UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

ZONA XALAPA

PROGRAMA EDUCATIVO:
INGENIERA EN ALIMENTOS

Aislamiento y caracterizacin de un hongo

productor de enzimas lipolticas

MODALIDAD DEL TRABAJO RECEPCIONAL

TESIS

Que para acreditar la Experiencia Educativa:

Experiencia Recepcional

P r e s e n t a:
Julio Cesar Rosas Durn

Asesor:
Dra. Nieves Del Socorro Martnez Cruz

Codirector:

M.E. Yolanda Medina Romero

Xalapa, Enrquez, Veracruz. Junio 2015

i
Este trabajo se realiz en el laboratorio 34 de Proyectos- Investigacin de la Facultad
de Ciencias Qumicas de la Universidad Veracruzana campus Xalapa.

ii
 Dedicatoria
Este trabajo se lo dedico a mis padres Jorge y Rosa.

iii
 AGRADECIMIENTOS

Agradezco a Dios por haberme permitido concluir este trabajo que representa un
importante logro y que sin l no habra sido posible.

Agradezco a mis padres por el apoyo y esfuerzo brindado y que sin ellos no hubiera
podido llegar a esta etapa de mi vida.

Agradezco a mi asesora la Dra. Nieves del Socorro Martnez cruz por la atencin y
apoyo brindado durante la realizacin de este trabajo.

Un especial agradecimiento a la Dra. Yolanda Cocotle Ronzn, ya que con su ayuda y

colaboracin se hizo posible este trabajo.

A la maestra Yolanda Medina Romero por sus aportaciones y sugerencias.

A mis amigas Adriana y Angelina por su apoyo incondicional en todos los das, por
escucharme y hacerme rer.

A mis amigas Monse, Gaby, Elani, Karina, por estar siempre presentes ayudarme en
este proyecto.

iv
A los compaeros de laboratorio 34 Blanca, Tere, Ricardo, Heidi, Humberto.

A todos muchas gracias

v
 NDICE

ndice de figuras .................................................................................................. viii

ndice de tablas ..................................................................................................... ix

RESUMEN. ............................................................................................................ x

1. INTRODUCCIN. ........................................................................................ 1

2. MARCO TERICO. .......................................................................................... 3

2.1. Enzimas. ............................................................................................................................................. 3

2.2. Lipasas. ............................................................................................................................................... 4
2.3. Aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas. ..................................................................................... 5
2.4. Microorganismos productores de lipasas. ........................................................................................ 8
2.5. Lipasas fngicas microbianas. ........................................................................................................ 8
2.6. Hongos. ............................................................................................................................................ 11
2.7. Gnero Penicillium........................................................................................................................... 12
2.7.1. Caractersticas de Penicillium....................................................................................................... 12
2.7.2. El gnero penicillium como productor de lipasas........................................................................ 12
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ....................................................... 14

4. HIPTESIS. .................................................................................................... 15

5. OBJETIVOS. ................................................................................................... 15

5.1. OBJETIVO GENERAL. ........................................................................................................................ 15

5.2. OBJETIVOS ESPECFICOS. ................................................................................................................. 15
6. METODOLOGA. ............................................................................................ 16

6.1 Aislamiento de la cepa e identificacin del hongo. ......................................................................... 17

6.2 Determinacin cualitativa de la actividad lipoltica. ....................................................................... 17
6.3 Microcultivo. ..................................................................................................................................... 17
6.4 Generacin de esporas ..................................................................................................................... 18
6.5 Conteo en cmara de neubauer. ...................................................................................................... 18
6.6 Cintica de crecimiento del hongo................................................................................................... 18
6.7 Obtencin del extracto crudo enzimtico. ..................................................................................... 19
6.8 Titulacin. ......................................................................................................................................... 19

vi
 7. RESULTADOS ................................................................................................ 20

7.1 AIslamiento una cepa de hongo silvestre con capacidad de producir lipasas. .............................. 20
7.2. Crecimiento en cultivo en suspensin y determinacin de la actividad de lipasa del hongo
aislado. .................................................................................................................................................... 25
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................. 29

