Estas caractersticas que destacan su importancia trfica, ambiental,

ecolgica y su

inminente riesgo de extincin, sumado a las mismas caractersticas que

hicieron a los

anfibios un modelo muy utilizado en embriologa, por su sensibilidad, fcil

mantenimiento

y reproduccin en el laboratorio, ms el elevado nmero y alta

homogeneidad de

individuos obtenidos, han impulsado el desarrollo de bioensayos de

toxicidad con anfibios.

Los bioensayos de toxicidad con anfibios tuvieron su enorme desarrollo

durante los aos

90 (Mann 2005). As, la Sociedad Americana para los Mtodos de

Evaluaciones y

Materiales (ASTM 1993a) desarroll y aval la gua FETAX (Frog Embryo

Teratogenesis

AssayXenopus) (Dumont et al. 1983), el bioensayo con anfibios ms

conocido. FETAX

utiliza embriones de Xenopus laevis, la rana con uas de Sudfrica, desde

estadios

tempranos del desarrollo para exposiciones de 96 h, perodo en el cual, a

una temperatura

fija de incubacin, concluyen su desarrollo embrionario. Este test ha sido

utilizado

ampliamente para la evaluacin de la toxicidad tanto de compuestos

simples, como

mezclas, muestras ambientales, suelos, sedimentos demostrando su

eficiencia como

aplicacin de herramienta ecotoxicolgica en plantas de tratamiento de

efluentes

(Bernardini et al. 2005). FETAX evala como puntos finales, la mortalidad y

las

alteraciones en la talla. Para evaluar teratognesis se desarroll una gua

completa de

anlisis que busc facilitar y unificar la clasificacin de las malformaciones

(Bantle et al.
1992). Con el fin de obtener informes ecotoxicolgicos que fueran
representativos de las

implicancias sobre los ecosistemas y las especies en Argentina, que a su vez

mantuvieran la confianza y la posibilidad de comparar resultados tanto intra
e inter laboratorio, como entre

diferentes sustancias, mezclas y muestras, se desarroll el test

estandarizado ANFITOXANFITOX presenta numerosas ventajas y diferencias
respecto del test FETAX (Tabla 1.1), adems de posibilitar la evaluacin de la
susceptibilidad de especies autctonas y en diferentes momentos del ciclo
de vida, ampla los tiempos de evaluacin de agudo a crnico corto (168h) y
crnico (14 das). (Herkovits y Prez-Coll 1999), que emplea embriones de
Rhinella arenarum. El protocolo

Tabla 1.1. Comparacin de algunas condiciones experimentales entre

ANFITOX y FETAX; modificado de Herkovits y Prez-Coll (2003).

Estos test, tambin permiten obtener informacin sobre mortalidad,

malformaciones, retrasos en el desarrollo y crecimiento y anomalas en el
comportamiento.

En la actualidad se encuentran publicadas dos metodologas para realizar

bioensayos estandarizados con embriones de anfibios: FETAX y AMPHITOX
(Linder

y col., 2003). El primero y ms antiguo de estos ensayos ecotoxicolgicos, el

FETAX

(Dumont y col., 1983; ASTM, 1993), ha sido utilizado para realizar ms de

100

contribuciones cientficas enfocadas en la evaluacin de sustancias fsica,

qumicas,

mezclas y muestras ambientales de agua y suelo (Prati y col., 2000; Bruner

y col.,

2002; Hoke y Ankley, 2005; Boga y col., 2008; Brausch y col., 2010).

Existen numerosas razones por las cuales es natural que la ecotoxicologa

de

anfibios haya adoptado el ensayo FETAX como modelo, teniendo en cuenta

el

hecho de que X. laevis es desde hace ms de tres dcadas la rata de

laboratorio

de los anfibios, la decodificacin completa de su genoma, su fcil manejo y

reproduccin en laboratorio y la descripcin detallada de los estadios de su

desarrollo embrionario desde hace 35 aos (Nieuwkoop y Faber, 1975),

entre otras.

No obstante, varias contribuciones apuntan una serie de desventajas en

cuanto a la

utilizacin de X. laevis en los ensayos ecotoxicolgicos. Los

cuestionamientos se

basan en el inusual ciclo de vida exclusivamente acutico de esta especie,

resultando poco representativa de la mayora de los anuros (Mann, 2005) y

el hecho

de tener un genoma tetraploide, lo cual lo hace de mucha dificultad para

llevar a

cabo investigaciones a nivel molecular, como de creacin de mutantes y/o

estudios

de la regulacin genmica (Bernardini y col., 2005). Existe una cantidad

cada vez
mayor de estudios que resultan de la modificacin del protocolo FETAX en
cuanto

a la especie utilizada, enfocndose la mayora en comparar X. laevis con

especies

autctonas (Mann y Bidwell, 2000; Fort y col., 2004; Fort y col., 2006). Por
su parte,

tambin se han cuestionado aspectos metodolgicos del procedimiento

FETAX,

debido a que las condiciones de temperatura, salinidad, dieta y capacidad

de carga

por unidad experimental, le estaran quitando sensibilidad al ensayo y/o

afectando a

la robustez de los resultados, como se deduce de la comparacin con otras

metodologas aplicadas al desarrollo embrionario de anfibios (Tietge y col.,

2000;

