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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA
Inmunoqumica
Presenta:
Introduccin ..... 4
Historia de la inmunologa ... 4
Anticuerpos .. 10
Antgenos . 13
Interaccin antgeno-anticuerpo ... 15
Anticuerpos monoclonales y policlonales 17
Tcnicas inmunoqumicas ... 19
Tcnicas de precipitacin . 21
Reaccin de precipitacin clsica . 21
Tcnica de precipitacin . 22
Tcnica de difusin radial doble de Ouchterlony . 23
Tcnica de inmunoelectroforsis .. 23
Incremento de precipitacin por inmunoelectroforesis con
contracorriente .. 23
Tcnica de difusin radial simple de Manzini (SRID) . 24
Tcnicas de aglutinacin .. 25
Aglutinacin de partculas recubiertas por antgeno 25
Hemoaglutinacin directa . 26
Hemoaglutinacin indirecta .. 27
Tcnicas de inmunofluorescencia 27
Citometra de flujo 29
Tcnica de radioinmunoensayo 32
Tcnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) . 34
Nefelometra . 36
Seleccin de clulas unidas a un anticuerpo 39
Purificacin de antgenos y anticuerpos por cromatografa de afinidad .. 39
Inmunoprecipitacin e inmunoblotting 40
Western blot, Dot blot y Slot blot . 41
Deteccin especfica de protenas en filtros . 43
Bloqueo de la membrana .. 43
2
Tincin de protenas en el filtro 45
Colorantes . 45
Tincin mediante biotina-estreptavidina .. 45
Tincin mediante oro coloidal .......... 45
Anlisis de interacciones moleculares (BIAcore) 46
Aplicaciones principales ... 47
Otras tcnicas basadas en la unin antgeno-anticuerpo .. 47
Tcnicas de biologa molecular tiles en inmunologa 48
Southern Blot 48
Hibridacin fluorescente in situ (FISH: Fluorescent In Situ 49
Hybridization) ...
FISH de Metafase ..... 50
FISH de Interfase .. 50
PCR in situ 51
Mecanismo de la reaccin 52
Bibliografa .. 53
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Introduccin
Los animales superiores son atacados por microorganismos y partculas extraas. Pero
poseen sistemas defensivos frente a tales patgenos; dichos mecanismos tienden a
distinguir lo propio de lo extrao
Historia de la inmunologa
La inmunologa es, en la actualidad, una ciencia autnoma y madura, pero sus orgenes han
estado estrechamente ligados a la Microbiologa. Su objeto consiste en el estudio de las
respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasin por
microorganismos o partculas extraos, aunque su inters se ha volcado especialmente
sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad
y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no propios, as como de su
neutralizacin y degradacin.
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Ya en el siglo X, Rhazes (medico islmico) describe clnicamente a la viruela y la
diferencia de otras enfermedades eruptivas. Adems establece que los sujetos que se
recuperan de la enfermedad tienen una inmunidad prolongada (teora de la inmunidad
adquirida). Para el siglo XI Avicena propone que las enfermedades son transmitidas por
semillas pequeas, o grmenes.
Igualmente, en la antigua China se haba observado que las personas que en su niez haban
padecido la viruela no la adquiran ms adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo
XI a. C., fueron los primeros en intentar una aplicacin de estas observaciones que
indicaban la induccin de un estado protector por medio de una forma suave de la
enfermedad: la inhalacin de polvo de escamas de viruela provocaba un ataque suave que
confera resistencia ante infecciones posteriores. Una modificacin fue introducida en
Occidente en el siglo XVIII por Pylarini y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaa por
Lady Mary Wortley Montagu, esposa del embajador ingls en Constantinopla, tras una
serie inicial de pruebas sobre "voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de
prcticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre
los cuales figuraba la posibilidad de transmisin de otras enfermedades.
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A fines del siglo XIX Robert Koch demostr que las enfermedades infecciosas eran
provocadas por microorganismos, (virus, bacterias, hongos y parsitos), causantes de
enfermedad patologa. Transmite el ntrax a los animales a partir de un cultivo "in vitro",
cumplindose los postulados de Koch. 1876. Hizo adems aportes fundamentales sobre
hipersensibilidad.
En los aos siguientes Pasteur abord la inmunizacin artificial para otras enfermedades;
concretamente, estableci de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por
incubacin a 45C conferan inmunidad a ovejas expuestas a contagio por carbunco. Aos
despus, abordara la inmunizacin contra la rabia, enfermedad de la que se desconoca el
agente causal. Pasteur observ que ste perda virulencia cuando se mantenan al aire
durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos
extractos se podan emplear eficazmente como vacunas. Realiz la primera vacunacin
antirrbica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el nio Joseph Meister, que haba sido
mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo que vali
a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su mtodo de
inmunizacin, que abra perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas
enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creacin del Instituto
Pasteur, que muy pronto reuni a un selecto grupo de cientficos, que enfocaran sus
esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biolgicas. A su vez,
los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los mtodos serolgicos de
Pasteur, lo que les permiti producir y conservar ms fcilmente sueros tipificados contra la
peste porcina.
A finales del siglo XIX existan dos teoras opuestas sobre los fundamentos biolgicos de
las respuestas inmunes. Por un lado, el zologo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-1916), que
haba realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua,
estableci, a partir de 1883, su "Teora de los fagocitos", tras estudiar fenmenos de
englobamiento de partculas extraas por los leucocitos de conejo y de humanos. Inform
que existan fenmenos de eliminacin de agentes patgenos por medio de "clulas
devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y explic
la inmunizacin como una "habituacin" del hospedador a la fagocitosis. Ms tarde, ya
integrado en el Instituto Pasteur, propugn la idea de que los fagocitos segregan enzimas
especficos, anlogos a los "fermentos" digestivos (1900). Esta teora de los fagocitos
constituy el ncleo de la teora de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se
consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo.