9. BIBLIOGRAFA ............................................................................................... 30

vii
ndice de figuras

Figura 1.Esquema general del trabajo experimental ......................................................................... 16

Figura 2.Cultivo in vitro de tejido de zarzamora (Rubus adenotrichus) contaminado con hongos.
..................................................................................................................................................................... 20

Figura 3. Crecimiento del hongo aislado que presenta las caractersticas de crecimiento del
gnero Penicillium. ................................................................................................................................... 21

Figura 4.Colonia caracterstica del hongo aislado. ............................................................................ 22

Figura 5. Microcultivo para la observacin microscpica de Penicillium sp ................................... 22

Figura 6.Formas microscpicas del hongo aislado, caractersticas del gnero Penicillium. ....... 23

Figura 7. Formacin de halo transparente en el medio productor de lipasas. ............................... 24

Figura 8.Crecimiento de Penicillium sp. En un medio (YMP suplementado con aceite de oliva),
con una temperatura de 22-23 C.......................................................................................................... 26

Figura 9. Determinacin de acidez durante el crecimiento de Penicillium sp ................................ 27

viii
ndice de tablas

Tabla 1. Generacin de esporas de Penicilliumsp., en dos medios de esporulacin. .................. 25

ix
RESUMEN.

Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que como catalizadores biolgicos
presentan una gran ventaja frente a los de tipo qumico.Por su alta especificidad,
selectividad y su increble velocidad de reaccin. Las lipasas son parte de la familia de
las hidrolasas las cuales catalizan la hidrlisis de triglicridos en la interface lpido-agua.
Las lipasas tienen caractersticas que las convierten en biocatalizadores de alta
versatilidad, pero su uso se encuentra limitado por los altos costos de produccin, entre
las lipasas microbianas, se prefieren las de origen fngico en comparacin con las
bacterianas por su capacidad de actuar en rangos ms amplios de proceso, y sobre
todo, debido a que su produccin generalmente se efecta en el medio extracelular. En
el presente trabajo se aisl y caracterizo de forma preliminar una cepa de un hongo
silvestre productor de lipasas. El aislamiento de efectu a partir de un cultivo in vitro de
clulas de zarzamora. El hongo fue resembrado en placas por el mtodo de estriado y
en tubo inclinado en agar Dextrosa Sabouraud e incubndolas a 22 C durante siete
das, realizando durante este tiempo la observacin y registro de las caractersticas
morfolgicas del hongo. Despus se desarroll en un medio selectivo cuya composicin
fue: extracto de levadura (0.5g), extracto de carne (0.5g), fosfato de potasio dibsico
(0.5g), agar bacteriolgico (1.8 g), suplementado con una fuente lipdica(0.3g) que en
este caso fue aceite de oliva. La produccin de lipasas se observ por la generacin de
un halo transparente en el medio. Por microcultivo se confirm la pertenencia al gnero
Penicillium. El crecimiento del hongo en suspensin alcanz la fase estacionaria a 72
horas al igual que el pico de mxima actividad lipoltica la cual fue determinada de
manera indirecta por la determinacin de acidez titulable.

x
 1. INTRODUCCIN.

Las enzimas son sustancias de naturaleza proteica, que como catalizadores biolgicos,
presentan una gran ventaja frente a los catalizadores qumicos por su alta especificidad,
selectividad y su increble velocidad de reaccin. Estas molculas se utilizan en la
industria en un gran nmero de procesos como: la fabricacin de detergentes, la
obtencin de productos con bajas concentraciones de grasas y para sintetizar
qumicamente ms productos (Vera, 2007).

