ANALISIS ANTIOKSIDAN

Analisis antioksidan meliputi analisis kualitatif dan kuantitatif.

1. Analisis kuntitatif Antioksidan dengan TLC (SNI,1992,AOAC,1995)
Prinsip:
Setelah melalui tes berwarna, minyak diektraksi berturut-turut dengan methanol dan
asetonitril, ekstrak mungkin mengandung galat, BHA, NDGA, dan BHT. Ekstrak tersebut masih
berupa campuran, melalui kromatografi plat tipis silika gel dan pelarut benzen sebagai
pengembang, maka akan terjadi pemisahan dimana kromatogram yang terbentuk dilakukan
reaksi penyemprotan. Hasilnya akan berada di bawah garis dasar.
Alat : Rotary evaporator, seperangkat peralatan TLC, Silica Gel
Bahan :
1) Ethanol
2) Asetonitril
3) Benzen
4) Bahan pereaksi penyemprot yaitu 2,6-dikloraquinon Kloriomid (pereaksi GIBBS)0,01% dalam
etanol
5) Larutkan standar, larutan 1% di dalam 70% v/v etanol
6) Ferriklorida Heksahidrat, 0,2 gram zat murni dalam 0,5 ml 100% etanol lalu encerkan sampai
100 ml dengan air destilasi.
Cara Kerja:
Tambahkan 25 ml metanol kepada 10 gram sampel jaga suhunya pada 40 sampai 10
menit,goyangkan sesering mungkin.Dinginkan lalu dekantasi lapisan metanoliknya dan lakukan
tes dengan ferriklorida dan larutan --------tes akan memberikan larutan berwarna merah ini
menunjukkan bahwa terdapat zat pereduksi termasuk tokoferol bebas tetapi tidak dalam bentuk
ester tokoferol.Jika terdapat zat pereduksi ekstraksi dilanjutkan kemudian dengan TLC.
Tambahkan benzen sebagai pelarut pengembang dan pereaksi GIBBS.sebagai fase diam
(chromogenic agen) berikutnya dapat dicoba plat dengan silika gel G.
Larutan Pengembang :
1) Heksan : eter = 90 : 10
2) Etilen triklorida : asam asetat : asam format : isobutanol=15:1:2:2.
 3) N-heksan atau Petroleum eter : Benzen :asam asetat=40:40:30. Ini baik utuk pemisahan NDGA
dan galat :run for130mm,nidimensional.
Pereaksi Penyemprot:
a. Jika penyemprotan digunakan pereaksi 20% asam pospomolibdik dalam metanol,antioksidan
muncul dalam bentuk noda berwarna biru atau abu-abu.Jika perlakuan pada plat dengan
menggunakan uap ammonia background akan menjadi putih bersih dan anti oksidan muncul
berbentuk noda berwarna biru atau hijau.
b. Jika reaksi warna pada pendahuluan positif,tetapi pada plat TLC tidak di dapatkan noda,maka
hal ini menunjukkan bahwa dalam sampel terdapat antioksidandalam zat pereduksi.
c. Tambahkan 100 ml asetonitril.Untuk mendapatkan semua BHT ekstraksi dengan asetonitril
sangat sulit kecuali dengan menggunakan destilasi uap.
d. Uapkan 2 ml hasil ekstrak dengan rotary evaporator di bawah tekanan reduksi pada 40 c
(dibawah nitrogen).kemudian teteskan sejumlah 20 mikroliter dan 40 mikroliter secara terpisah
pada plat TLC dan kembangkan dengan pelarut benzen setinggi 10 cm.Keringkan di udara dan
semprotkan dengan pereaksi GIBBS.
Metode IUPAC II.C.9 secara substansi mirip tetapi menggunakan pelarut sebagai berikut :
a. 40-60C B.R. Petroleum eter : Benzen : Asam asetat glasial = 40 : 40 : 20.
Siapkan dalam keadaan segar.
Petroleum eter : Benzen : Etil asetat : Asam asetat glasial = 40 : 40 : 25 : 4.
Siapkan dalam keadaan segar.
Kloroform : Metanol : Asam asetat glasial = 90 : 10 : 2.