Por otro lado, la escuela alemana de Koch haca hincapi en la importancia de los
mecanismos humorales (teora de la inmunidad humoral). Emil von Behring (1854-1917)
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y Shibasaburo Kitasato (1856-1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del ttanos
y de la difteria, observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (ms tarde conocidas como
anticuerpos) que tendan a neutralizar las toxinas de forma especfica, y evidenciaron que el
suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una dosis letal
de la toxina correspondiente (1890). La intervencin de Ehrlich permiti obtener sueros de
caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una proteccin
eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la "antitoxina" presente
en suero. Ehrlich dirigi desde 1896 el Instituto Estatal para la Investigacin y
Comprobacin de Sueros, en Steglitz, cerca de Berln, y, a partir de 1899, estuvo al frente
del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental, en Frankfurt. Durante este ltimo
periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra cientfica, en la que va
ahondando en la comprensin de la inmunidad humoral. En 1900 da a luz su "Teora de las
cadenas laterales", en la que formula una explicacin de la formacin y especificidad de
los anticuerpos, estableciendo una base qumica para la interaccin de stos con los
antgenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez, en 1897, una reaccin antgeno-
anticuerpo, al observar el enturbiamiento de un filtrado bacteriano al mezclarlo con un
suero inmune especfico (antisuero). Durante cierto tiempo se crey que el suero posee
distintas actividades inmunes humorales, cada una denominada de forma diferente:
antitoxina (neutralizacin de toxinas), precipitina (precipitacin de toxinas), aglutinina
(aglutinacin de bacterias) y bacteriolisina (lisis de bacterias). Hubo que esperara a los aos
30 para caer en la cuenta que todas estas actividades se deban a un nico tipo de entidad,
que fue bautizado como anticuerpo.
En 1898 Jules Bordet (1870-1961) descubre otro componente srico relacionado con la
respuesta inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo,
por su termolabilidad e inespecificidad (ms tarde se impondra el nombre de
complemento, propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarroll, en 1901, el primer
sistema diagnstico para la deteccin de anticuerpos, basado en la fijacin del
complemento, y que inici un largo camino, que llega a nuestros das.
La conciliacin de las dos teoras (celular y humoral) se inici con los trabajos de Almorth
Wrigth y Stewart R. Douglas, quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos
presentes en los sueros de animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie
bacteriana, incrementan la capacidad fagoctica de los leucocitos. En los aos 50 se
reconoce que los linfocitos son las clulas responsables de los dos componentes, humoral y
celular, de la inmunidad.
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La inmunoqumica cobra un gran impulso en las primeras dcadas del siglo XX con los
trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribucin de importancia haba
sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de antgenos naturales
(ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboracin con Von
Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su transmisin
hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estmulo para avanzar en el desentraamiento de la
especificidad qumica de los antgenos que determinan la formacin de anticuerpos.
Landsteiner estudi sistemticamente las caractersticas de inmunogenicidad y
especificidad de reaccin de antgenos con anticuerpos, valindose de la modificacin
qumica de antgenos, denominando haptenos a aquellos grupos qumicos que por s
mismos no desencadenan formacin de anticuerpos, pero s lo hacen tras ser conjugados a
protenas portadoras.
Durante este lapso de tiempo se descubre que la sntesis de anticuerpos ocurre en las clulas
plasmticas, aunque stas no son puestas en relacin an con los linfocitos; durante muchos
aos se sigui creyendo que los linfocitos eran clulas pasivas, sin funcin inmune. Por
aquella poca se describe, tambin, la diversidad de inmunoglobulinas, llegndose al
establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los mltiples
experimentos sobre timectoma en ratones neonatos y sobre bursectoma en aves, as como
los de reconstitucin de animales irradiados, con timocitos y clulas de la medula sea, y
que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T
y B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente.
Una importante faceta de la inmunologa de la primera mitad del siglo XX fue la obtencin
de vacunas. Se lograron toxoides inmunognicos a partir de toxinas bacterianas, en muchos
casos por tratamiento con formol: toxoide tetnico (Eisler y Lowenstein, 1915) y toxoide
diftrico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna BCG contra la tuberculosis,
haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de Calmette-
Gurin. La utilizacin de coadyuvantes se inicia en 1916, por LeMoignic y Piroy.
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de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y Levne (1927) de
los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones sanguneas interespecficas
permitieron distinguir la gran complejidad de los antgenos sanguneos, explicables segn
unos 300 alelos mltiples.
En cambio, durante los aos 30 y 40 se daba ms crdito a las teoras instructivas. En ellas,
el antgeno juega un papel central a la hora de determinar la especificidad del anticuerpo
correspondiente. Se sugera que el antgeno servira como un molde alrededor del cual se
plegara la molcula del anticuerpo, que de esta forma adquirira su especificidad. Estas
teoras, popularizadas sobre todo por Linus Pauling, podan encajar en aquellos tiempos en
que an existan muchas lagunas de los conocimientos, pero en los aos 50, tras los nuevos
descubrimientos en Biologa Molecular (ADN, ARN, cdigo gentico, etc.), fueron
descartadas.
Una contribucin esencial a las ideas sobre el mecanismo de formacin de los anticuerpos
la realiz el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su teora de la
seleccin clonal; sta argumenta que cada linfocito B, previamente al contacto con el
antgeno, sintetiza un nico tipo de anticuerpo, especfico para cada antgeno determinante
antignico), de modo que la unin del antgeno causa la proliferacin clonal del linfocito B,
con la consecuente sntesis incrementada de anticuerpos especficos. Esta teora resucit las
ideas selectivas, y actualmente es el paradigma aceptado por todos los inmunlogos. Ms
recientemente Niels Jerne ha realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teora de la
seleccin clonal, proponiendo un modelo de regulacin inmune conocido como teora de
las redes idiotpicas.
Desde 1901 hasta nuestros das alrededor de 25 cientficos han obtenido el premio Nbel
por distintos descubrimientos que han sido un aporte fundamental en Inmunologa. En dos
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siglos de historia se han realizado grandes avances cientficos en reas como: la serologa,
inmunidad celular, inmunologa molecular e inmunogentica. Mecanismos inmunolgicos
han permitido explicar la patognia de diversas enfermedades: alergias, enfermedades
autoinmunes, inmunodeficiencias y gamapatas monoclonales. Desarrollo de reas como la
inmunofarmacologa, inmunologa del cncer y la inmunologa del transplante. En el
mbito del diagnstico el uso de sondas y mtodos inmunolgicos contribuyen en reas
como la medicina humana, la veterinaria y la fisiopatologa. El desarrollo de la
inmunohistoqumica es un gran paso para la inmunologa, estudiando directamente lo que
sucede en la clula o en secciones de tejidos.
