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1. INTRODUO
Esse mtodo foi introduzido por Rittenberg em 19482. O mtodo de Kjeldahl usado para
converter o N combinado da amostra amnia, que destilada e recebida em soluo cida.
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Curso de Ps-Graduao em Energia Nuclear na Agricultura, CENA/USP, Piracicaba, maio de 2001.
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Rittenberg, D.; In: Wilson, D.W.; Nier, A.O.C.; Riechman (eds.) Preparation and measurement of isotopic tracer.
Edwards, Ann Arbor, Mich., 1948, pp.31-42.
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Aps concluda a digesto cida da amostra, o NH4+ resultante deve ser separado dos
reagentes usados para a sua converso, e tambm dos outros constituintes do extrato, para
eliminar as substncias que possam decompor o reagente hipobromito usado na oxidao de
NH4+ N2.
O modo convencional de separao conduzido por destilao da amnia da amostra por
arraste de vapor em aparelhos de destilao (Figura 1, adaptada de Mulvaney, 1993).
A amostra a ser destilada baseificada com soluo concentrada de NaOH (18 M). A
amnia destilada por arraste de vapor, sendo recebida em soluo de cido sulfrico, clordrico
ou de cido brico contendo indicador. Se a amostra destilada recebida em cido sulfrico ou
clordrico ela posteriormente titulada com uma base (soluo padronizada de NaOH ou KOH)
e por diferena entre o nmero de miliequivalente do cido antes e aps a destilao calcula-se a
massa de N da amostra; se ela recebida em soluo de cido brico contendo indicador
titulada diretamente com cido sulfrico ou clordrico padronizado. Nesse ponto, determina-se a
concentrao de N-total da amostra.
Figura 1. Aparelho destilador de amnia por arraste de vapor (Fonte: Mulvaney, 1993).
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 4
Entre destilaes de uma amostra e outra aconselhvel destilar uma soluo contendo
cido formico e etanl, ou somente etanl, que remover algum resduo de NH3 da ltima
amostra que ficou aderida s paredes internas do destilador. Esse procedimento feito para
evitar contaminao entre amostras (cross contamination). Durante a destilao com etanl as
primeiras fraes do destilado adicionado amostra que precedeu a operao.
Muitos laboratrios tem usado na separao do N- NH4+ da amostra, a tcnica da difuso
como uma alternativa de destilao por arraste de vapor em aparelhos destiladores, tcnica essa
proposta por ODeen & Porter (1979). Para se usar essa tcnica a digesto das amostras de solo
ou planta so feitas em tubos especiais de digesto-difuso (Figura 2, adaptada de ODeen &
Porter, 1979). Aps a digesto das amostras adiciona-se ao extrato digerido 10 ml de NaOH 18
M para alcalinizar o meio. Na parte superior interna do tubo de digesto colocado um frasco
contendo um volume pr-determinado de soluo padronizada de HCl ou H2SO4. O tubo de
difuso ento fechado hermeticamente e retorna ao bloco temperatura de 140oC. O processo
de difuso das amostras ocorre por um perodo de tempo de 24 h (amostras contendo cerca de
1mg de N). O N-NH4+ recuperado na soluo cida pode ser determinada por titulao do cido
excedente com soluo de uma base padronizada.
A soluo final pode ser concentrada para posterior anlise de razo isotpica de N. As
Tabelas 1 e 2 (ODeen & Porter,1979) ilustram o trabalho de padronizao da tcnica para uma
amostra contendo 1 mg de N e enriquecida com 15N (1,315% de tomos).
