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UNIVERSIDAD DEL VALLE NORMA: VERSIN:

DEPARTAMENTO DE QUMICA

FECHA DE REVISIN: 28-1-1d

LABORATORIO DE BIOQUMICA

AMINOCIDOS Y PROTENAS I

ELABORADO POR: REVISADO POR: Prof. CAGV APROBADO POR:

Departamento de Qumica

1. OBJETIVOS

En virtud del nivel formativo que el estudiante de qumica deber tener a estas alturas y
cuando no se especifiquen, los objetivos debern ser inferidos por el estudiante a partir
de la lectura de la presente gua.

2. INTRODUCCIN

Los aminocidos (figura 1) son compuestos slidos, incoloros, cristalizables, de elevado

punto de fusin (habitualmente por encima de los 200C), solubles en agua, con
actividad ptica y con un comportamiento anftero.

Figura 1. Estructura de un aminocido. Figura 2. Enlace Peptdico.

En su mayora estn compuestos por un grupo carboxilato libre y un grupo amonio
libre e insustituido unidos al carbono alfa. Los aminocidos son clasificados con base a
las propiedades qumicas de sus cadenas laterales (grupo R). Cuando 2 a ~50
aminocidos se unen a travs de enlaces tipo amida entre -Amino y -Carboxilo
(conocido como enlace peptdico) se forma lo que se conoce como pptido (Figura 2).
Cuando ms de ~50 aminocidos se unen va enlace peptdico formando una
estructura tridimensional compleja y estable, se conforma una protena. Estas son
molculas muy complejas, que tienen diferentes actividades biolgicas, las cuales se
diferencian por la secuencia de los aminocidos que las constituyen.
 Cuantificacin de aminocidos: Para determinar la presencia de aminocidos libres
se utiliza una solucin de ninhidrina, la cual reacciona con todos los aminocidos
para producir un complejo de color azul prpura, con la excepcin de la prolina,
que desarrolla una coloracin amarilla.

Cuantificacin de protena: Por medio de la reaccin de Biuret se puede cualificar y

cuantificar una protena en una muestra problema, debido a la formacin de un
complejo de color violeta entre la protena y el reactivo de Biuret (NaOH y CuSO 4).

3. MATERIAL (a reservar por cada grupo) Y REACTIVOS

Material Baln de 10 mL (1)

Varilla de vidrio (1)
Vaso de precipitados de 50 mL (2) Reactivos
Vaso de precipitados de 100 mL (1) Casena
Vaso de precipitados de 250 mL (1) Gelatina sin sabor
Tubos de ensayo de 20 mL (10) Prolina
Pinaza para tubo de ensayo (1) Glicina
Espectrofotmetro (1) Ninhidrina
Celda para espectrofotmetro (2) NaOH
Gradilla (1) Tartrato sdico potsico
Plancha calentadora y agitadora (1) CuSO4.5H2O
Magneto pequeo (1) (NH4)2SO4
Bao Maria (1) Urea
Pipeta volumtrica de 5 mL (2) HCl (concentrado)
Pipeta graduada de 1 mL (2) Aspartame comercial.
Goteros (3) Etanol 95%.
Jeringa (1) KH2PO4
Escobilln (1) Acetona
Frasco lavador (1)

La concentracin y composicin de cada una de las soluciones empleadas en esta

prctica se encuentra descrita en el Anexo 3.

Procure usar tubos de iguales dimensiones en cada una de las pruebas y que los
volmenes finales de cada prueba sean iguales.

4. PROCEDIMIENTO

4.1. Anlisis Cualitativo (convencin cualitativa 20 gotas 1mL)

Reaccin de Ninhidrina: de modo individual agregue a seis tubos 0,5ml de agua,

de clara de huevo, aspartame y los aminocidos prolina y glicina. Aada a cada
unos de esos tubos ~7 gotas de Ninhidrina (0,025 g/25 mL) y agite muy bien.
Registre observaciones cinco minutos despus. Ponga los tubos posteriormente en
un bao mara en ebullicin durante cinco minutos. Registre sus observaciones.
 Los residuos que contengan ninhidrina deber dejarlos en un recipiente de
desechos exclusivo para esta.
Biuret cualitativo: en tubos de ensayo diferentes adicione 0,5 mL
respectivasmente de: i) agua; disoluciones de ii) glicina; iii) prolina; iii) aspartame
y v) clara de huevo. A cada uno agreguele gota a gota 0,5 mL de disolucin Biuret
A (10 gotas ~0,5 mL) y agite muy bien. Despus aada adems 0,5 mL de la
disolucin B (la que tiene Cu2+) y mezcle bien (hasta que se disuelvan los
precipitados). Anote los cambios que va observando frente al blanco. Es importante
que note las diferencias en intensidad y en tonalidad de colores azules o prpuras
que vaya observando.

