La Universidad del Zulia

Facultad Exp. De Ciencias

Divisin de Extensin
Muestras clnicas para el diagnstico bacteriolgico
Contenido prctico.

1
 Prctica No 1. Observacin, cultivo, aislamiento e identificacin de Bacterias.
Prof. Ricardo Alonso Silva A.
INTRODUCCIN
Las bacterias son microorganismos procariotas
cuyo tamao oscila entre 0,2 y 5,0 micras. Por esta
razn, solo son observables al microscopio. La
observacin microscpica constituye el primer paso
en el examen bacteriolgico, permitiendo conocer
la morfologa, disposicin espacial, movilidad,
presencia de flagelo, capsula o esporas bacterianas.
I PARTE.- OBSERVACION:
Existen dos mtodos mediante los cuales los
cultivos bacterianos o los microorganismos
presentes en muestras clnicas pueden ser
examinados en el microscopio:
1. Estado viviente.
2. En estado fijo.
1. En estado viviente: Permite la observacin
de las bacterias al estado vivo, estudiar su
morfologa y particularmente su movilidad.
Se logra su visibilidad debido al diferente
ndice de refraccin entre las bacterias y el
medio en que estn suspendidas. Sin
embargo mediante esta tcnica las
bacterias vivas se observan con dificultad al
microscopio ptico debido a la falta de
contraste entre ellas y el medio que las
rodea. Esta desventaja se supera con el uso
de tcnicas microscpicas especiales que
permiten incrementar el contraste sin
alterar al microorganismo. Algunas de esta
tcnica son la microscopia de campo
oscuro y la de contraste de fase.
Para observar un microorganismo en estado
viviente se pueden realizar dos tipos de montaje:
A.- Montaje hmedo entre lmina y laminilla: En
este caso se coloca una gota de la preparacin
sobre una lmina portaobjeto y luego se cubre con
una laminilla. En el examen al fresco entre lmina y
laminilla es posible incrementar el contraste entre
la suspensin y el medio que las rodea, mediante el
empleo de soluciones como: tinta china, azul de
metileno y solucin de lugol. Su empleo permite
contrastar ciertas estructuras bacterianas tales
como las esporas y la capsula de bacterias
capsuladas o la presencia de leucocito, huevos y
quistes de parsitos en un examen al fresco de una
muestra de heces; sin embargo el empleo de estas
soluciones pudiera ocasionar la muerte del
microorganismo por lo tanto este examen sera al
fresco pero no en estado viviente.
B.- Montaje de la gota colgante: requiere de una
lmina portaobjeto excavada. La gota de la muestra
se coloca en la laminilla y se invierte sobre la
excavacin quedando, como su nombre lo indica
gota colgante
2. En estado Fijo: Debido a que el ndice de
refraccin de las bacterias es similar al de la
mayora de los medios de suspensin
acuosa, las clulas bacterianas no se ven
con facilidad a menos que estn teidas o
coloreadas. Para esto se utiliza la
observacin en estado fijo, tcnica en la
cual los microorganismos no estn vivos ya
que se emplea calor para la fijacin de las
bacterias a una lmina portaobjeto.
En bacteriologa se utilizan diferentes tipos de
colorantes que se clasifican en:
1. Colorantes Naturales: aquellos que son
extrados de un animal (carmn) o de una
leguminosa (ndigo).
2. Colorantes Artificiales: aquellos que son
producidos o deridivados artificiales, los
cuales se clasifican en:
a. Bsicos: con afinidad por el ncleo.
Ejm: azul de metileno, cristal violeta de
genciana, safranina, otros.
b. cidos: con afinidad por el citoplasma.
Ejm: eosina, cido pcrico y otros.
c. Neutros: aquellos que se asocian al
colorante bsico y cido, poseen las
propiedades de ambos. Ejm: eozinato
de azul de metileno.