140o C
% de difuso 63,6 94,7 98,3 98,6 99,0 -- --
Ab.: % de tomos 1,3078 1,3072 1,3073 1,3093 1,3072 -- 1,3135
Varincia x 10 -5 0,903 1,13 1,16 0,502 0,633 -- 0,128
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Tabela 2. Difuso e abundncia de N em funo do volume de soluo de sal e tempo de
difuso com um nvel constante de 1 mg de N por tubo, na temperatura de 140oC (8h,
n = 4; e 24h , n = 5a). (Fonte: ODeen & Porter,1979)
Volume, mL
50 30 10 50 30 10
8h 24 h
% de difuso 69,2 90,9 99,8 98,7 99,4 100
Ab.: % de tomos 1,3030 1,3059 1,3147 1,3113 1,3109 1,3153
Desvio do padro
(partes por mil) 9,95 7,75 1,06 3,65 3,95 0,61
a
Abundncia de 15N do padro = 1,3161
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A tcnica de difuso pode tambm ser usada para N inorgnico de solo (NH4+ e NO3-)
extrados com KCl (relao 1:3 a 1:10 de solo: extratante). Com essa tcnica, da mesma forma
como realizado em aparelho destilador (Keenney & Nelson, 1982) o extrato tratado numa
primeira difuso com um alcali (MgO), e a amnia gerada da frao N-NH4+ recebida em
quantidade pr-estipulada de soluo de cido sulfrico padronizado colocado em um frasco
dentro do tubo de digesto, que permanece hermeticamente fechado, durante o processo de
difuso. Numa segunda etapa adiciona-se um redutor de nitrato + nitrito (liga de Dewarda) e
repete-se a operao de difuso separando a frao N-NO3+NO2. Aps o perodo de difuso da
amostra os frascos contendo a amnia difundida so tituladas com uma base padronizada e
determinado o N-total da frao.
Brooks et al. (1989) desenvolveu a tcnica com um frasco especial de difuso do N-
mineral para extratos de solo (Figura 3, adaptada de Barrie & Prosser, 1996), em que a amostra
recebida em disco de microfibra de vidro ou papel de filtro acidificada com 10 l KHSO4 2,5 M,
sendo as amostras posteriormente levadas para anlise de N-total e de 15N em aparelhos (IRMS)
automatizados. A massa de solo a ser usada na extrao com KCl ser funo da massa de N-
NH4+ ou de N-NO3- necessrio para anlise por espectrometria de massas (50 a 100 g de N para
um IRMS com analisador automtico ANCA-SL da Europa Scientific). A Tabela 3 e Figuras 4 e
5 adaptadas de Brooks et al. (1989) ilustram os testes de calibrao com o mtodo.
Figura 3. Frasco de difuso de amnia de amostras lquidas para discos de microfibra, adaptao
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para determinao de N em IRMS com analisador automtico de nitrognio (Fonte:
Barrie & Prosser, 1996).
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 7
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Tabela 3. Recuperao de N de uma soluo padro com KCl em papel de microfibra
contendo soluo cida (n = 5) (Fonte: Brooks et al.,1989).
Tratamentos % de Recuperao
Volume da amostra Contedo de N Mdia SD
mL mg L-1 de N cido
40 2 KHSO4 100 1
60 2 H2SO4 96 2
50 20 KHSO4 101 2
40 20 H2SO4 101 1
Figura 4. Difuso de NH3 de extratos de solo para discos de microfibra por 140 h de incubao,
a temperatura ambiente (Fonte: Brooks et al.,1989).
O sal amoniacal seco que contm o N da amostra de interesse oxidado N2, sob vcuo,
com o reagente hipobromito alcalino de ltio ou de sdio (LiOBr ou NaOBr), conforme a reao
(reao de Rittenberg):
2NH3 + 3LiOBr 3LiBr + 3H2O + N2
No incio dos trabalhos com o traador 15N, essa etapa era executada em tubos em forma
de Y com torneira prpria para vcuo, onde num ramo adicionava-se a amostra concentrada e no
outro o reagente LiOBr (Figura 6, Mulvaney, 1993). Aps ter sido feito vcuo no interior do
tubo, o mesmo fechado e retirado da linha de vcuo. Com a simples inclinao do tubo coloca-
se em contato a soluo de LiOBr e a amostra de sal amoniacal. A reao libera o N2. O tubo
ento levado diretamente para a entrada do espectrmetro de massas, passando o gs por uma
armadilha de N-lquido. Nessa armadilha ficava retido vapor de gua, vapor de Br e N2O gerado
na reao, sendo admitindo no IRMS somente o gs N2. Deve-se tomar cuidado com as amostras
muito cidas que neutralizam o excedente de LiOH que acompanha a soluo de hipobromito
alcalino de ltio. Nesses casos pode ocorrer liberao excessiva de Br gasoso prejudicando a
anlise no IRMS.