Anticuerpos
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Los anticuerpos pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en
el nmero de unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las cadenas pesadas de IgG, IgM,
IgA, IgD e IgE, son conocidas como gamma, mu, alpha, delta y epsilon (, , , y ),
respectivamente. Las cadenas ligeras de cualquier anticuerpo pueden ser clasificadas como
tipo kappa () o lambda (), basadas en pequeas diferencias estructurales polipeptdicas;
sin embargo, las cadenas pesadas determinan la subclase de cada anticuerpo (Tablas 1 y 2).
La pepsina ataca en otro punto y escinde el Fc del resto de la molcula, para separar un
fragmento 5S de gran tamao que se designo F(ab)2, dado que se mantiene divalente con
respecto a la fijacin al antgeno, al igual que el anticuerpo original (Figura 2). La regin
entre los fragmentos Fab y Fc es a la que se le llama bisagra. Este segmento le permite
movimiento lateral y rotacional de los dos dominios que se unen al antgeno. Una cadena
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ligera asociada con la regin amino-terminal de una cadena pesada forman un domino de
unin al antgeno. Las regiones carboxi-terminal de las dos cadenas pesadas se doblan
juntas para formar el dominio Fc.
La clsica forma Y de un IgG esta compuesta de dos variables: brazos antgeno especfico
F(ab), los cuales son crticos para la unin del antgeno, y la cola constante Fc que sirve
como mango para la manipulacin del anticuerpo durante muchos procedimientos
inmunoqumicos. El nmero de regiones Fab en un anticuerpo, corresponde con su
subclase, y determina la valencia del anticuerpo (el nmero de brazos con el que el
anticuerpo puede unirse al antgeno, Figura 3).
Anticuerpos directamente conjugados pueden ser marcados con una enzima o un fluorforo
en la regin Fc. La regin Fc tambin ancla el anticuerpo a platos en ensayos de ELISA y
adems por anticuerpos secundarios en ensayos de inmunoprecipitacin, inmunoblots e
inmunohistoqumica.
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Antgenos
La definicin clsica de antgeno es cualquier sustancia fornea que elicita una respuesta
inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces
de combinar con los anticuerpos especficos formados. Los antgenos son generalmente de
alto peso molecular y comnmente son protenas o polisacridos. Polipptidos, lpidos,
cidos nucleicos y otras molculas pueden tambin funcionar como antgenos. La respuesta
inmune puede tambin ser generada contra sustancias pequeas, llamadas haptenos, si
estos esta acoplados a una protena acarreadora, como la albmina de suero bovino (BSA) u
otras matrices sintticas. Una variedad de molculas como drogas, azucares simples,
aminocidos, pequeos pptidos, fosfolpidos o triglicridos pueden funcionar como
haptenos. As, dndole suficiente tiempo, cualquier sustancia fornea ser identificada por
el sistema inmune y evocara la produccin de un anticuerpo especfico. Sin embargo, esta
respuesta inmune especfica es altamente variable y depende mucho en parte del tamao,
estructura y composicin de los antgenos. Los antgenos que elicitan una fuerte respuesta
inmune se dice que son altamente inmunognicos.
Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antgeno se
denominan partopos y la regin de un antgeno que puede especficamente unirse a un
anticuerpo es llamado eptope. Un eptope no tiene una propiedad intrnseca de alguna
estructura particular. Estos son usualmente uno a seis monosacridos o 5-8 residuos de
aminocidos sobre la superficie del antgeno.
Para que exista una eficiente interaccin entre el antgeno y el anticuerpo, el eptope debe
estar fcilmente disponible para la unin. Si la molcula blanco es desnaturalizada, por
ejemplo, por la fijacin, cambios de pH o durante la preparacin para el gel de
electrofresis, el eptope puede ser alterado y esto puede afectar su habilidad para
interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son inefectivos en un
Western blot pero muy bueno en inmunohistoqumica debido a que en el proceso, un
complejo sitio antignico puede ser mantenido en el tejido, mientras que en el otro
procedimiento la preparacin de la muestra altera la conformacin de la protena lo
suficiente para destruir el sitio antignico y as elimina el sitio de unin con el anticuerpo.
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Si el producto de un gene de inters esta presente en concentraciones extremadamente
bajas, una opcin puede ser el uso de la informacin de la secuencia conocida de
nucletidos para derivar el correspondiente pptido para generar anticuerpos especficos
para esa secuencia.
Interaccin antgeno-anticuerpo
Ac + Ag AcAg
Como todas las uniones antgeno-anticuerpo son reversibles y siguen los principios bsicos
termodinmicos de cualquier interaccin reversible bimolecular, tenemos que:
KA = [Ac-Ag]
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[Ac][Ag]
Pero por otro lado, hay que considerar que los Ag naturales suelen tener ms de un tipo de
determinante antignico. Cuando un antgeno de este tipo entra en un individuo, ste
produce un antisuero, que presenta varios tipos de anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a
un tipo diferente de determinante antignico del Ag original. En este caso se habla de
avidez del antisuero, que es la fuerza conjunta de los distintos anticuerpos de ese antisuero
que reconocen al antgeno multivalente complejo:
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n Ac + mAg {Acn Agm}
donde n representa la heterogeneidad del anticuerpo, y m los distintos tipos de epitopos del
antgeno.
Los factores que contribuyen a la avidez del antisuero son complejos, pero uno muy
interesante es el derivado de la multivalencia del antgeno. La fuerza de unin de un
antgeno complejo multivalente a varios tipos de Ac es mucho mayor que la suma
aritmtica de las fuerzas de unin de cada anticuerpo: La avidez refleja mejor la situacin
fisiolgica, pero la afinidad nos caracteriza lo que ocurre con cada tipo de anticuerpo
concreto en su interaccin con el eptope.
Al reconocer que un antisuero puede tener una avidez relativamente mayor por un antgeno
que por otro, indicamos que el antisuero despliega una especificidad relativa ms que
absoluta; en la prctica se habla de grados de reactividad cruzada. La reactividad cruzada
se refiere a un anticuerpo o poblacin de anticuerpos unidos a eptopes sobre otros
antgenos. Esto puede ser causado por ambos, por la baja avidez o especificidad del
anticuerpo o por mltiples distintos antgenos que tienen idnticos o muy similares
eptopes. La reactividad cruzada es a veces deseable cuando uno quiere una unin general a
un grupo relacionado de antgenos o cuando se intenta clasificar especies cruzadas cuando
la secuencia del eptope del antgeno no esta muy altamente conservada en la evolucin.