Las enzimas obtenidas a partir de microorganismos son ms utilizadas que las

aisladasde plantas o de origen animal, esto se debe a que se pueden: manipular
genticamente, producir en grandes cantidades, por su alto rendimiento pueden bajar
los costos de produccin, adems de presentar una mayor estabilidad y actividad
durante la reaccin.

Las lipasas son enzimas que han emergido como catalizadores clave en la
biotecnologa, debido a sus propiedades multifacticas (especificidad, estabilidad, pH y
temperatura)tienen una gran variedad de aplicaciones industriales. Su aplicacin se da
en industrias tales como: la de alimentos, cosmticos y perfumes, del papel, la textil y
en la de pesticidas (Carrillo, 2011).

Las lipasas son sintetizadas por microorganismos principalmente en presencia de

inductores como los lpidos. Se ha documentado que los aceites naturales como el
aceite de soya, los cidos y steres grasos como los jabones, los esteroles como el
colesterol, las sales biliares y detergentes se comportan como inductores. As mismo
los niveles de produccin de lipasas microbianas varan significativamente entre las
diferentes especies de microorganismos.

Entre los principales microorganismos productores de lipasas se encuentran los

gneros Pseudomonas, Bacillus, Rhizopus, Cndida y Aspergillus (Aceves y
Castaeda, 2012) y su produccin depende mucho de los factores ambientales, tales

1
como temperatura, pH, sales minerales, fuentes de carbono, nitrgeno y de oxigeno
(Scragg, 2010).
A pesar de las grandes ventajas que tiene la aplicacin de las lipasas en diferentes
tipos de industrias, sus altos costos de produccin limitan su uso. Es por ello, que el
presente trabajo se enfoc en la bsqueda de nuevos microorganismosproductores de
lipasas que permitan en un futuro obtener a escala industrial estas enzimas utilizando
condiciones de operacin que faciliten la reduccin de los costos de produccin y se
convierta en un proceso biotecnolgico econmicamente viable.

2
2. MARCO TERICO.

2.1. Enzimas.

Todos los procesos de la vida, ya sea vegetal, animal o microbiana, dependen para el
crecimiento y mantenimiento celular de una compleja red de reacciones qumicas
catalizadas por enzimas. Las enzimas, son sustancias de naturaleza proteica que
catalizan reacciones qumicas en los sistemas biolgicos siempre que sea
termodinmicamente posible, por lo cual, tambin son conocidas como
biocatalizadores. Estas disminuyen la energa de activacin de las reacciones que
catalizan, de forma que se acelera la tasa de reaccin (Vera, 2007).

Las enzimas se han utilizado extensamente como catalizadores industriales y la

tendencia actual es su uso en procesos de la denominada industria verde en la que se
refleja la necesidad de disponer de estrategias que ayuden a conseguir el desarrollo
sostenible y a reconducir los patrones actuales de consumo y produccin hacia vas
ms sostenibles a largo plazo, respetando al mismo tiempo las restricciones de los
recursos y sin perder de vista los lmites de capacidad. Estos catalizadores poseen las
siguientes caractersticas:

a) Son de accin especfica, y por lo tanto minimizan la aparicin de reacciones

secundarias indeseables.
b) Son relativamente baratos y pueden catalizar reacciones bajo condiciones no tan
exigentes.
c) Son eficaces para las conversiones qumicas (biocatlisis).
d) Pueden ser producidos a gran escala por fermentacin a partir de azcares
comunes y otros sustratos renovables.
e) Pueden ser modificados y mejorados para adaptarse a una determinada
aplicacin.
f) Son seguros y aceptables para aplicaciones en procesos de alimentos y
tratamientos medicinales.

3
 g) Son eficaces en un amplio intervalo de concentraciones.
h) Son biodegradables.