Para evitar o uso dos tubos em Y no preparo de amostras pela reao de Rittenberg foi
desenvolvido um sistema de converso de amostras amoniacais N2, como mostrado na Figura 7
de Porter & ODeen (1977). O sistema original foi sendo modificado e aperfeioado como
mostrado na Figura 8 de Mulvaney (1993).
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 9
Figura 6. Tubo em Y de Rittenberg. (a) Posio na vertical para realizar vcuo e desgasificao
nas solues; (b) Inclinao a fim de por em contato o reagente LiOBr com o sal de
amnio (Fonte: Mulvaney, 1993).
O mtodo original de Dums envolve a oxidao de matria orgnica com xido de cobre
em uma atmosfera de dixido de carbono que passa ento atravs de uma soluo hidrxido de
potssio concentrada a fim de reter o CO2.
No mtodo de Dums modificado a matria orgnica oxidada com xido de cobre e os
gases gerados, com exceo do N2 so retidos em xido de clcio. A reao levada a efeito sob
vcuo, em tubo de vidro pyrex ou quartzo.
A amostra finamente moda com aproximadamente 1 mg de N (50 a 200 mg de matria
seca vegetal) colocada num tubo de vidro de borossilicato de aproximadamente 20 cm de
comprimento e 0,9 mm de dimetro interno. O tubo fechado numa das extremidades ficando
com uma ponta fina, especialmente preparada, como ilustrado na Figura 9. Juntamente com a
amostra adicionado 1,5 g de CuO e 1,5 g de CaO. Essas quantidades de reagentes so em
excesso (Fiedler & Proksch, 1975). A seguir feito um estrangulamento na parte superior do
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tubo o que facilitar o fechamento aps realizado o vcuo no seu interior. Os tubos so ento
levados uma linha de vcuo (Figura 10) at que seja atingida a presso de 0,01 mbar. Os tubos
so ento fechados com auxlio de chama de maarico. Em seguida realizada a combusto das
amostras em forno mufla onde as amostras permanecem por 12h na temperatura de 550oC. A
temperatura poder ser de 900-1000oC caso os tubos sejam de quartzo ou vicor. Nesses casos o
tempo de combusto ser de 2-4 horas. Antes da combusto conveniente que seja misturada a
amostra com o reagente CuO. Isto feito para aumentar o contato da amostra com o oxidante. Os
gases gerados na combusto de Dumas so: N2, CO2, vapor de gua, SO2 e NO. O CO2 e vapor
de gua reagem com o CaO dando CaCO3 e Ca (OH)2. Os xidos de enxofre e de nitrognio so
reduzidos pelo Cuo produzido com a liberao de oxignio do CuO. Se a amostra contm nitratos
e nitritos necessrio adicionar tambm cobre metlico para facilitar a reduo das formas
oxidadas de N. O tubo contendo em seu interior o N2 gerado da combusto da amostra orgnica
levado para a entrada do espectrmetro de massas, onde por meio de um quebrador a
estremidade fina do tubo quebrada (breack seal) sendo o N2 admitido no aparelho para a
anlise, como mostrado em figura.
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Figura 9. Preparo de amostras vegetais para determinao de N por IRMS pelo mtodo de
Dums modificado. Procedimentos do Labor. de Istopos Estveis do CENA/USP.
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 13
Figura 10. Linha de alto-vcuo no preparo de amostras pelo mtodo de Dums modificado.
