo un valor de p<0.05, para lo cual se us el programa
computacional Graph-Pad-Prism, versin 2.0, 1995.
28. RESULTADOS Y DISCUSION
29. En el total de vacas la concentracin promedio de T3 fue 1.400.43 nmol/l,
lo que se encuentra en el rango de referencia. La de T4 fue 41.111.64
nmol/l, que es inferior al rango de referencia de 57-119 nmol/l obtenido con
el mismo mtodo y condiciones analticas (Burton, 1992) (cuadro 1).
30.

CUADRO 1. Promedios (D.E.) de las concentraciones plasmticas de T3 y T4 en vacas


Frison Negro a pastoreo al final de gestacin y en el inicio de la lactancia.

Mean ( S.D.) of plasma T3 and T4 concentrations in Frisian cows at pasture during early lactation and late pregnancy.

Hormonas Rango Total Vacas Valores Vacas Vacas


Valores
lactancia
Referencia* Sobre Gestantes
Bajo el (nmol/l)
el
(nmol/l) (nmol/l) rango rango (nmol/l)

T3 0.80 - 1.90 1.4 0.43 5.50% 1.54 1.25


6.40% 0.43a 0.37b

T4 57 - 119 41.1 11.6 0.0% 40.1 42.07
69.1% 10.8 12.4

Letras distintas en la fila sealan diferencias significativas (P<0.05)


* Burton, 1992.
31. Nikolic y col. (1997) describen concentraciones disminuidas de T4 y un
comportamiento variable de T3 en vacas aparentemente eutirodeas al inicio
de la lactancia, independiente del balance energtico del animal. Esos
resultados son coincidentes con los obtenidos, ya que los niveles plasmticos
de T4 estuvieron deprimidos en vacas gestantes y al inicio de la lactancia.
32. De acuerdo a lo planteado por Pineda (1984, 1989), y con los niveles
plasmticos de las hormonas tirodeas observadas, se podra considerar a
estos animales con hipotiroidismo subclnico, y como T3 es la mayor
responsable de las funciones del tiroides a nivel celular, clnicamente no
existiran indicios de una alteracin glandular. En hipotiroidismo subclnico se
observan concentraciones sanguneas disminudas de T4 libre, T3 reversa
(rT3) inalterada y Tirotropina (TSH) aumentada (Silva, 1985). En este
estudio no se midi rT3 ni TSH, por ello no es posible sostener un
hipotiroidismo subclnico. Frandson y Spurgeon (1995) y Cunningham
(1992), sealan que en animales, a diferencia del humano, existen varias
protenas plasmticas de unin para el transporte de las hormonas. Por
ejemplo, dependiendo de la especie, T4 se une a la albmina y a dos o tres
fracciones diferentes de - globulinas, sin embargo, T3 se une a albmina y
a una fraccin de -globulina. Por lo cual, factores que modifiquen la
concentracin de estas globulinas pueden alterar la concentracin de T4
total, sin alterar la de T4 libre.
33. Sarne y DeGroot (1989) sostienen que el hipotiroidismo puede ser primario,
por bajo contenido de yodo en la dieta o secundario, por consumo de
agentes bociogenos como tiocianatos e isotiocianatos presentes en las
crucferas, los cuales inhiben la captacin de yodo, o el consumo de maz o
papas, que contienen glucsidos cianognicos. Es de importancia considerar
estos factores, ya que la alimentacin de vacas de lechera en el sur de Chile
frecuentemente incluye diversos alimentos como el maz (concentrado y
forraje), coles forrajeras, afrecho de raps (crucferas) y tambin en algunos
casos papas.
34. Los promedios de T3 en vacas en lactancia (1.540.43 nmol/l) fueron
mayores (p<0.05) a los de vacas en gestacin (1.250.37 nmol/l), mientras
que en T4 no se observaron diferencias entre ambos perodos (cuadro
1y grficos 1 y 2).
------ Lnea horizontal representa el rango inferior ------- Lnea horizontal representa el rango inferior de
de los valores de referencia. los
valores de referencia.