Los aminocidos que forman el sitio de unin del antgeno son derivados de ambas
cadenas, la pesada y la ligera, y corresponden a los aminocidos de las regiones
hipervariables determinadas por la secuencia de la protena. Las regiones hipervariables son
conocidas como las regiones determinantes de la complementariedad o CDRs (por sus
siglas en ingles, complementarity determining regions). Los CDRs son seis, tres de cada
cadena, y estos forman loops discretos anclados y orientados por las estructuras de los
residuos de los dominios variables (Figura 4).
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Figura 4. CDRs de las regiones variables (HV = regiones hipervariables)
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anticuerpos policlonales resultantes puede entonces reconocer una variedad de eptopes
sobre el antgeno, el cual puede ser una caracterstica de uso especial en algunos
procedimientos experimentales (Figura 5). Debido a que esta mezcla de anticuerpos
policlonales reacciona con mltiples eptopes sobre la superficie del antgeno, ellos pueden
ser ms tolerantes de cambios menores en el antgeno, por ejemplo, polimorfismo,
heterogeneidad de glicosilacin o ligera desnaturalizacin, que los anticuerpos
monoclonales (homogneos).
Dependiendo del antgeno que se haya usado para crear el anticuerpo, uno puede usar
anticuerpos policlonales para identificar protenas de alta homologa con la protena
inmunognica o para escoger de la protena blanco en muestras de tejido de otras especies
que el inmungeno. A lo largo de la misma lnea, esto es especialmente importante cuando
se trabaja con anticuerpos policlonales instruirse acerca del inmungeno que ha sido usado
para la produccin del anticuerpo policlonal y el potencial para indeseables reacciones
cruzadas dentro de la misma muestra. Pptidos inmunognicos son frecuentemente usados
para generar anticuerpos policlonales que centran un nico eptope, especialmente para
familias de protenas de alta homologa.
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tratamientos qumicos del antgeno que los anticuerpos policlonales. Esto puede ser
compensado por el uso de dos o ms anticuerpos monoclonales del mismo antgeno.
Tcnicas inmunoqumicas
Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se
basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un
Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los
fenmenos de precipitacin, aglutinacin y otros mecanismos indirectos (marcaje con
fluorescena, con radioistopos o con enzimas) hacen que estos mtodos se empleen
ampliamente.
Dado que los antgenos y anticuerpos se definen por sus interacciones mutuas, uno de ellos
puede utilizarse para cuantificar al otro. Si disponemos de una solucin de un anticuerpo
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monoclonal, podemos definir su afinidad y especificidad con considerable confiabilidad y,
si est en estado puro y en su conformacin nativa, conoceremos que la concentracin de
anticuerpos es la misma que la de la inmunoglobulina, en mg/mL u otra unidad. Cuando se
determina el contenido de anticuerpos en un antisuero, el problema es diferente debido a
que la fraccin inmunoglobulina esta compuesta de una serie enorme de molculas en
cantidades y afinidades variables.
Los sueros pueden compararse de acuerdo con su contenido de anticuerpos, ya sea por la
determinacin de cuantos anticuerpos se unen al antgeno en una dilucin fija del suero o
por la comprobacin de una dilucin seriada del suero para comprobar a que nivel una
cantidad estndar de antgeno es suficiente para dar un resultado positivo de la unin. ste
es denominado titulo de anticuerpos. Para tomar un ejemplo, un suero podra diluirse,
digamos, 10,000 veces y aun dar una prueba de aglutinacin positiva. Este titulo de
1:10,000 permite realizar una comparacin con otro suero mucho ms dbil que solo
posea un titulo, digamos 1:100. Ntese que el ttulo de un suero dado variar de acuerdo
con la sensibilidad de la prueba, ya que se necesitan cantidades mucho ms pequeas de
anticuerpos para unirse al antgeno cuando la prueba posee una alta sensibilidad, como la
aglutinacin, que en el caso de una prueba de baja sensibilidad, como la precipitacin, la
cual requiere concentraciones altas del producto antgeno-anticuerpo.
Existen diversos mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin Ag-
Ac (Tabla 3).
As tenemos:
1. Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos e encuentra unido o formando parte de
clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el
aglutinado celular o bacteriano formado.
2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el
anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac
por la fluorescencia emitida.
3. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo
radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad
emitida.
4. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para
obtener Acs y Ags puros.
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5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de
antgenos y anticuerpos especficos.
Tcnicas de precipitacin
Los sueros contienen con frecuencia hasta el 10% de anticuerpos no precipitantes, los que
son efectivamente monovalentes debido a la presencia asimtrica de oligosacridos en uno
de los brazos de unin al antgeno de la molcula de anticuerpo, que bloquea de modo
estereoqumico el sitio de combinacin. Asimismo, los precipitados francos solo se
observan cuando los antgenos, y en particular los anticuerpos, estn presentes en
concentraciones bastante grandes. Por lo tanto, cuando se forman los complejos que no
precipitan de manera espontnea, deben aplicarse mtodos ms sofisticados para estimar el
nivel de anticuerpos.
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una nubosidad o turbidez, que puede determinarse por dispersin angular anterior de una
fuente de luz incidente (nefelometra). La mayor sensibilidad puede obtenerse mediante el
uno de una luz monocromtica proveniente de un lser y con el agregado de polietilenglicol
a la solucin, de modo tal que aumenta el tamao del agregado. En la practica, la
nefelometra se aplica ms a la deteccin de antgenos que a la de anticuerpos.
1. Tcnica de precipitacin
La precipitacin es mxima all donde la proporcin entre ambos es ptima (parte central
de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y
derecha de la curva respectivamente) Este tipo de reaccin no es muy utilizado al requerirse
grandes concentraciones de antgeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado
formado.
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Esta tcnica se realiza en placas de agar en donde se practican pocillos (Figura 8), en uno
de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el
anticuerpo preparado frente a la sustancia que se quiere identificar.
3. Tcnica de inmunoelectroforsis
Esta tcnica puede aplicarse a antgenos que migran hacia el polo positivo en la
electroforesis en agar (si es necesario, los antgenos pueden sustituirse por grupos con carga
negativa para lograr este fin). El antgeno y el antisuero se colocan en orificios realizados
en el agar y se les aplica una corriente elctrica (Figura 10). El antgeno migra de manera
progresiva a la zona del anticuerpo donde sucesivamente se une ms y ms a las molculas
del anticuerpo, en esencia con un aumento artificial de la concentracin efectiva de
anticuerpo y, en consecuencia, forma una lnea de precipitina.