Herkovits y col., 2002; Hoke y Ankley, 2005). El conjunto de bioensayos

estandarizados ANFITOX (Herkovits y Prez-Coll,

1999; Herkovits y Prez-Coll, 2003) tambin utiliza como modelo embriones

y larvas

de anfibio. El mismo est enfocado a evaluar toxicidad aguda y crnica

tomando

como puntos finales letalidad y teratognesis en distintos estadios del

desarrollo

embrio-larval. El protocolo ANFITOX presenta numerosas ventajas respecto

del test

FETAX, adems de posibilitar la evaluacin de la susceptibilidad de especies

autctonas (Mann, 2005; Paisio y col., 2009), en cuanto a cuestiones

metodolgicas

como la composicin del medio de exposicin, temperatura, capacidad de

carga y

anlisis de los resultados, los cuales se detallan en la tabla 2.1.b. En los

ltimos

aos, ms de una docena de contribuciones cientficas se han publicado en

prestigiosas revistas internacionales.

Tabla 2.1.b. Comparacin entre algunas condiciones experimentales de los

protocolos FETAX y ANFITOX

Aunque la mayora de los estudios de toxicidad realizados sobre el

desarrollo

embrionario en organismos acuticos informan los efectos adversos en base

a

protocolos de tratamiento continuo, podra ocurrir que en escenarios

naturales, el

medio ambiente presentase variaciones drsticas en su grado de

contaminacin, ya

sea por fuentes de contaminacin puntuales (espacial y/o temporalmente)

as como

por la dinmica hdrica propias de los mares y sistemas acuticos lticos

(Landis y

Yu, 1998). Como resultado de esto, la vulnerabilidad de los organismos

estara dada

por el tiempo de exposicin y el estado fisiolgico por el cual estaran

atravesando lo

los individuos expuestos (Newman, 1998). Dada la heterognea gama de

cambios
morfolgicos y fisiolgicos que se suceden a lo largo del desarrollo
embrionario de

los organismos, es de esperar que un evento de contaminacin acotado a

determinado/s estadio/s tenga un impacto variable, dando lugar a una

susceptibilidad estadio-dependiente de los organismos en desarrollo

(Herkovits y

col., 1998). Desde esta perspectiva, los estudios de susceptibilidad

estadiodependiente

a las distintas noxas resultan de inters, tanto desde el punto de vista

del desarrollo as como de la conservacin de los organismos en cuestin.

Varias contribuciones sealan una notable susceptibilidad

estadiodependiente

a sustancias qumicas (Hopfer y col., 1991; Kaur y Kaur, 1996; Prez-

Coll y Herkovits, 1996; Herkovits y col., 1997a; Aronzon y col., 2010) y

agentes

fsicos (Ankley y col., 2000; Castaaga y col., 2009). Tambin se inform una
gran

variacin de la susceptibilidad en los estadios pre-metamrficos (Brodeur y

col.,

2009). Por su parte Hopfer y col. (1991) evaluaron la toxicidad al Ni soluble

en

distintas etapas del desarrollo embrionario de X. laevis mediante un

protocolo

basado en la metodologa FETAX, pero acortando la exposicin de los

embriones a

24 hs. (es decir, en cada uno de los cuatro das en los que toda la prueba se
lleva a

cabo). En dicho estudio se informa que en el segundo y tercer da los

embriones

fueron ms sensibles que en el primero y cuarto (Hopfer y col., 1991). Las

principales anomalas se encontraron una vez finalizado el desarrollo

embrionario en

la formacin de los ojos, el esqueleto y el tubo digestivo. Dicho patrn de

susceptibilidad dependiente del estadio plantea interrogantes sobre los
efectos

diferidos de Ni en la morfognesis y la diferenciacin celular, los cuales

podran ser

evaluados por medio de protocolos ms especficos de susceptibilidad

estadiodependiente.

LOS ANFIBIOS COMO BIOINDICADORES

Los anfibios cuentan con un ciclo de vida bifsico, con larvas acuticas que
mediante

un proceso de metamorfosis originan individuos adultos terrestres [82]. Un

caracterstico tegumento, altamente permeable, cuya estructura resulta

fundamental

para el intercambio gaseoso y un desarrollo expuesto con larvas acuticas

los hace

particularmente sensibles a la exposicin a contaminantes [83]. Estas

caractersticas

hacen de especial inters su estudio en el marco de una investigacin

ecotoxicolgica,

ya que permiten evaluar ambientes acuticos que funcionan como cuerpos

receptores de

contaminacin, as como tambin ambientes terrestres que sufren la

aplicacin directa

de plaguicidas.

Los anfibios son propuestos como excelentes bioindicadores de la calidad

ambiental. A las caractersticas ya mencionadas se le suma el escaso

desplazamiento

que pueden efectuar la mayora de las especies. Los individuos adultos no

se alejan de

los sitios donde eclosionan y se desarrollan como larvas y por lo tanto

pueden funcionar

como centinelas de las condiciones locales [84]. Dadas las caractersticas

mencionadas
anteriormente, los anfibios presentan una alta sensibilidad a los
contaminantes

ambientales. La contaminacin qumica aportada por actividades agrcolas

intensivas y

extensivas es propuesta como causante de las declinaciones y extincin de

poblaciones

de anfibios acontecidas a nivel mundial [85].