Actualmente se han aislado y caracterizado ms de 3,000 enzimas diferentes, sin

embargo al menos 100 nunca se han utilizado en aplicaciones industriales. El mercado
mundial de enzimas industriales super los 3.5 mil millones de dlares al ao en 2010 y
estaba creciendo a un ritmo del 5-8 % anual. Ms del 50 % de las ventas provienen de
las enzimas proteolticas para su uso en la industria de los detergentes, lctea y de
cuero (Straathofet al., 2002).

Las carbohidrasas, principalmente las amilasas, isomerasas, pectinasas, celulasas, y

hemicelulasas que se utilizan en la elaboracin de la cerveza, el etanol combustible, el
almidn e industrias textiles, representan casi el 40 % del total del mercado enzimtico.
Las lipasas, fitasas, oxidorreductasas, y otras enzimas altamente especializadas
conforman el resto de las ventas totales de dicho mercado. Si bien los mercados han
madurado en regiones de Amrica del Norte y Europa Occidental, incluyendo Amrica
Latina y Asia todava se est experimentando un fuerte crecimiento impulsado por la
demanda de la alimentacinde los animales, de los textiles, detergentes y las industrias
de procesamiento de granos. Los principales productores de enzimas en todo el mundo
son Novozymes A/S y Genencor, ahora parte de DuPont (Lintonet al., 2008).

2.2. Lipasas.

Las lipasas (glicerol-ster hidrolasas; EC 3.1.1.3) son parte de la familia de las

hidrolasas las cuales catalizan la hidrolisis de triglicridos en la interface lpido-agua,
estas biomolculas orgnicas estn ampliamente distribuidas en la tierra. Las lipasas se
han utilizado desde hace ms de 300 aos, sin embargo, su capacidad para catalizar la
hidrlisis y sintetizar esteres ha sido reconocida apenas hace algunos aos (Gilham y
Lehner 2005).

4
Este tipo de enzimas son de importancia en la industria por sus mltiples aplicaciones
debido a que llevan a cabo la degradacin de sustratos con alto contenido graso as
como en reacciones de esterificacin en la industria alimenticia, farmacutica y
cosmtica. Las lipasas han sido encontradas en muchas especies de animales, plantas
y microorganismos. Sin embargo, las lipasas microbianas son mucho ms verstiles y
presentan caractersticas interesantes como estabilidad en solventes orgnicos,
actividad bajo diversas condiciones y alta especificidad de sustrato.

Las lipasas son sintetizadas por los microorganismos preferencialmente en presencia

de inductores como son los lpidos. Estas molculas y otras sustancias presentes en los
residuos agroindustriales permiten el crecimiento de los microorganismos y actan
como sustancias inductoras para la produccin de lipasas microbianas. Entre los lpidos
que han demostrado ser inductores de lipasas se encuentran el aceite de soya, el
colesterol, las sales biliares, los detergentes, por lo cual estas sustancias se emplean
para la produccin de lipasas de origen microbiano(Falero, 2013).

2.3. Aplicaciones biotecnolgicas de las lipasas.

En la actualidad los procesos desarrollados en la industria que son catalizados por

enzimas son mucho ms numerosos, esto se debe a que presentan una serie de
ventajas frente a los catalizadores no biolgicos convencionales. Las lipasas
microbianas constituyen uno de los grupos ms importantes de biocatlisis por sus
amplias e importantes aplicaciones en la industria alimentaria, en el caso la de los
aceites, para la produccin de grasas con propiedades fsicas y qumicas deseables,
adems de mejorar la calidad y aroma en la los productos lcteos, en la elaboracin de
embutidos con una baja concentracin de grasas trans en los productos finales, a
diferencia de los procesos de hidrogenacin y transesterificacin qumica. Las lipasas
se emplean en gran medida como aditivos para detergentes que se utilizan
comnmente en los hogares y de lavandera industrial y en los lavavajillas domsticos.
Aproximadamente 1.000 toneladas de lipasas se venden cada ao en esta rea. Las

5
lipasas son generalmente aadidas a los detergentes principalmente en asociacin con
proteasas y celulasas (Pandeyet al., 1999).