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Figura 9. Inmunoelectroforesis de suero humano normal frente a anti IgG (B) y
antiinmunoglobulinas (C)
Esta tcnica se basa en la difusin cuando un antgeno difunde desde un orificio al agar que
lleva incorporado un anticuerpo especfico, en un comienzo esta presente en una
concentracin relativamente alta y forma complejos solubles; al difundir el antgeno se
genera un gradiente de concentracin, a medida que el antgeno difunde ms, la
concentracin disminuye de modo continuo hasta que se alcanza el punto en el cual los
reactantes estn ms cerca de las proporciones ptimas (zona de equivalencia), el
inmunocomplejo se insolubiliza y se forma un anillo de precipitacin.
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Este anillo de precipitacin es fcilmente visible y las concentraciones antignicas estn en
relacin directa con el rea del crculo de precipitacin (Figura 11), cuanta ms alta es la
concentracin del antgeno, mayor es el dimetro del anillo.
A esta tcnica tambin se le conoce como cuantificacin por inmunodifusin radial simple
(SRID). Si se incorporan, digamos, tres estndares de concentracin de antgeno en la
placa, puede obtenerse una curva de calibracin que sirve para determinar la cantidad de
antgeno en las pruebas de muestras desconocidas. Este mtodo fue utilizado de manera
sistemtica en inmunologa clnica, en particular para las determinaciones de
inmunoglobulina y tambin para sustancias como el tercer componente del complemento,
transferan, protena C reactiva y la protena embrionaria, -fetoprotena, que se asocia con
ciertos tumores hepticos. Cuando se desea analizar una mayor cantidad de muestras se
tiende a usar la nefelometra.
Tcnicas de aglutinacin
En estas tcnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinacin que producen
los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de
glbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partculas de ltex, etc. Normalmente se utilizan
glbulos rojos (hemoaglutinacin) o partculas de ltex.
25
con un reactivo antiglobulina. De manera similar, la mayor avidez del anticuerpo
multivalente IgM con respecto a la IgG hace que el primero sea ms eficaz como agente
aglutinante, molcula por molcula (Figura 12).
Las reacciones de aglutinacin se utilizan para identificar bacterias y para tipificar los
glbulos rojos; estas reacciones fueron observadas con leucocitos y plaquetas, e incluso con
espermatozoides en cientos casos de infertilidad masculina debida a aglutininas presentes
en el esperma. Debido a su sensibilidad y conveniencia, el uso de la prueba se ha extendido
a la identificacin de anticuerpos contra antgenos solubles que de modo artificial se
adhieren sobre eritrocitos, las partculas de ltex o de gelatina. La aglutinacin de las
partculas de ltex recubiertas por IgG se utiliza para detectar los factores reumatoideos.
Pruebas similares que utilizan partculas recubiertas con antgeno pueden llevarse a cabo en
placas de microtitulacin con fondo en U, donde puede observarse el patrn de
sedimentacin en el fondo de las cubetas; esto proporciona un indicador mas sensible que la
aglutinacin macroscpica. La cuantificacin de grados ms sutiles de aglutinacin puede
lograrse por nefelometra o por un contador Coulter.
Hemoaglutinacin directa
Esta tcnica se emplea habitualmente para la identificacin de los grupos sanguneos y Rh,
para lo cual a la sangre heparinizada se le aaden los antisueros correspondientes: anti-A,
anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habr aglutinacin cuando los glbulos
rojos posean la especificidad del antisuero aadido (Tabla 4). De igual manera se procede
con antisueros anti-Rh para la determinacin de los distintos grupos Rh.
26
Hemoaglutinacin indirecta
Figura 13. Inhibicin por aglutinacin de glbulos rojos con gonadotrofina corinica
(HCG) presente en suero
Tcnicas de inmunofluorescencia
La fluorescencia es una propiedad de ciertas molculas que, al ser irradiadas con energa
electromagntica de longitud de onda adecuada, emiten radiacin de longitud de onda
caracterstica permitiendo su cuantificacin.
27
Una molcula que fluoresce puede ser fijada en el anticuerpo para ser detectada usando luz
UV. Ejemplos de estas molculas son la Fluorescena, Rodamina, Texas Red, Cy3 y Cy5
(Figura 14). En la seleccin de los fluorocromos, uno esta limitado por la disponibilidad del
juego de filtros del microscopio a utilizar. Muchos juegos de filtros son ms compatibles
con rodamina o fluorescena. El Texas red puede ser usado tambin con un juego de filtros
para rodamina.
28
Figura 15. Inmunofluorescencia directa (izquierda) e indirecta (derecha)
Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la protena que se desea detectar
marcados con molculas fluorescentes (Figura 15). Se aprecia si hubo unin del anticuerpo
con el antgeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz
ultravioleta. Este procedimiento (inmunofluorescencia directa) tiene la limitacin del
marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las
sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o clulas con
antisueros anti-antgeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-
inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (inmunofluorescencia indirecta)
Citometra de flujo
La suspensin celular se hace circular en forma de gotas microscpicas. Las clulas pasan
por un campo de deteccin atravesado por un potente rayo lser que produce la dispersin
de la luz y la activacin de la fluorescencia. Mediante sensores especficos se analizan y
cuantifican las poblaciones en estudio en funcin de sus propiedades fisicoqumicas y del
marcaje efectuado. Para la separacin celular este aparato lleva acoplado un sistema que
carga elctricamente las clulas y con placas deflectoras se realiza su separacin (Figura
16). Adems de basarse en la deteccin de la fluorescencia emitida por las clulas
marcadas, tambin lo hace en otras propiedades diferenciales de las clulas en estudio como
tamao (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 17).
29
Figura 16. Representaciones de un citmetro de flujo y separacin celular (FACS,
Fluorescente Activated Cell Sorter)
30
Figura 18. Imagen en dos dimensiones de citometra de flujo (Dot-Plot). Detalle de las
subpoblaciones linfocitarias definidas mediante inmunofluorescencia
La puesta a punto de las tcnicas de citofluorometra, en las que se conjugan los avances de
informtica, rayos lser y anticuerpos monoclonales permite el anlisis fenotpico y
funcional de las clulas T, B y de todas aquellas clulas de las que se disponga de un
antisuero que las identifique. En la tabla 5 se recogen los valores normales obtenidos en
clulas de sangre perifrica.