En bacteriologa se recurre casi exclusivamente a
los colorantes bsicos que tien bien las bacterias
2
en las cuales la sustancia nuclear (ADN) y el ARN se
encuentran difundidos en toda la estructura
bacteriana. De estos colorantes se utilizan por lo
general soluciones hidroalcohlicas las cuales
pueden ser favorecidas en su poder de penetracin
y fijacin a la bacteria mediante el empleo de
sustancias conocidas como mordientes (solucin
iodo-saturada de lugol, cido tnico, cido fnico).
Cuando en una tcnica de coloracin se usa un
MORDIENTE, la coloracin es ms rpida, ms
intensa y ms duradera.
Existen diferentes procedimientos para colorear,
los cuales varan en el tipo y nmero de colorantes
empleados y la afinidad que tengan por los
componentes celulares. Si el colorante penetra y se
combina con los componentes celulares dejando a
la clula coloreada, se le denomina COLORACIN
POSITIVA. Cuando el colorante no penetra y se
queda fuera de la clula contrastndola con el
medio que la rodea, se habla de COLORACIN
NEGATIVA.
Por otra parte, las COLORACIONES POSITIVAS se
pueden clasificar en:
1. Coloracin simple: Se usa un solo
colorante, el procedimiento es sencillo y de
un solo paso; todas las bacterias toman el
color del colorante. Esta tcnica es de
utilidad cuando solo se requiere
determinar la presencia de bacterias en
una muestra, o la morfologa o disposicin
espacial de las mismas.
2. Coloracin diferencial: se basa en las
diferencias de la composicin qumica de
algunas estructuras de la clula bacteriana
(pared celular, citoplasma, esporas). En
esta tcnica de coloracin se emplean dos
tipos de colorantes, uno primario y uno
secundario o de contraste. Las coloraciones
diferenciales comnmente empleadas en
bacteriologa son: la coloracin de Gram, la
colo0racin de alcohol cido resistente y la
de esporas. De ellas la ms importante es la
coloracin de Gram ya que permite dividir
a las bacterias en dos grandes grupos:
Gram negativas y Gram positivas,
constituyendo la base de la clasificacin
taxonmica de las mismas.
II PARTE .- SIEMBRA Y AISLAMIENTO.
En la naturaleza, los gneros y especies bacterianas
no se encuentran aislados sino que los mismos
estn mezclados, es por ello que para su
identificacin se hace necesario separarlos, este
procedimiento en bacteriologa se conoce como
AISLAMIENTO u obtencin de un cultivo puro, el
cual se define como aquel que se desarroll a partir
de una clula nica.
Para aislar una especie bacteriana en particular o
de inters, es necesario sembrarla en un medio
de cultivo apropiado para su desarrollo y
multiplicacin, siguiendo ciertas reglas donde se
debe evitar al mximo la contaminacin del
material por los microorganismos ambientales.
La siembra de un medio de cultivo con una cepa
bacteriana, se hace generalmente con dos
objetivos:
a. AISLAMIENTO: consiste en separar los
diferentes microorganismos que se
encuentran en una muestra o producto
contaminado.
b. REPIQUE O PASE: consiste en trasladar una
especie bacteriana de un medio de cultivo
a otro para obtener un cultivo puro para su
respectiva identificacin, clasificacin,
determinacin del nmero de bacterias en
una muestra y otros.
La tcnica de siembra ms empleada para el
aislamiento de una determinada especie
bacteriana, es la siembra por estras o agotamiento
usando un asa de siembra y agar en placa de Petri.
CULTIVO DE BACTERIAS
Cualquier estudio de una poblacin bacteriana
comienza con la observacin al microscopio y el
cultivo de la misma. Para aislar e identificar una
poblacin de bacterias se debe basar en el
conocimiento de sus necesidades nutricionales,
temperatura ptima de crecimiento, sus productos
metablicos, y su sensibilidad o resistencia a las
drogas antimicrobianas.
3
Haciendo uso de estos conocimientos, se puede
incluso inhibir el desarrollo de aquellas poblaciones
bacterianas que no interesan, es por ello que se
debe seleccionar l o los medios de manera tal que
permiten el desarrollo ptimo de aquella poblacin
en la cual se est generando el inters.