Lipasas se encamina a una serie de aplicaciones de qumica fina de inters

fundamentalmente farmacutico, bsicamente en el campo de la resolucin de
compuestos quirales, ya que en las normativas de legislacin se tiende a exigir
productos pticamente puros en lugar de mezclas racmicas, lo cual, ha provocado un
gran esfuerzo de investigacin en el campo de las lipasas como biocatalizadores
enantiomricamente activos (Snchez et al., 2007).

Las lipasas catalizan una amplia variedad de reacciones como la hidrlisis parcial o
total de triacilglicridos y reacciones de esterificacin, transesterificacin e
interesterificacin de los lpidos en medios no acuosos (Gonzlez et al.,2010).
Recientemente, gracias a su capacidad para llevar a cabo reacciones de
transesterificacin las lipasas han adquirido un papel muy importante en la produccin
de biocombustibles, como resultado de la creciente demanda mundial en el uso de
energa renovable (Rivera y Garca, 2007).

Las lipasas han pasado a ser una parte integral en la actual industria alimentaria. Se ha
potenciado el uso de enzimas para mejorar procesos qumicos tradicionales en la
manufactura alimentaria, las lipasas, se usan actualmente en la produccin de una
variedad de productos como quesos y alimentos preparados (Houdeet al., 2004).

Una reciente aplicacin, que est acaparando un gran inters, es la obtencin de cido
felrico a partir de subproductos de la industria alimentaria; para su posterior aplicacin
en otras industrias farmacutica o en alimentaria (Topakaset al., 2007). A su vez, el
cido felrico puede ser convertido a vainilla enzimticamente, para mejorar el aroma y
el sabor de algunos alimentos (Bornscheue, 2002).

Los carotenoides son pigmentos naturales sintetizados por bacterias, hongos, plantas y
en menor cantidad por animales. Los carotenoides son empleados, industrialmente,
como colorantes artificiales en alimentos. Los carotenoides pueden acumularse libres o
esterificados. Para la liberacin de los esteres de carotenoides se emplean lipasas

6
procedentes de Pseudomonasfluorescens, Pseudomonasalcalgenesy
Agrobacteriumtumefaciens(Ralfet al., 2007).

En el procesamiento de t negro la calidad de este depende en gran medida de la

deshidratacin, rotura mecnica y la fermentacin enzimtica a la que son sometidos
los brotes de t. Durante la fabricacin del t negro la descomposicin enzimtica de
lpidos de la membrana da origen a la formacin de productos voltiles con propiedades
de sabor caractersticosque destacan la importancia de los lpidos en el desarrollo del
sabor. La lipasa producida por Rhizomucormiehei mejora el nivel de cido graso
poliinsaturado observado por reduccin en el contenido total de lpidos (Lathay
Ramarethinam, 1999).

Las lipasas se utilizan ampliamente en la industria lctea para la hidrlisis de la

grasa. Las aplicaciones actuales incluyen la mejora del sabor de los quesos, la
aceleracin de la maduracin del queso y la liplisis de la grasa en la mantequilla y
crema. Los cidos grasos libres generados por la accin de las lipasas en grasa de la
leche dotan a muchos productos lcteos, en particular los quesos blandos, con sus
caractersticas especficas de sabor (Farahatet al., 1990).

El uso de enzimas permite panaderas para extender la vida til de panes, mejorar y
controlar el pardeamiento no enzimtico, aumentar el volumen del pan y mejorar la
estructura durante la coccin, la masa aumenta el volumen de las piezas de pan y el
producto final de panificacin presenta una corteza lisa, crujiente y dorada, de miga con
alveolado uniforme y mostrando un buen comportamiento durante el proceso de
conservacin (Copa et al., 2006).

En la industria de los alimentos las lipasas tienen amplia aplicacin, sin embargo, el
inters en la bsqueda de nuevas fuentes de estas enzimas se debe a la necesidad de
disminuir costos para generar procesos biotecnolgico viables.