Figura 19. Imagen en una dimensin (histograma) de una de las fluorescencias medidas en
el dot-plot
31
Tabla 5. Niveles en suero de las inmunoglobulinas (mg/dl)
IgG IgA IgM
Recin nacido 500-1000 0-5 0-10
1-3 meses 300-500 2-16 15-30
4-6 meses 300-500 15-30 35-60
6-12 meses 500-700 30-60 60-180
1 a 2 aos 600-1200 30-175 60-220
2 a 3 aos. 750-1500 70-250 60-250
3 a 4 aos 750-1800 90-390 60-280
4 a 7 aos 800-1800 90-450 60-280
7 a 10 aos 800-1800 90-450 60-280
Adultos 800-1800 90-450 60-280
Marcadores de linfocitos T. En este caso se utilizan los marcadores CD3, CD4 y CD8
presentes de forma especfica en linfocitos T totales y en la subpoblaciones de clulas T de
colaboracin y citotxicas/supresoras respectivamente. En el proceso de activacin celular
T se expresan nuevas molculas de superficie, son principalmente receptores para factores
de crecimiento y proliferacin celular. Entre estos nuevos antgenos de activacin
expresados en la superficie celular se incluyen: a) receptores de interleucinas (como la
molcula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2); b) receptores de
la insulina y de la transferrina (CD71); c) antgenos del Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (CMH) clase II, que no estn presentes en linfocitos T en reposo; y d)
una gran variedad de molculas de superficie, cuya funcin no es totalmente conocida (por
ejemplo, CD26, CD29, VLA-2, CD69).
donde: Ac: Anticuerpo; Ag: Antgeno (sustancia a cuantificar); Ag*: Antgeno marcado
con un istopo; Ag-Ac: Complejos de anticuerpos y antgenos no marcados y Ag*-Ac:
Complejos de anticuerpos y antgenos marcados.
Tcnica de radioinmunoensayo
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Figura 20. Esquema del principio general de radioinmunoensayo para medir hormonas
Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con
cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores
obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentracin de la hormona no marcada a
investigar.
En el RIA directo, a la fase slida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes
concentraciones conocidas de antgeno marcado se incuban con una concentracin
constante de la muestra de la que se desea conocer la concentracin del antgeno en
cuestin.
33
alternativa al RIA en la determinacin de algunas molculas que no pueden ser marcadas
directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios o metastticos
(inmunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local de clulas neoplsicas
(inmunorradioterapia).
Tcnica de enzimoinmunoensayo.
Esta tcnica se utiliza para la medida de hormonas, antgenos de la hepatitis y otras muchas
sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.
Una variante de esta tcnica de gran utilidad se conoce como ensayo en fase slida y est
orientada a la determinacin de anticuerpos frente a un determinado antgeno. Para ello el
antgeno se encuentra fijo a un soporte (por ejemplo tubo de plstico). Al aadir la muestra
con el posible anticuerpo se unir y podr ser detectado aadiendo anti-inmunoglobulinas
marcadas con el enzima.
34
Figura 21. Principio bsico de la tcnica de ELISA indirecto o competitivo y directo o no
competitivo
La diferencia principal entre las tcnicas de RIA y ELISA es que la primera utiliza como
marcador un istopo y la segunda la actividad de un enzima, as el RIA directo y el ELISA
competitivo seran equivalentes, y tambin existira ELISA de inhibicin y ELISA en
sndwich.
35
reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material
no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As
pues cada molcula de antgeno estar unido a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.
Nefelometra
Esta tcnica se basa en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la refraccin que dichos
complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antgeno y el
anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una
relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados (Figura 23).
Figura 23. Esquema de un nefelmetro. Los complejos Ag-Ac formados son cuantificados
por el grado de difraccin.
36
Tabla 6. Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados
Enzima Sustrato Tampn
HRP OPD 10mg/25mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5; aadir L de
(peroxidasa 30% perxido de hidrgeno 30%
de rbano) TMB 2.5mg/250L de DMSO; hasta 25mL con tampn citrato sdico
0.1M pH 6; aadir 5 L de perxido de hidrgeno 30%
ABTS 60mg/100mL de tampn citrato sdico 0.1 M pH 6; aadir 35 L
de perxido de hidrgeno 30%; parar con fluoruro sdico 1.25%;
leer a 405nm
DAB 10mg/20mL de tampn Tris 50mM pH 7.4; filtrar y aadir 20 L
de perxido de hidrgeno 1%
CNP 6mg en 1mL de metanol; aadir 10mL de tampn Tris 50mM pH
7.4; filtrar y aadir 40L de perxido de hidrgeno 30%
AEC 80mg en 1mL de N,N'-dimetilformamida + 200L de tampn
acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y aadir 50L de perxido de
hidrgeno 30%
ASA 80mg/100mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con
1mM NaOH y aadir 10 % por volumen de 0.05% perxido de
hidrgeno; parar con 25L de NaOH 1M
AP PNPP 5mg/5mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1M pH 9.8 +1mM
(Fosfatasa cloruro de magnesio
alcalina) NAPFB (A) 4mg de fosfato de naftol en 200L de dimetilformamida en un
tubo de vidrio, (B) 10mg de sal Fast Blue BB/ 10mL de tampn
Tris 0.05M pH 9.2 - 2mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y
filtrar.
NAPR (A) 4mg de fosfato de naftol en 200L de dimetilformamida en un
tubo de vidrio, (B) 10mg de sal Red BB/ 10mL de tampn Tris
0.05M pH 9.2 - 2mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y
filtrar.