Grfico 1. Valores mnimos, mximos y


promedios Grfico 2. Valores mnimos, mximos y
de las concentraciones plasmticas de T4 promedios
en vacas de las concentraciones plasmticas de T3
Frison Negro a pastoreo al inicio de la en vacas
lactancia y Frison Negro a pastoreo al inicio de la
al final de la gestacin. lactancia y al
final de la gestacin.
Minimum, maximum and mean values of plasma T4
concentrations in Friesian cows at pasture in early Minimum, maximum and mean values of plasma T3
lactatio concentrations in Friesian cows at pasture in early
n and late pregnancy. lactation
and late pregnancy.

35. Los resultados encontrados en este estudio son coincidentes con los
observados por Kunz y col. (1985) y opuestos a los de Grum y col. (1996),
quienes encontraron altos valores de T3 en el perodo seco, con una cada en
los das posteriores al parto, para luego aumentar levemente, lo que
segn Slebodzinski (1991) sera debido al dficit energtico que se presenta
al inicio de la lactancia y al paso de hormonas a la glndula mamaria.
PeroTiirats (1997) no encontr diferencias estadsticamente significativas en
los niveles de T3 entre vacas en perodo seco y vacas al inicio de la
lactancia.
36. Varios autores sealan que las concentraciones sanguneas de T4 en vacas
lecheras (Hart y col., 1978; Ropstad y col., 1989; Grum y col.,1996) y
cabras (Riis y Madsen, 1985), al inicio de la lactancia se encuentran
deprimidas, incremen-tando sus niveles a medida que sta
avanza. Heitzman y Mallinson (1972), Hart y col. (1978) y Grum y col.
(1996) sealan que las concentraciones de T4 durante el perodo seco
(preparto) fueron significativamente ms altas que al inicio de la lactancia.
Nuestro estudio no revel diferencias (p>0.05) entre grupos de vacas.
37. Sin embargo, es dificil atribuir las variaciones plasmticas de hormonas
tirodeas a un factor especfico, ya que son numerosos los factores que estn
involucrados, entre ellos cabe destacar: genticos (Bitman y col., 1984), el
nmero de lactancias (Leirer, 1981), la produccin lctea (Walsh y col.,
1980), la alimentacin, condiciones climticas (Johnson y Vanjonack, 1975)
y factores teraputicos como hormonas, sulfonamidas, analgsicos,
fenilbutazona y clorpromazina (Bekeoba y col., 1982; Cunningham, 1992).
38. Finalmente, cabe sealar que los resultados de este estudio permiten
entregar, con el mtodo utilizado, valores referenciales de T3 y T4 para
posteriores estudios de la actividad tirodea en vacas a pastoreo.
39. RESUMEN
40. Con el objeto de conocer las concentraciones sanguneas de Triyodotironina
(T3) y Tiroxina (T4) en vacas lecheras en el sur de Chile, se seleccionaron
110 muestras de sangre de vacas Frison Negro, 55 pertenecian a vacas al
inicio de lactancia y 55 a vacas en el perodo final de gestacin. Las
muestras de sangre fueron obtenidas por puncin yugular o coccgea en
tubos heparinizados. El plasma obtenido por centrifugacin fue mantenido a
-20 C hasta el anlisis. Las concentraciones de T3 y T4 fueron medidas por
radioinmunoensayo, utilizando los reactivos Coat-a-Count total T3 para
Triyodotironina y Coat-a-Count total T4 para Tiroxina (Diagnostic Products
Corporation, DPCR). La significancia estadstica, entre medias de grupos, fue
establecida por el test de Student, considerandose significativo un valor de
p<0.05.
41. Se concluye que las concentraciones sanguneas de Tiroxina (T4) y
Triyodotironina (T3) en vacas Frison Negro son de 41.111.6 nmol/l y
1.40.43 nmol/l respectivamente. Las concentraciones de T4 estn bajo el
rango y las de T3 en el rango de referencia que seala la literatura,
utilizando el mismo procedimiento analtico. Las concentraciones de T3
fueron significativamente (P< 0.05) mayores en las vacas en lactancia que
en las vacas al final de la gestacin y no se observaron diferencias
significativas en las concentraciones de T4, en relacin al estado fisiolgico.
42. Aceptado: 11.05.99.
43. Proyecto IAEA/FAO CHI/5/17.
Proyecto FONDECYT 199/0993.
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