Los medios de cultivo constituyen las herramientas
ms importantes de la tcnica bacteriolgica. Su
objetivo fundamental es conservar los grmenes en
un material estril, lquido o slido, adecuado para
el desarrollo microbiano, adems que se utilizan
para el estudio de las propiedades bioqumicas de
los microorganismos. Los medios de cultivo se
dividen en: medios bsicos y medios especiales,
que pueden ser: lquidos, slidos o semislidos,
naturales o artificiales.
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
La identificacin consiste en ubicar una bacteria en
su correspondiente gnero y especie y cuando es
posible, determinar incluso subespecie o serotipo.
El examen directo nos permite establecer si una
bacteria es un bacilo o un coco, si es gramnegativa
o grampositiva, con movilidad y sin esporas, pero
estas caractersticas no son suficientes para
identificar la mayora de las especies bacterianas.
Pese a su simplicidad morfolgica, las bacterias son
muy diferentes a su fisiologa, es decir tienen
necesidades y capacidades diferentes. Por ejemplo,
su reaccin de oxgeno y la necesidad de que ste
est presente en pequeas cantidades durante su
crecimiento, refleja las distintas las necesidades
metablicas fundamentales que son fciles de
medir, en consecuencia, para la identificacin de
las bacterias se requiere de las caractersticas
morfolgicas y fisiolgicas.
Para establecer las caractersticas fisiolgicas de
una poblacin bacteriana se hace uso de las
llamadas PRUEBAS BIOQUIMICAS, que no son ms
que el cultivo de las bacterias en diferentes medios
y condiciones de crecimiento que nos permita
establecer si una bacteria fermenta un
determinado carbohidrato, si puede crecer en altas
concentraciones de sal, si requiere o no de oxgeno
para su crecimiento y otras caractersticas de la
bacteria en estudio.
Toda identificacin bacteriana involucra los
siguientes pasos:
1. Obtencin de un cultivo puro.
2. Examen al microscopio de un frotis teido
por coloracin Gram,
3. Determinacin de las caractersticas
nutricionales.
4. Realizacin de pruebas primarias con las
cuales puede determinar el gnero, grupo
de gneros o en algn caso familia a la que
pertenece una determinada bacteria
aislada. Las pruebas primarias son:
catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de
glucosa, crecimiento en aerobiosis o
anaerobiosis y movilidad.
5. Realizacin de pruebas secundarias y
terciarias a efectos de llegar a especie.
Estas pruebas dependern del gnero o
familia determinado. Ejemplo: produccin
de pigmentos, produccin de indol a partir
de triptfano, produccin de coagulasa, de
fenilalanina, deaminasa y citrato
permeasa, entre otras.
Serotipo: Cuando las pruebas bioqumicas no son
concluyentes, se recurre al uso de antisueros
especficos. Los antgenos bacterianos pueden ser
somticos (O) que correspondas al lipopolisacrido
(LPS) de la membrana externa de la pared celular
de las bacterias gramnegativas, flagelares (H) que
son antgenos de naturales proteica y antgenos (K),
que son antgenos externos en relacin al antgeno
(O) presentes en algunas de las enterobacterias;
algunos antgenos K son polisacridos (E. coli,
Klebsiella) y otros son de naturaleza proteica. Los
antisueros se identifican con esas letras (O, H y K) y
el numero o letra del antgeno correspondiente. A
nivel comercial existen antisueros para la
caracterizacin de Salmonella, Shiguella, E. coli
enteropatgena, y Haemophilus influenzae, entre
otros.
4
OBJETIVO GENERAL MATERIALES Y METODOS

Definir, diferenciar y realizar los procedimientos 1. Tcnica de observacin:

necesarios para el estudio de la morfologa
bacteriana y su identificacin. A. Examen al fresco entre lmina y laminilla

OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Colocar con el gotero una gota de solucin

fisiolgica o una gota de agua del grifo o
Al finalizar la prctica No 1, se deber estar en la una gota de azul de metileno en el centro
capacidad de: de una lmina portaobjeto (Figura 1).

1. Frente a un cultivo bacteriano en un medio

slido:
a. Realizar un examen al fresco entre
lmina y laminilla.
b. Realizar un extendido segn el
procedimiento indicado.