BCIP 1mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol)
beta-G ONPG 2.5mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1M pH 7.0 + 1mM cloruro
de magnesio + 0.1M beta-mercaptoetanol
ureasa BP 8mg/1.48ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100mL con agua
desionizada; aadir 100mg de urea y EDTA a 0.2mM; ajustar el
pH a 4.8 con 1mM NaOH o HCl; almacenar a 4C
PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25L de cada uno de los reactivos
siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1M
tampn fosfato pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidn en agua
destilada caliente, (C) 3.04mg/mL de benzil-penicilina en 0.1M
tampn fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1M
KI solucin stock (en una botella oscura)
37
anticuerpos monoclonales que facilita la estandarizacin del mtodo, la nefelometra est
reemplazando a la SRID para la estimacin de inmunoglobulinas, C3, C4, haptoglobina,
ceruloplasmina y PCR. Es posible analizar muestras de volumen muy pequeo, en el orden
de 1-10L. La turbidez de la muestra puede constituir un problema; es posible realizar
blancos carentes de anticuerpos pero una solucin ms satisfactoria es seguir la proporcin
de formacin de complejos que es proporcional a la concentracin del antgeno, dado que
esto evita la necesidad de un blanco separado (Figura 24). Debido a que los complejos
solubles comienzan a formarse en exceso de antgeno, es importante asegurar que el valor
del antgeno se obtuvo en un exceso de anticuerpo en la cual se incluye ms antgeno.
38
Seleccin de clulas unidas a un anticuerpo
Es un mtodo fcil, rpido y no muy costoso. Este mtodo presenta muchas aplicaciones no
slo en Inmunologa sino tambin en Microbiologa, utilizando bolas unidas a anticuerpos
frente a un determinado microorganismo; en Biologa Molecular para aislamiento de DNA
y mRNA utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de
oligonucletidos respectivamente. Tambin se pueden usar para la purificacin de protenas
si se unen las bolas a anticuerpos especficos.
39
absorbente de afinidad mediante la ruptura de los enlaces antgeno-anticuerpo por
variaciones de pH o por el agregado de iones caotrpicos como el tiocianato (Figura 26).
Del mismo modo, puede utilizarse un antgeno a partir de una mezcla de donde puede
purificarse por elusin.
Inmunoprecipitacin e inmunoblotting
40
1. Marcaje del antgeno (opcional)
2. Preparacin de las muestras: Lisis de las clulas para liberar el Ag
3. Formacin del complejo Ag-Ac
4. Precipitacin de los complejos Ag-Ac
5. Purificacin de los inmunocomplejos
6. Anlisis
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Figura 27. Tcnica de inmunoblotting. Consiste en la separacin electrofortica de
protenas virales, y posterior revelado con anti-IgG marcada con peroxidasa
Hay sin embargo otros mtodos de transferir o aplicar protenas sobre una membrana. El
ms sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequea gota de una solucin
concentrada sobre la membrana. La absorcin de la gota provoca la adhesin de la protena
a la membrana, quedando en forma de una mancha o 'dot' (es el caso del 'dot blot'. Existen
dispositivos que facilitan la aplicacin de las protenas directamente a la membrana,
aplicando una succin que facilita la penetracin de la solucin, y reciben los nombres de
'dot blot' o 'slot blot' en funcin de que la protena quede aplicada en forma de una gota
circular o de una lnea (Figura 28).
Figura 28. Esquema de una aparato de aplicacin directa de soluciones de protena sobre
una membrana (dot blot/spot blot)
Trabajar con las protenas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre el emplearlas
dentro del propio gel:
42
las membranas son mucho ms fciles de manipular que el propio gel
Transferencia capilar
Transferencia por difusin
Transferencia electrofortica ('electroblotting')
Una protena especfica puede ser identificada y visualizada en un Western blot empleando
tcnicas de inmunodeteccin (tcnicas que emplean la capacidad de reconocimiento de los
anticuerpos a sus antgenos). En Western blot se emplea comnmente el sistema de
inmunodeteccin indirecta que se representa en la figura 29. En este mtodo se emplea un
anticuerpo primario para localizar la protena de inters. Un segundo anticuerpo, marcado
con un enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero, se emplea para
localizar donde se formaron los complejos antgeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario
se puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una seal detectable (por
ejemplo una seal sobre una pelcula radiogrfica o una mancha de color en el filtro). En
ocasiones se emplean en lugar del anticuerpo secundario protena A o protena G.
Bloqueo de la membrana
Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes, y todas ellas son efectivas. El factor
esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de
deteccin empleado. Por ejemplo, las soluciones de bloqueo que contienen leche desnatada
contienen una gran cantidad de carbohidratos complejos, y por ello deben descartarse
cuando se van a emplear anticuerpos que reconocen determinantes en carbohidratos, o por
ejemplo se ha de evitar el uso de suero completo si en la deteccin se emplea protena A o
protena G.
43
Figura 29. Mtodos de deteccin en Western blot
Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de deteccin
son las soluciones de leche desnatada y las soluciones de albmina srica bovina (BSA).
Tambin se recomienda el bloqueo en Tween-20 si hay demasiado 'background'. Sin
embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no inicos como Tween-20 pues
pueden solubilizar las protenas transferidas al filtro.
44
Habitualmente se emplean tcnicas de tincin de protenas sobre el filtro como control de la
transferencia. Existen diferentes mtodos para teir todas las protenas presentes en el filtro,
pero los que ms inters despiertan son los mtodos de tincin de protenas especficas a
partir de mezclas complejas separadas en geles y transferidos a filtros, son los mtodos de
tincin especficos, usualmente basados en mtodos inmunoqumicos.
Colorantes
Los colorantes que permiten teir las protenas en los geles de poliacrilamida no son
utilizables en los filtros pues se unen inespecficamente a stos. Para teir las protenas en
los filtros se emplean: Ponceau S, Tinta china o Negro amido.
El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen negras sobre un
fondo azul claro. Despus de la tincin se destie con una solucin de metanol/cido
actico. Este mtodo de tincin es incompatible con la inmunodeteccin posterior.
Este mtodo de tincin se basa en la afinidad de la estreptavidina por la biotina. Los grupos
amino primarios y secundarios de las protenas unidas a la nitrocelulosa se pueden
biotinilar empleando un derivado N-hidroxido succinimida de la biotina que contiene un
brazo espaciador hidrofbico. Un lavado posterior elimina el exceso de biotina y despus se
bloquea la membrana con una solucin de leche en polvo. Las protenas biotiniladas pueden
ser detectadas empleando un complejo preformado de estreptavidina-enzima y el sistema de
deteccin de la actividad enzimtica (Figura 30).
Existen productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que acta como colorante
para protenas sobre filtros. Se trata de una solucin coloidal estabilizada de oro a pH 3. A
este pH las partculas de oro estn cargadas negativamente y se unen especficamente a las
protenas. No se puede usar sobre membranas de Nylon pues se une no especficamente a
las cargas de la membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de
amplificacin de seal. Este mtodo tiene una sensibilidad similar al de la tincin con plata
de los geles.