7
2.4. Microorganismos productores de lipasas.

Los microorganismos con un alto potencial para producir lipasas pueden ser
encontrados en diferentes hbitats, principalmente en desechos o residuos de aceites
vegetales empleados en la elaboracin de frituras, industrias de productos lcteos,
suelos contaminados con aceites y alimentos deteriorados. Esto indica que el mismo
ambiente natural ofrece una amplia fuente para aislar nuevos microorganismos
productores de lipasas con propiedades novedosas. A partir de stos ambientes se han
aislado bacterias, hongos filamentosos, levaduras y actinomycetos, entre los que
sobresalen los gneros Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Staphylococcus,
Rhizopus, Mucor, Candida, Aspergillus y Geotrichumsp por su capacidad para producir
lipasas extracelulares ( Aceves y Castaeda., 2012).

Dado que las lipasas se encuentran entre las enzimas ms ampliamente utilizadas en
procesos biotecnolgicos y en procesos qumicos, la investigacin se ha enfocado en la
bsqueda de nuevos microorganismos con diferentes propiedades lipolticas deseadas.
A pesar del gran nmero de microorganismos productores de lipasas, slo algunas
especies de bacterias se han evaluado para la produccin de lipasas. Entre las
levaduras, el gnero Cndida es el que presenta una mayor produccin de lipasas
siendo las producidas por C. rugosa las que se han convertido en unas de las ms
utilizadas por la industria, debido a su alta actividad en procesos tanto de hidrlisis
como de sntesis (Snchez, 1998).

2.5. Lipasas de hongos y levaduras.

Las lipasas de origen fngico se prefieren en comparacin con las bacterianas por su
capacidad de actuar en rangos ms amplios durante el proceso, y sobre todo, debido a

8
que su produccin generalmente se efecta en el medio extracelular. El uso industrial
ms grande de estas enzimas est sujeta a una reduccin en los costos de produccin
(Reinehret al., 2014). Es importante considerar la temperatura para la actividad
enzimtica en la cual algunas lipasas alcanzan su mayor estabilidad. As, para el caso
de las lipasas fngicas, la temperatura ptima de accin cataltica suele estar entre los
40-60 C, siendo capaces de conservar el 100% de actividad incluso despus de 4
horas, permitindoles su versatilidad en aplicaciones dentro de diferentes reas
industriales (Pea et al., 2011).

Los principales productores de lipasas comerciales son principalmente hongos y

levaduras de gneros como Rhizopussp., Aspergillus sp., Penicilliumsp, siendo las
lipasas de Rhizopus y Aspergillus los catalizadores ms atractivos para la modificacin
de lpidos (Adak y Banerjee, 2013). Se han aislado ms de 30 lipasas de cepas de
Rhizopus y muchas de ellas ya han sido caracterizadas. Las lipasas de Rhizopus estn
relacionadas con las lipasas de Rhizomucormiehei(existe una homologa >55%), las
cuales, presentan una alta especificidad en la posicin 1,3 de triacilglicridos,
permitindoles alta versatilidad en la modificacin de lpidos (Rivera y Garca, 2007).

A partir deRhizopusoryzae NRRL 3562, se ha aislado una lipasa de pequeo peso

molecular (14.45 kDa), con propiedades bioqumicas distintivas que sugieren su utilidad
en procesos de transesterificacin, tales como mayor actividad a pH alcalino (pH de 9) y
extremadamente resistente a cambios en un amplio rango de pH y moderadamente
termoestable, no visto hasta ahora en el gnero Rhizopussp., con largos meses de vida
media a pH 7 a 30 C. Tambin exhibi otras caractersticas industrialmente
importantes tales como la estabilidad en presencia de metales, tensoactivos y
disolventes, especialmente disolventes polares, demostrando as ser una enzima
robusta adecuada para aplicaciones variadas, incluyendo transesterificacin,
formulacin de detergentes, etc. (Adak y Banerjee, 2013).