Interaccin de protenas con osmolitos, cidos y bases: Esta parte la

trabajar con 1mL de: a) clara de huevo sin diluir y b) con gelatina casena
(escoja una de las dos):

1. En un tubo adicione 1mL de la disolucin de protena y aada gota a gota (mx.

20) HCl 1,25M. Agite. Despus de 5 minutos aada NaOH 1,25M gota a gota
(igual nmero que de HCl) hasta neutralidad y agite. Apunte sus observaciones.
2. En otro tubo adicone 1mL de la disolucin de protena y aada gota a gota
solucin de (NH4)2SO4 (mx. 20) saturada Agite. Despus de 5 minutos aada
urea 6M (iguales nmero de gotas que de (NH4)2SO4) y agite. Apunte sus
observaciones.

Realice lo descrito en 1 y 2 pero invirtiendo el orden de adicin de los reactivos

(excepto la protena que siempre va primero). En esta parte deber hacer 8
ensayos.

Efecto del calor: en un tubo de ensayo agregue 1 mL de disolucin y por aparte de

las diferentes protenas, caliente en un bao de mara (a ebullicn) y describa los
cambios observados.

Efecto de solventes orgnicos: En un tubo de ensayo adicione 0,5 mL de una

disolucin de gelatina (o casena) y en otro tubo 0,5 mL de clara de huevo sin diluir.
En cada uno de ellos agregue gradualmente etanol 95% (mximo 1mL). Agite y
anote sus observaciones. OPCIONALMENTE repita este procedimiento aadiendo
acetona en vez de etanol.

Nota: si hay efecto observable (precipitacin, coagulacin, etc.) y slo en el caso del
efecto de calor y de los solventes, agregue urea 6M gota a gota (mximo 20) al
finalizar los experimentos y agite muy bien con cada adicin; anote sus observaciones.
4.2. Anlisis Cuantitativo de protena por el mtodo Biuret.

Nota: En la experiencia se ha visto que el proceso de dilucin de clara de huevo antes

de la reaccin con Biuret puede introducir errores pues esta tiende a precipitar. Por ello
se ha optado por pesar una CANTIDAD ADECUADA de clara de huevo directamente en
el baln aforado donde se llevara a cabo Biuret, de modo que la absorbancia obtenida
corresponda al valor medio de la curva de calibracin (Grfica 1, vase anexos).

Biuret cuantitativo: en balones aforados de 10mL, adicione 2 mL de las diferentes

diluciones de protina mL (gelatina y/o casena) y pese directamente la masa de clara
de huevo calculada. Posteriormente adicione 2 mL de solucin A, 2 mL de solucin
B mezcle bien y afore a 10 mL con agua. El blanco o control se realiza del mismo
modo pero empleando un volumen de 2 mL del medio en que las protenas fueron
diluidas (solo un grupo lo deber hacer). Lea Abs a 555 nm tomando como referencia
al blanco.

5. TRATAMIENTO DE DESECHOS.

Al final del curso el profesor indicar el protocolo consenso para llevar a cabo el
tratamiento de cada uno de los desechos generados en la presente prctica. Sin
embargo, esto no exonera al estudiante de hacer la respectiva bsqueda bibliogrfica
que deber ser consignada en sus preinformes.

6. CLCULOS Y RESULTADOS

A parte de resolver las preguntas, en el informe debe ir:

La media y desviacin estndar para el valor de protena en clara de huevo y
dems muestras, con los datos obtenidos por todos los grupos.
Comparacin con el valor esperado de protena en clara de huevo.
Tablas de resultados con las pruebas cualitativas.
Anlisis de cada prueba cualitativa.
Comparacin con los resultados de al menos otros dos grupos.
El informe debe hacerse tipo artculo de no ms de 5 pginas (sin incluir
apndices). La bibliografa en formato de la American Chemical Society y referida
con nmeros en el texto.

7. PREGUNTAS

Preguntas a resolver en el preinforme

I. Averige las reacciones que se presentan entre aminocidos y la ninhidrina y la

estructura del producto responsable de la absorcin en el espectro visible. Por
qu esta prueba es menos sensible para protenas y pptidos?
II. Por qu la prolina da una coloracin distinta en la prueba con ninhidrina?
III. Dibuje la estructura del complejo formado en el ensayo de Biuret entre el cobre
(II) y la protena. Este mtodo permite diferenciar protenas que hagan parte de
una mezcla en disolucin?
IV. Averige la concentracin media de protena en clara de huevo y a partir de esos
datos y de acuerdo a la curva de calibracin anexada, calcule la masa requerida de
acuerdo a lo indicado en 4.2.