2. Aplicar una coloracin simple sobre

extendidos preparados a partir de un
cultivo slido.
3. Aplicar la coloracin de Gram sobre Figura 1. Una gota sobre lmina portaobjeto limpia.
extendidos preparados a partir de un
cultivo slido. 2. Tomar el cultivo bacteriano de medio
4. Utilizar correctamente el microscopio en la solido (con crecimiento de 24hrs y
observacin de las preparaciones entre asignado a cada estacin prctica) y
lmina y laminilla y preparaciones teidas. observar toda la superficie (Figura 2).
5. Frente a extendidos coloreados:
a. Identificar la forma y disposicin
espacial de las bacterias utilizando el
microscopio.
b. Clasificar las bacterias segn su
afinidad tintorial frente a la coloracin
de Gram.
6. Sealar los pasos esenciales a realizar a
toda identificacin bacteriana. Figura 2. Taco bisel con crecimiento bacteriano.
7. En relacin a las pruebas bioqumicas
utilizadas en la identificacin de bacterias, 3. Como si fuera una pluma tome el asa de
se deber: siembra y esterilcela en la llama del
a. Sealar las caractersticas fisiolgicas a mechero, colocndola verticalmente sobre
evaluar o determinar en cada una de ella hasta el rojo vivo, flamee el mango
ellas. pasndolo horizontalmente por la llama
b. Observar e interpretar, con la ayuda de (figura 3).
la gua prctica, los resultados
obtenidos en cada uno de los medios
de cultivo inoculados.
c. Identificar con la ayuda de tablas de
identificacin, el gnero y si es posible
la especie de la bacteria objeto de Figura 3. Esterilizacin del asa bacteriolgica
estudio.
5
 4. Teniendo el asa de platino en la mano,
retire con esa misma mano la tapa de
algodn, baquelita o rosca, utilizando para
ello el meique y el borde cubital de la
palma de la mano, procurando hacer esta
operacin lo ms cerca posible de la llama
de la llama del mechero; seguidamente
flamee la boca del tubo, introduzca
rpidamente el asa de siembra tomando
con la misma una pequea porcin de una
colonia microbiana o de la pelcula de
crecimiento. Retire el asa de siembra,
flamee nuevamente la boca del tubo de
ensayo y tpelo con la misma tapa que no
se debe soltar durante toda esta operacin
para evitar de esta manera contaminacin
de los cultivos suministrados, los cuales se
encuentran o se deben encontrar puros.
Figura 4. Esterilizacin del asa bacteriolgica y
manipulacin del tubo de ensayo con cultivo en
taco bisel del agente bacteriano suministrado
5. Suspenda en la gota de solucin fisiolgica,
azul de metileno o agua destilada estril
(paso No 1) el contenido del asa de siembra
procurando mezclar suavemente.
Figura 5. Suspensin bacteriana
6. Colocar la laminilla (cubreobjeto) sobre la
suspensin bacteriana, procurando no
tocar con los dedos el material y no formar
burbujas de aire. Presionar suavemente.
7. Enfocar la preparacin en el microscopio
utilizando el objetivo de 10X y luego de
40X.
En aquellos casos que se trate de un medio
lquido, se debe depositar directamente
sobre la lmina portaobjeto una gota del
cultivo extrado con el asa bacteriolgica de
siembra o una pipeta Pasteur previamente
esterilizada.
Cuando se trate de un producto patolgico
(muestra proveniente de un paciente), la
tcnica a seguir depende de su estado
fsico. Si es lquido se procede como si se
tratar de un cultivo en medio lquido y si
es denso, se diluye en una gota de solucin
fisiolgica estril.
B. EXAMEN DE PREPARACIONES TEIDAS
B.1. Preparacin del extendido:
Dependiendo del tipo de material a
examinar se usa asa de siembra, hisopos,
aplicadores u otros.
1. Con el asa de siembra previamente
esterilizada al mechero, colocar una
gota de solucin fisiolgica (Figura 1) o
una gota del agua de grifo en el centro
de una lmina portaobjeto limpia.