9
Candidaantartica es una levadura basidiomyceteous aislada del lago Vanda en
Antrtida, la cual, produce dos lipasas denominadas A y B. Estas lipasas se encuentran
entre las lipasas ms termoestables reportadas hasta el momento y se han encontrado
numerosas aplicaciones para stas. La lipasa A de Candidaantarctica (CalA) muestra
una especificidad ms amplia hacia alcoholes secundarios y terciarios estricamente
impedidos y un mejor reconocimiento de cidos grasos trans en la hidrlisis de
triacilglicridos. La CalA tambin se ha utilizado para la sntesis asimtrica de
aminocidos y compuestos relacionados, debido a su quimioselectividad hacia grupos
amino; sin embargo, la CalA es dependiente de calcio y posee baja actividad cataltica,
por lo cual, se requieren en grandes concentraciones para catalizar reacciones.

Por su parte, la lipasa B de Candidaantartica (CalB) es una protena de tipo / globular

con dimensiones aproximadas de 30 x 40 x 50 , que consta de 317 aminocidos
con un peso molecular de 33 273 Da, posee un punto isoelctrico de 6,0, pH ptimo de
7,0 (estable en el intervalo de pH de 3,5-10,0). Es menos termoestable en comparacin
con CalA, pero posee mayor especificidad. Siendo principalmente activa hacia
alcoholes primarios y es 1,3-especfica hacia glicerol. La CalB es estereoselectiva para
Sn3 posicin con respecto a los triglicridos y cuando la longitud de la cadena del grupo
acilo aumenta a 18 la preferencia cambia a la posicin Sn1. Sus aplicaciones son
amplias debido a su regio- y enantioselectividad, ambas, para hidrlisis y sntesis
orgnica de mayor estabilidad y actividad cataltica hacia diferentes reacciones
(Bornadelet al, 2013).

Yarrowialipolytica, por otra parte, es una levadura GRAS no convencional que produce
8 lipasas, de las cuales una de ellas (LIP2), es excretada extracelularmente en grandes
cantidades, desarrollndose mtodos de cultivo y herramientas moleculares, as como
tcnicas de inmovilizacin para optimizar la actividad, selectividad y estabilidad. La
lipasa 2 de Y. lipolytica (LIP2) es una lipasa verstil que acepta diversos sustratos no
naturales y el conocimiento adquirido sobre su estructura y propiedades es de gran
utilidad en el desarrollo de nuevas variantes a la medida como biocatalizador en las

10
reacciones sntesis de biodiesel, biopolmeros y steres bioactivos de cido cafico, as
como en la resolucin de steres del cido 2-bromo-arilactico (Sandoval et al., 2009).

2.6. Hongos.

Los hongos constituyen un grupo muy numeroso de microorganismos que presentan

una amplia distribucin en la naturaleza; actualmente se encuentran 72 000 especies,
pero se calcula que existen ms de 1.5 millones. Tienen una infinidad de formas y
tamaos y pueden encontrarse en las condiciones ambientales ms variadas.
Aprovechan los nutrientes ms simples contribuyendo a la descomposicin de la
materia orgnica y participando en los ciclos biolgicos. (Pea, 2009).

Son organismos de vida libre con una distribucin amplia en el planeta, por lo tanto, se
encuentran representantes de estos en condiciones climticas extremas como las
temperaturas rticas de menos 30C y tan elevadas como 70C, sin embargo, cada
gnero, o incluso cada especie, presentan temperaturas en el cual su desarrollo es
ptimo.