45
Figura 30. Deteccin de protena total en un Western blot usando biotina-estreptavidina
Figura 31. Esquema del principio bsico del BIAcore. SPR obtenido por reflexin total interna
en una interfase entre vidrio-metal. El instrumento permite el registro de las interacciones en tiempo
real entre las macromolculas (Y invertidas) depositadas en la superficie del biosensor y las
molculas que fluyen por el canal (esferas pequeas)
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En el BIAcore, las interacciones entre biomolculas cambian la concentracin del soluto y
por tanto el ndice de refraccin en la zona de la interaccin. El fenmeno SRP permite
medir los cambios de masa producidos en una superficie entre la molcula unida a la
misma y otras en suspensin, en tiempo real, sin necesidad de marcaje y de manera
totalmente independiente a la naturaleza de las molculas que interaccionan.
Aplicaciones principales
Hay otros modos para detectar el complejo antgeno-anticuerpo una vez que ste se ha
formado, adems de los descritos en los apartados anteriores. Son, por ejemplo, las tcnicas
basadas en el marcaje de anticuerpos con ferritina u oro coloidad, de gran utilidad en
microscopa electrnica.
La tcnica de anticuerpos marcados con ferritina se basa en el hecho de que casi el 25% de
esta molcula est formada por hierro que, al ser opaco a los electrones, puede ser
detectado en microscopa electrnica. Los anticuerpos pueden ser combinados a la ferritina
(u otras protenas) mediante ligandos bivalentes como el 1,3-difluoro-4,6-dinitrobenceno o
la bencidina bidiazoica entre otros.
47
electrones. Estas tcnicas son de gran utilidad en inmunohistologa e inmunocitologa
humana, animal y vegetal aplicado directamente sobre clulas o secciones de tejidos.
Tambin estn tomando cada vez mayor auge las tcnicas quimioluminiscentes. La
quimioluminiscencia consiste en trminos generales en la produccin qumica de la luz.
Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al
absorber la energa de una reaccin qumica oxidativa, son colocadas en un estado de
excitacin electrnica. La emisin de luz se produce al volver a su estado inicial y la
energa qumica absorbida se cede en forma de fotones fcilmente cuantificables con un
fotodetector. Los marcadores quimioluminiscentes constituyen una alternativa al uso de
istopos radiactivos en el inmunoanlisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de
gran estabilidad y la emisin de luz slo se produce cuando se provoca la reaccin
oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes.
Southern Blot
48
fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestin con enzimas de restriccin. La
separacin se hace mediante electroforesis y despus este DNA es transferido a membranas
de nylon o nitrocelulosa (blot). Despus, para la identificacin de la banda que interesa se
realiza un proceso llamado hibridacin, en el que la membrana es "incubada" con un
fragmento de DNA complementario al gen de inters (sonda) previamente marcada,
generalmente con un istopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante
autoradiografa la banda en la cual se ha producido unin (Figura 33). La tcnica de
Northern blot permite estudiar ARN en forma anloga al Southern blot.
La tcnica consiste en preparar cortas secuencias de DNA de una sola hebra, llamadas
sondas, que son complementarias de las secuencias de DNA que se quieren marcar y
examinar. Estas sondas se marcan con molculas fluorescentes (p. ejemplo con biotina o
fluorescena). Estas sondas se hibridan o unen al DNA complementario y, como estn
marcadas con molculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se
encuentran (Figura 34). A diferencia de otras pruebas utilizadas para estudiar los
cromosomas que requieren que las clulas se encuentren en divisin activa, la hibridacin
fluorescente in situ puede ser llevada a cabo en clulas no activas
49
Sondas alfoides o centromricas: son sondas que contienen secuencias complementarias
de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas.
Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado
de manera distinta, con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el nmero correcto
de cromosomas o si tiene un cromosoma extra
FISH de Metafase
Esta tcnica puede usarse sobre clulas en metafase para detectar microdeleciones
especficas ms all de la resolucin de la citogentica de rutina o para identificar material
extra de origen desconocido. Puede tambin ser de ayuda en casos donde es difcil
determinar mediante la citogentica de rutina si un cromosoma tiene una delecin simple o
est implicado en una reorganizacin sutil o compleja. Adems, FISH de metafase puede
detectar algunos de los reordenamientos especficos que se observan en ciertos cnceres.
FISH de Interfase
La FISH se puede usar sobre clulas en interfase para determinar el nmero de copias de
uno o varios cromosomas, as como para detectar algunas reorganizaciones especficas que
son caractersticas de ciertos cnceres. La ventaja principal del FISH de interfase es que se
puede realizar muy rpidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere
crecimiento de las clulas.
Un buen ejemplo es el ensayo de Prueba de Aneuploida, que se realiza sobre clulas del
fluido amnitico cuando hay una fuerte indicacin clnica de una de las trisomas ms
comunes. Se desnaturalizan los ncleos de la muestra, se hibridan con sondas especficas
para los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, y los resultados se obtienen comnmente en 24
horas. La prueba de aneuploida suele incluir tambin una citogentica de rutina para
confirmar los resultados o detectar cualquier anomala no detectada por la FISH de
interfase.
50
PCR in situ
El PCR in situ es una reaccin en cadena de polimerasa que tiene lugar dentro de la clula.
La amplificacin en el PCR in situ puede ser llevada a cabo sobre tejidos o clulas fijas
(Figura 35).
Los mtodos de hibridacin y PCR han sido empleados para examinar la expresin y
deteccin de cada gen afectado durante la patognesis. Aunque ambas tcnicas son bastante
usadas, la desventaja de estas tcnicas es que estn enfocados a la expresin celular y al
estudio de poblaciones. Las secuencias de cidos nucleicos son aisladas de una poblacin
de clulas que contienen un numero suficiente de molculas que se detectan directamente
por tcnicas de hibridacin estndar, o, cuando una subpoblacin contiene una sola copia
de la secuencia de cidos nucleicos, la molcula es amplificada por PCR y detectada
despus de la amplificacin.
51
1) la linearidad de la molcula blanco
2) la carencia de una secuencia complementaria prxima a la secuencia blanco mecanismo
de la reaccin
Mecanismo de la reaccin
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