2. Procediendo de la misma manera que
en la tcnica descrita anteriormente, se
debe tomas una pequea porcin de la
muestra y extenderla suavemente
sobre la lmina tratando en lo posible
de generar una pelcula delgada y
homognea. El extendido no debe
llegar a los bordes la lmina.
3. Si se trata de un cultivo en medio
lquido, se debe tomar una gota del
mismo con el asa de siembra
previamente esterilizada en la llama
del mechero y se extiende
directamente sobre la superficie de la
lmina.
4. Despus del extendido, se debe dejar
secar la lmina al aire libre.
5. Cuando la preparacin est
completamente seca, se procede a la
6
 fijacin pasando suavemente la lmina
sobre la llama del mechero dos o tres
veces con el lado de la preparacin
hacia arriba, cuidando de no
sobrecalentar.
6. Una vez fijada la preparacin la lmina
est lista para ser coloreada.
En bacteriologa, se emplea rutinariamente
el calor para la fijacin del extendido, el
cual tiene por objeto hacer que las
bacterias se adhieran al vidrio del
portaobjeto, de esta manera se mantiene
su morfologa y se logra la muerte del
microorganismo. Esencialmente la fijacin
consiste en coagular las albuminas por
efecto del calor.
B.1.1 Coloracin Simple: sobre la lmina
previamente fijada se debe verter unas
gotas del colorante seleccionado por los
participantes de cada estacin (violeta de
genciana o safranina o azul de metileno) y
se deja actuar sobre el frotis por un lapso
de 1 o 2 min. Posterior a ello, se retira el
colorante con abundante agua de grifo o
picetas, se procede a dejarlo secar al aire
libre y una vez que se encuentre
completamente seco se procede a su
observacin al microscopio (10X, 40X y
100X). Solo se adicionar aceite de
inmersin a la lmina cuando se hace la
visualizacin a 100X.
B.1.2. Coloracin de Gram: Se debe cubrir
el extendido (frotis) con violeta de
genciana (1min), transcurrido el tiempo se
lava con abundante agua y posterior al
lavado se coloca Lugol por un (1) minuto,
se vuelve a lavar con abundante agua y se
coloca por un lapso de 15 segundos
alcohol-acetona y se vuelve a lavar y
finalmente se adiciona la safranina por un
lapso de 25 a 30 seg. Transcurrido todo el
proceso de coloracin de Gram, se deja
secar y se hace la visualizacin respectiva
al microscopio, siguiendo el protocolo
como en el paso anterior.
La razn por la cual algunas bacterias retienen
colorantes bsicos (cristal violeta) y otros no,,
est relacionada con la estructura de la pared
celular, el tamao de los poros y la propiedad de
permeabilidad de la envoltura celular intacta.
De acuerdo a la coloracin de Gram, se pueden
visualizar organismos Gram positivos u organismos
Gram negativos. Los grampositivos retienen el
colorante primario tindolas de purpura o morado
en tanto que los gramnegativos retienen el
colorante secundario tindolas de rosado.
C. PRUEBAS BIOQUMICAS
Si bien existen una gran variedad de pruebas
bioqumicas que se emplean con la finalidad de
identificar los agentes bacterianos hasta gnero o
especie, en esta seccin se utilizaran las que se
aplican con mayor frecuencia.
IPARTE. Observacin y complementacin de
resultados.
Transcurrido el periodo de siembra y replicacin en
las distintas pruebas realizadas, se proceder a
tomar nota de los resultados y a complementar
otras pruebas restantes. Entre los caldos
inoculados se encontraran: caldo lactosado y
glucosado, medio OF, agar Simons Citrato, agar
SIM, agar urea, TSI y plasma citratado.
Con los siguientes medios: Caldo MR-VP, SIM y TSI,
se deben realizar las siguientes pruebas:
Prueba Rojo de Metilo (RM): con una
pipeta estril, se debe tomar un alcuota de
aproximadamente 2,5mL del caldo MR-VP
de 48 hrs de incubacin y se deben verter
en un tubo de ensayo estril. Posterior a
ello, se deben adicionar 10 gotas del
indicador Rojo de Metilo y se debe agitar.