Analisis Kuantitatif untuk Gallat (SNI,1992,AOAC,1995)

Prinsip :
Setelah antioksidan diekstrasi dengan metanol 95%.Alikuat yang mengandung ekstrak
metanolik ditambahkan aseton,lalu dengan serbuk Amonium Sulfat ,maka akan timbul warna
biru kemudian warna biru ini dibandingkan dengan warna standar.
Alat : Spektrofotometer atau kolorimeter
Bahan :
1. Metanol 95%, campurkan 95 ml metanol dengan 5 ml air.
2. Kalsium karbonat
 3. Serbuk Ammonium Sulfat
4. Larutan standar n-propil atau n-dodekil gallat.Larutkan 0,1 gram dalam metanol 95% dan
encerkan sampai 10ml (1000).Buat larutan standar antara 5-50 mg/L
Cara kerja:
a. Campurkan 10 gram sampel cair atau leburan dengan 25 ml metanol 95% goyang-goyangkan
dengan kuat selama 1 menit di dalam tabung sentrifus.Seperti telah dijelaskan oleh Cassidy dan
Fisher atau tabung Werner-Schmidt (dengan atau tanpa kran samping).Masukkan ke dalam water
bath pada suhu 40 - 50 C dan biarkan kira kira 15 menit sampai terjadi pemisahan. Tulang
lapisan atas ke dalam labu kembali lapisan atas ke labu lalu encerkan sampai tanda batas.
Tambahkan 1 gram kalsium karbonat, goyang goyangkan dan saring dengan kertas saring
( Whatman No. 1 atau sejenisnya ), sisakan filtrat beberapa ml hingga yakin bahwa kalsium
karbonat tertinggal pada sisa filtrat tersebut.

b. Ambil dengan tepat 10 ml filtrat, tambahkan 1 ml aseton lalu tambahkan pula kira-kira 10 mgr
ammonium sulfat. Goyangkan selama 1 menit. Setelah setengah jam, ukur absorban pada
panjang gelombang 580 nm untuk warna biru di dalam sel 1 cm bandingkan dengan warna 10 ml
larutan standar 95 %.
Perhitungan :
Jumlah gallat dalam mg/Kg sampel :
Absorban sampel X standar dalam mg/L X 50
Absorban standar 10

Analisa kuantitatif untuk BHA (AOC, 1995 )

Prinsip :
Filtrat yang berasal dari alikuot yang telah dipersiapkan untuk penentuan gallat direaksikan
dengan GIBBSS menghasilkan warna indofenol yang stabil.
Alat : spektrofotometer
Bahan :
1. Metanol 95% v/v.
 2. Natrium tetrabonat dekahidrat 0,5%
3. 2,6-dikloro-p-benzoquinon-4-kloroamin (Pereaksi GIBBS)
4. N-butanol.
5. BHA standar, 25 mg/L dalam metanol 95 %
Cara kerja:
a. Siapkan ekstrak dengan menambahkan metanol 95% seperti yang telah dilakukan pada
penentuan gallat. Ambil dengan tepat 2 ml ekstrak tersebut tambahkan 2 ml metanol 95% , 8 ml
larutan borak dan 2 ml pereaksi GIBBS. Setelah 15 menit larutkan dengan n-butanol hingga
tepat mencapai volume 20 ml.
b. Siapkan 2 ml larutan blangko metanol 95 % dan larutan standar BHA 25 mg/L. Baca absorban
pada panjang gelombang 610 nm.
Perhitungan :
BHA dalam sampel dalam mg/L =
Asampel Ablangko x 25 x 50
Asampel Ablangko 10

Analisa Kuantitatif Untuk BHT (SNI, 1992, AOAC, 1995)