V. Averige el fundamento de la cuantificacin de protenas por absorcin en el U.V.

VI. En el tema de desnaturalizacin de protenas, averige sobre los mecanismos y
agentes desnaturalizantes (catropos y cosmtropos).
VII. Como siempre, realice una lista de las medidas de seguridad para los reactivos a
utilizar en sta prctica. Incluya posteriormente la manera en que se deben
disponer y/o tratar los residuos generados.
NOTA: Para registrar los colores en las pruebas cualitativas, traiga una cmara
digital (puede ser la de un celular si es buena). Traiga tambin la clara fresca de un
huevo en un recipiente adecuado (recuerde anotar datos relevantes de su muestra,
por ejemplo marca del huevo, lote, etc.).

Preguntas a resolver en el informe

I. Cmo suele estar formulado/compuesto el aspartame cuando se vende como

edulcorante para consumo humano?
II. Indique dos mtodos que se utilizan para determinar el peso molecular de una
protena.
III. Qu propiedades presentan las albminas? Qu funcin tiene la albmina de
suero sanguneo?
IV. Compare la tcnica de cuantificacin de protena por Biuret con el mtodo de
Kjeldhal, en trminos de su aplicabilidad, sensibilidad e interferencias.

8. BIBLIOGRAFA

1. Restrepo, J. Manual de prcticas de bioqumica. Universidad del valle, Facultad de

Ciencias. Cali, Colombia.
2. NTC 354; Productos qumicos para uso agrcola. Fertilizantes, Determinacin del
Biuret. 1983.
3. Lehninger. Principios de Bioqumica. 5ta. Edicin. 2006, 75-107
4. Friedman M. Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids,
Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences Journal of
Agricultural and Food Chemistry 2004 52 (3), 385-406.
 ANEXOS

ANEXO 1. CURVA DE CALIBRACIN

Abs555nm = 2,340x10-1 [Protena]

R2=0,9950

Patrn de Protena (mg/mL)

Grfica 1. Curva de calibracin usando como patrn de protena albumina de suero
bovino, de 0,0 0,6 mg/mL a 555 nm (realizada por los estudiantes de la cohorte de
Bioqumica 2011-II). Estas concentraciones hacen referencia a la concentracin final
de protena una vez mezclada con las soluciones de Biuret y llevadas a volumen.
ANEXO 2. TABLAS DE RESULTADOS (Puegue estas en su cuaderno o diagrame
unas equivalentes).

Biuret Cualitativo.

Solucin Observaciones

Glicina

Prolina

Albumina de Clara de
Huevo

Aspartame

Blanco

Reaccin de Ninhidrina.

Solucin Observaciones

Glicina

Prolina

Albumina de Clara de
Huevo

Aspartame
 Interaccin con osmolitos, cidos y bases. Protena:_____________

Orden de Reactivos Observaciones

HCl NaOH

NaOH HCl

Sulfato de
Urea
amonio

Sulfato de
Urea
amonio

Efecto del Calor.

Protena Observaciones
Albumina de Clara de
Huevo

Efecto de solventes orgnicos.

Protenas y Observaciones
aminocido Etanol Acetona
 Biuret cuantitativo.

Especifique la
Protena dilucin Absorbancia a 555 nm
realizada

Albumina de Clara de
huevo

Gelatina

Casena
ANEXO 3. COMPOSIICN DE ALGUNAS SOLUCIONES DE TRABAJO

Solucin A: 20 g de NaOH + 25 g de tartrato sdico-potsico en 500 mL.

Solucin B: 7,5 g de CuSO4.5H2O en 500 mL.

SOLUCIN CONCENTRACIN
HCl 1,25 M.
NaOH 1,25 M.
Prolina* 0,05M pH 6,2
Glicina* 0,05M pH 6,2
Casena* 0,005 g / mL pH 6,2
Gelatina sin sabor sin azcar* 0,005 g / mL pH 6,2
Clara de huevo* 1,0 g /25,0 mL pH 6,2
Ninhidrina 0,025 g/25 mL en etanol
Sulfato de amonio A saturacin (~10mL)
Aspartame comercial 15 g / 50 mL pH 6,2
Urea (preferiblemente) o guanidina 6 M en agua
25 mM (1.7023 g KH2PO4/500 mL)
Tampn fosfato
pH 6,2
* Soluciones preparadas en el tampn fosfato pH 6,2.