Se debe observar si el indicador se
conserva rojo o no.
Prueba de Vogues Proskauer (VP): el
alcuota restante del caldo MR-VP, se le
deben aadir 0,5mL de solucin A de
Barrits y 0,5mL de solucin B de Barrits.
Se debe agitar vigorosamente y se debe
dejar reposar durante unos minutos.
Produccin de Indol: Se debe aadir de 10
a 12 gotas del reactivo de Kovacs sobre la
superficie del agar SIM, el mismo se debe
7
 agitar y dejar reposar por unos minutos y
anotar los resultados.
Prueba de la Catalasa: Con un asa estril se
debe tomar una pequea porcin del
crecimiento obtenido en TSI y se debe
colocar sobre una lmina portaobjeto.
Posterior a ello, se debe aadir de una a
dos gotas de perxido de hidrogeno, y se
observa si hay o no desprendimiento de
burbujas (efervescencia.
IIPARTE. Interpretacin de los resultados.
1. Fermentacin de los carbohidratos: Los
medios empleados en esta prueba
consisten bsicamente en caldo nutritivo
ms 1% del azcar que se desea estudiar y
0,01 g. de azul de bromotimol como
indicador de pH por litro de caldo. La
fermentacin del azcar durante el perodo
de incubacin se evidencia por dos
caractersticas observables en el medio:
cambio en la coloracin del medio y la
presencia o no de gas (CO2) en el tubo de
Durham. Si el medio mantiene su color
original significa que no hubo crecimiento
bacteriano ni cambios en el pH, y la prueba
para considerarse positiva debe tener
cambios de color o turbiedad
conjuntamente con la formacin de
burbujas en el tubo Durham.
2. Oxidacin Fermentacin: El medio OF
permite determinar si un M.O. tiene un
metabolismo oxidativo, fermentativo o
inactivo frente a un determinado
carbohidrato. La formacin de cido se
evidencia por el cambio de color del medio,
de verde a amarillo (+) si este cambio de
color solo se observa en el tubo abierto,
es indicativo de que el M.O presenta un
metabolismo oxidativo frente al
carbohidrato evaluado. Si el cambio de
color se observa en ambos tubos (abierto y
cerrado), significa que el M.O. es capaz de
oxidar y fermentar el azcar. Si no se
observan cambios en ambos tubos, es
indicativo de que el M.O. no usa el azcar
por ninguna va. A este tipo de M.O. se le
conoce como inactivo frente al
carbohidrato evaluado
O/F Interpretacin
+/+ Degradacin fermentativa. Anaerobio
facultativo.
+/- Degradacin oxidativa. Aerobio.
-/+ Degradacin fermentativa anaerobio
estricto.
-/- No degrada el azcar evaluado. Inactivo
frente a carbohidratos.
3. Prueba de Rojo de Metilo-Vogues
Proskauer (MR-VP): Este medio sirve para
realizar dos pruebas que determinan los
productos finales del metabolismo de la
glucosa. Un grupo de bacterias metabolizan
la glucosa por fermentacin cido-mixta; es
decir la glucosa es convertida en piruvato
mediante la gliclisis y este a su vez es
transformado en una mezcla de diferentes
tipos de cidos. Dentro de este grupo hay
bacterias capaces de transformar estos
cidos en un producto alcalino llamado
acetona o acetilmetilcarbinol, que es un
precursor del 2-3-butanodiol, otras
bacterias lo mantienen como tales. Las
reacciones de rojo de metilo (MR) y de
Vogues Proskauer (VP) estn relacionadas
ya que una bacteria produce cidos o
acetonas. Si la bacteria produce cidos, al
aadir el rojo de metilo sta queda de color
rojo, la prueba se considera positiva. En
ausencia de color rojo, la prueba es
negativa. En la prueba VP, la formacin de
un anillo color rojo anaranjado, indica
positividad y si este se llegase a observar
verde cobrizo es indicativo de negatividad.