Prinsip :
Sampel diperlukan dengan cara destilasi uap. Destilat yang mengandung BHT ditentukan
secara reaksi berwarna dengan pereaksi o-dianisidin dan natrium nitrat.
Alat :
1. Seperangkat destilasi uap
2. Pemanasan 160C dengan beaker glass ukuran berukuran 1 liter, berisi setengah penuh parafin.
Juga pemanas minyak dapat digunakan.
3. Corong pisah tipe Squibb yang dicat hitam ukuran 60 ml.
4. Labu volumetrik 10 ml dicat hitam.
5. Generator uap yang dilengkapi dengan labu dasar ukuran 1 liter untuk tempat air destilasi,
plastik penghubung uap luar dengan kepala labu destilasi atau bola, dan soket digunakan secara
bersamaan.
Bahan :
1. Kloroform
2. Larutan magnesium klorida, larutan 100 gram heksahidrat dalam 50 ml air
3. O-dianisidin, larutkan 0,25 gram dalam 50 ml metanol, tambahkan 100 mg arang aktif, goyang-
goyangkan selama 5 menit dan saring. Campurkan 40 ml larutan jernih tersebut dengan 60 ml 1N
HCl siapkan dengen segera dan lindungi dari sinar matahari.
4. Natrium nitrat 0,3% dalam air
5. Larutan standar BHT mg/L, larutkan 50 mg dalam metanol lalu encerkan sampai 100 ml,
siapkan larutan standar yang mengandung 1-5 mg/L larutkan dengan 50% v/v metanol.
Cara kerja:
a. Masukkan 15 ml larutan Magnesiun Klorida ke dalam labu 100 ml (JENDEN dan TAYLOR)
atau tabung G (modifikasi KOZELKA dan HINE),atau tambahkan kurang lebih 5 gr
sampel,disarankan lebih baik BHT yang dikandung kira-kira 0,4 mg.Lumasi dasar gelas lalu
hubungkan ke labu.Panaskan pemanas yang berisi air destilasi pada suhu 160C - 100C.
Atur generator uap agar destilat air yang keluar memiliki laju 4 ml/menit. Jaga kondisi tersebut
hingga air mengalir terus menerus. Hubungkan kondensator dengan generator uap ke labu
destilasi dan benamkan ke dalam pemanas. Destilasi uap ini harus bekerja dengan baik.
b. Tampung sebanyak 100 ml di dalam labu volumetrik 200 ml yang berisi 50 ml metanol. Lepas
labu destilasi dari generator uap dan kembalikan labu destilasi kepanas. Jika ujung kondensor
telah dingin, lepas kondensor dari labu destilasi. Aliri segera dengan uap air. Cuci kondensor
dengan 5 porsi metanol masukkan hasil pencucian ke dalam labu volumetrik. Dinginkan sampai
temperatur kamar dan encerkan dengan metanol sampai volume 200 ml lalu aduk.
c. Bersihkan dan keringkan 3 buah corong pisah 60 ml tipe Squibb, beri tanda B, S, X ke dalam
masing-masing corong pisah, masukkan ke dalam corong B 25 ml metanol 50% v/v melalui pipa,
corong S 25 ml larutan standar yang mengandung 1-3 mg BHT/ml, corong X 25 ml metanol 50%
(destilat) sampel. Pada masing-masing corong pisah tambahkan 5 ml larutan dianisidin, tutu
corong pisah lalu goyang-goyangkan dengan hati-hati. Kemudian pada masing-masing corong
pisah ditambahka 2 ml larutan natrium nitrat 0,3%, tutup kembali lau goyang-goyangkan dengan
hati-hati. Biarkan 10 menit lalu tambahkan lagi pada masing-masing corong pisah 10 ml
kloroform. Lakukan ekstraksi ini sampai terbentuk warna kompleks dengan mengoyang-
goyangkan selama 30 detik. Biarkan selama 2-3 menit hingganterbentuk 2 lapisan terpisah
sempurna.
d. Beri tanda pada labu volumetrik B, S ,dan X. Pipet 2 ml metanol absolut lalu masukkan ke
dalam masing-masing labu. Pisahkan dan masukkan lapisan kloroform (lapisan yang berada di
bawah) ke masing-masing labu volumetrik kocok dengan baik.
e. Bacaalah absorban larutan masing-masing dengan alat spektrofotometer atau kolorimetri pada
panjang gelombang 520 nm dengan menggunakan campuran 2 ml metanol dan 8 ml kloroform
sebagai blanko. 50 mg BHT akan memberikan absorban kira-kira 0,39 dengan tebal sel 1 cm
recovery dihasilkan kira-kira 97 2%.
Perhitungan:
BHT di dalam sampel mg/Kg =
Asampel Ablangko X standart X 200
Astandart Ablangko berat sampel