Para anlise pela tcnica de Rittenberg via ARA-MS requerido que as amostras de sal
de amnio que contenham entre 20 a 150g de N, estejam colocadas em pequenos frascos
colocados em um microprato do auto-analisador para 137 amostras. As trs primeiras etapas do
mtodo convencional so necessrias para se obter o sal de amnio da amostra. A diferena com
o mtodo convencional est na quarta etapa de preparao (reao do sal amoniacal com o
LiOBr) e na anlise que executada automaticamente, sem a necessidade de acompanhamento
de cada amostra por um tcnico. Esse tipo de autoanalisador foi desenvolvido inicialmente por
McInteer e Montoya em 19813 nos laboratrios de Los lamos USA (Mulnaney, 1993) e foi
comercializado juntamente com Espectrmetros de Massas, mas logo caram em desuso com o
advento dos analisadores automticos por combusto direta.
O funcionamento do autoanalisador consistia, de forma resumida, em uma bandeja
contendo os frascos com as amostras que movia-se sequencialmente. Cada frasco era atuado
pneumaticamente, ficando bem vedado, e o ar no seu interior sendo purgado com gs Freon .
Aps isso o reagente LiOBr era adicionado e o N2 gerado passava por uma armadilha de N-
lquido antes de ser admitido no IRMS.
3.2.1. ANCA-SL
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McInteer, B.B. and Montoya, J.g. (1981) Automation of a mass spectrometer for N isotope analysis. In Recent
Developments in Mass Spectrometry in Biochemistry, Medicine and Environmental Research, vol 7(
Frigerio, sd.), pp. 343-349, Elsevier, Amsterdam.
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Figura 11. Sistema analisador automtico ANCA-SL/IRMS da Europa Scientific (UK) (Fonte:
Barrie & Prosser,1996).
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O desempenho das anlises de N nesses sistemas limitado pela contribuio do
branco, sendo essa contribuio importante para amostras pequenas. Nesse sentido muito
importante a pureza dos gases He (normalmente 10ppm ou menos de N) e O2 (5ppm ou menos
de N2). Para amostras de N2 pode-se controlar pelo softwere do ANCA-MS da Europa Scientific
trs modos de anlise (Figura 12, Barrie & Prosser, 1996). Os modos normal e acelerado que
servem para amostras com quantidade maiores de N, somente diferindo em relao a preciso e
tempo de anlise. Existe uma coincidncia entre o pulso de N2 da amostra e o branco devido ao
O2. Pode-se nesses modos selecionar procedimentos com desconto do branco nas anlises. No
modo: amostra pequena, o pulso de O2 atrasado para mover o branco (N2) do O2 fora da
coincidncia da amostra. O Cr2O3 possibilita o oxignio necessrio para a combusto da amostra.
O pulso de O2 recupera o catalizador a sua forma mais oxidada Cr2O3.
O ANCA-SL da Europa Scientific U.K. considerado um sistema dedicado e possui
vantagens sobre combinaes de analisadores elementares combinados IRMS. Os sistemas
dedicados so providos de softwere com controle de pulso de O2, permitindo que o seu volume
seja varivel para atender o tipo e tamanho da amostra desejada. O O2 somente flui durante a
injeo do pulso, enquanto em analisadores elementares o O2 flui continuamente.
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As amostras slidas a serem analisadas no ANCA devem ser finamente modas (passam
em peneira <150m: 100 mesh) para assegura homogeneidade tanto na anlise de N-total
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assim como na de N. Amostras contendo 10-1000g N so analisadas rotineiramente.
Exemplos so: 12 mg de gros, 12 mg de palha e 20 mg de solo.
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 18
Figura 13. Comparao de determinaes de 15N e de N-total pelo mtodo tradicional Kjeldhal-
Rittenberg e pelo sistema com analisador automtico ANCA-SL/IRMS (Fonte:
Barrie, 1990)
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 19
3.2.2. ANCA-G
Figura 14. Sistema ANCA-G da Europa Scientific (UK) para anlise de gases NOx e CH4
(Fonte: Barrie & Prosser,1996)
Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 20
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