La prueba de VP debe agitarse
vigorosamente despus de aadido los
reactivos A y B de Barrits ya que la
reaccin se da en presencia de oxgeno.
Resultado MR VP
Positivo Color rojo Color rojo
Negativo Color amarillo Color verde cobrizo
Toda bacteria MR(+) es VP (-).
Una bacteria puede ser MR(-) y VP (-)
Una bacteria MR (-), puede ser VP (+) (-).
4. Utilizacin del citrato: Este agar tiene
citrato de sodio como nica fuente de
carbono y azul de bromotimol como
8
 indicador de pH. Aquellas bacterias que no
metabolicen este compuesto no crecern y
no cambiaran el color del medio y el mismo
permanecer verde, en este caso la prueba
se considera negativa. Si hay crecimiento y
cambio de color del medio de verde a azul
intenso, la prueba es positiva. Esta prueba
tiene como objetivo determinar la enzima
citrato permeasa.
5. Produccin de sulfuro de hidrogeno:
algunos gneros bacterianos son capaces
de producir sulfuro de hidrgeno y los
medios TSI y SIM, son tiles para
detectarlo. La produccin de este
compuesto (H2S) se observa como un
precipitado negro al fondo y a lo largo de la
lnea de puncin a travs del medio. La
formacin de este precipitado se debe a la
produccin de sulfuro de hidrgeno a partir
de los aminocidos sulfurados y es
consecuencia de la reaccin entre el sulfato
de hierro presente en el medio y el sulfuro
de hidrgeno producido por la poblacin
bacteriana para originar sulfuro de hierro.
6. Produccin de Indol: Aquellas bacterias
que poseen la enzima triptofanasa, capaz
de escindir la molcula del triptfano en
indol, piruvato y amonio, lo harn en un
lapso de 48 horas. Si el indol est presente
en el medio, una vez que se aade el
reactivo de Kovas y se deje reposar, se
visualizar la formacin en la superficie del
medio un anillo o capa roja y esto se debe a
la reaccin del indol y el p-
aminobenzaldehido del reactivo de
Kovacs. Si el indol est ausente, se
reflejar una capa o anillo de color verde
en la superficie como resultado de los
reactivos empleados. La enzima
triptofanasa es sintetizada por las bacterias
pertenecientes al grupo entrico y algunas
formas relacionadas.
7. Hidrolisis de la Urea: Las bacterias que
poseen la enzima ureasa hidrolizaran la
urea liberando dos molculas de amonio
(NH3) y dixido de carbono (CO2), esto
originar una reaccin alcalina que har
que el medio cambie de amarillo a rosado
fuerte o fucsia. En indicador de pH, rojo de
fenol, vira de amarillo a rosado fuerte
cuando el pH del medio es superior a 7,5.
Las especies pertenecientes al gnero
Proteus, que se caracterizan por ser
grandes productoras de ureasa, originarn
una reaccin alcalina a las pocas horas de
inoculado en agar. Aquellas bacterias cuya
produccin de ureasa es ms lenta
requerirn de varios das de incubacin.
8. Triple Sugar Iron (TSI): el agar TSI contiene
tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa
en una proporcin 1:10:10,
respectivamente, y el indicador del pH es el
rojo de fenol para evidenciar la
fermentacin de cualquiera de estos
azcares. Adicionalmente contiene sulfato
de hierro para evidenciar la produccin de
sulfuro de hidrgeno indicado por un
ennegrecimiento en el fondo del tubo.
Aquellas bacterias que solo sean capaces
de metabolizar la glucosa, lo harn
inmediatamente originando una reaccin
cida uniforme a travs del tubo (color
amarillo), pero la pequea cantidad de
cido producido por la poca cantidad de
glucosa presente en el medio es oxidada
rpidamente en el bisel el cual revierta a
alcalino debido a las condiciones de
aerobiosis; en contraste, en el fondo del
tubo la reaccin acida persiste por 24hrs o
ms, debido a las condiciones de
anaerobiosis.
Aquellas bacterias que pueden utilizar lactosa o la
sacarosa, producirn grandes cantidades de cido
porque la cantidad de ambos sustratos en el medio
es mayor. Como consecuencia de la reaccin, tanto
el fondo como el bisel adquirirn un color amarillo,
el cual persistir durante el perodo de incubacin
de 24hrs o ms. Las reacciones deben leerse
despus de 18-24hrs de incubacin, ya que estas
pueden o no ser interpretadas correctamente si las
cuas son incubadas por ms de 24hrs.
Bisel y fondo rojo: indica que no hubo
fermentacin de ninguno de los tres
azcares.
Bisel rojo y fondo amarillo: indica
fermentacin de la glucosa.
Bisel y fondo amarillo: Indica
fermentacin de la lactosa y/o sacarosa.
9
 No es posible diferenciar la fermentacin
de estos dos azucares.
9. Prueba de la catalasa: El perxido de
hidrgeno se produce cuando la bacteria
utiliza el azcar por la va oxidativa. Por ser
bacterias lo eliminan mediante la
produccin de la enzima catalasa. La
reaccin se considera positiva si se observa
desprendimiento de burbujas al emulsificar
una pequea porcin del cultivo con el
perxido de hidrgeno. En caso contraria
se considera negativa.
10. Prueba de la cuagulasa: Se emplea para
diferenciar S. aureus, que coagula el
plasma a diferencia de S. epidermidis que
no lo coagula. La coagulacin se puede
observar, dependiendo de la magnitud de
la reaccin, como endurecimiento total del
plasma, formacin de mallas o pequeos
cogulos. La reaccin negativa deja el
plasma igual que cuando se inoculo.
11. Motilidad: En agar SIM se debe observar a
lo largo de la lnea de puncin; si hay
crecimiento solo o a lo largo de la lnea de
puncin, por lo que se considera que la
prueba es negativa. Si el crecimiento se
extiende de la lnea hacia las paredes del
tubo y hacia la superficie del medio, indica
positividad.
ACTIVIDAD PRCTICA
1. Realice un examen al fresco entre lmina y
laminilla a partir de un cultivo slido (tubo
A o tubo B). Tome nota de sus
observaciones.
Morfologa bacteriana: ________________
Disposicin espacial: __________________
Movilidad: __________________________
Observaciones: ______________________
2. Realice una coloracin simple a partir del
cultivo solido suministrado (tubo A o tubo
B), observe al microscopio y tome nota de
sus observaciones.
2.1 Tipo de coloracin: ________________
2.2 Morfologa y disposicin espacial:
___________________________________
3. Realice una coloracin de Gram a partir de
un cultivo slido (tubo A y B
suministrados). Observe al microscopio y
tome nota de sus observaciones.
3.1 Afinidad al Gram: _________________
3.2 Morfologa y disposicin espacial:
_______________________________
4. Inocule los medios de cultivo de la gradilla
que tiene la batera ms grande con el tubo
de ensayo que tiene crecimiento
bacteriano y que se encuentra rotulado con
la letra A. El mismo se debe sembrar en los
medios de: Caldo lactosado, caldo
glucosado, Medio TSI (puncin y estriado),
medio OF (tubo abierto y tubo cerrado),
agar SIM (puncin), agar urea (puncin y
estriado en caso de ser solido), agar citrato
de Simons, Agar MR.
5. Del tubo B sembrar en la siguiente
batera. Caldo glucosado, lactosa, caldo OF,
agar DNAsa, plasma.
6. Para la identificacin bacteriana ver tabla
Merck y confirmar en el sistema ABIS
online.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICA:
Prats G, Microbiologa Clnica, Editorial Mdica
Panamericana, Barcelona 2006.
Gobernado M, Lpez-Hontangas JL. 2003.
Identificacin bacteriana. Enferm Infecc Microbiol
Clin. 21(Supl 2):54-60.
Fernndez A, Garca C, Sez J, Valdezate S.
2010. Mtodos de Identificacin bacteriana en el
laboratorio de microbiologa. EIMC.
Recomendaciones de la Sociedad Espaola de
Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica.
https://www.seimc.org/contenidos/documentosc
ientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-
procedimientomicrobiologia37.pdf
http://www.tgw1916.net/intro.html
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