Los hongos obtienen los nutrientes por absorcin y tienen un metabolismo

quimiohetertrofo, ya que obtiene la energa y el carbono de compuestos orgnicos.
Los hongos en la naturaleza se encuentran asociados con la materia orgnica en
descomposicin, participando en los ciclos naturales del reciclado del carbono y otros
elementos naturales o como patgenos oportunistas de los animales y plantas. Los
hongos pueden degradar una gran cantidad de componentes, para lo que disponen de
potentes exoenzimas que en algunos casos pueden servirles como factores de
virulencia en el hospedador (Pea, 2009).

11
2.6.1GneroPenicillium.

2.6.1.1 Caractersticas de Penicillium.

Los miembros del genero Penicilliumson hongos filamentosos. Las especies

pertenecientes a este gnero estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y su
hbitat ms comn es la vegetacin cada, el aire y suelo. La estructura caracterstica
del genero Penicilliumsp., es el conidiforo en forma de pincel, los conidios se
presentan en cadenas ordenadas y se originan a partir de clulas ordenadas llamadas
fialaides, el conidiforo se encuentra unido al micelio mediante la estipe. Entre estos
aparecen clulas agrupadas partiendo de un mismo punto de origen. Los puntos de
ramificacin son uno, dos o en algunos casos tres a lo largo del conidiforo. La clula
de soporte de la falaide se denomina mtula y la clula de soporte de la mtula se
denomina rama (Martnez, 2003).

Las colonias de Penicillium son por lo general de crecimiento rpido, filamentosas,

lamosas o de textura algodonosa. Son inicialmente blancas y luego se convierten en
verde azulado, gris verdosas, gris olivo, amarillentas o rosadas con el paso del tiempo y
el reverso de la colonia es plida o amarilla (Kuharet al., 2013)

2.6.1.2El gnero penicillium como productor de lipasas.

Existen en la literatura diversos reportes del gnero Penicillium como productores de

lipasas como es el caso de Miranda et al., (1998) quienes aislaron una cepa de
Penicilliumcitrinum encontrado como contaminante en aceite de oliva. La cepa se
cultiv en matraces Erlenmeyer (2000 mL) con un volumen de trabajo de 600 mL a 28-
30 C bajo agitacin orbital (100 rpm). La fermentacin comenz con un 10% (v / v) de
inculo (107 esporas / mL). P. citrinum produjo dos picos de actividad lipoltica en 25 y
120 h en el residuo de refinera de petrleo y, con menor cantidad, a 48 y 120 horas en
aceite de oliva concluyendo que este microorganismo produce dos tipos enzimas
lipolticas.

12
En el 2010 Mendoza aisl hongos a partir aceites de desecho vegetales provenientes
de frituras con potencial de producir lipasas. Los hongos aislados se sometieron a la
prueba de liplisis que consisti en sembrar cada cepa aislada en agar con 3% de
substrato de lpidos (pH 6,3). Las placas fueron envueltas con papel Kraft e incubadas a
temperatura ambiente registrndose promedios mxima de 31C y mnima 23 C .Las
placas fueron observadas cada dos das. Considerando la presencia de hongos
lipolticos en general al evidenciar halos transparentes alrededor de la colonia y/o un
desarrollo profuso del hongo sobre el agar. Del total de hongos lipolticosque aisl(10
cepas),8 de los cuales pertenecen al gnero Penicilliumsp., los gneros
GeotrichumyAspergillus presentaron mayor capacidad de liplisis. Tambin Mendoza et
al, (2012) report que el gnero Penicillium y el gnero Aspergillus sp. Presentaron un
buen crecimiento en medio de cultivo adicionado con aceite de higuerilla y actividad
lipoltica con triglicridos de cadena corta.

Melisa et al., (2009) utiliz una cepa de Penicilliumsimplicissimum, sta se

trabaj enresiduos slidos de la industria deaceite,lafermentacinse llev a cabo en
biorreactores a escala de laboratorio, se realiz una cintica en la cual se tomaron
muestras cada 12 horas y se encontr una mxima actividad de la lipasa entre las 72 y
92 horasde fermentacin.

13
 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

En la actualidad se estima que solo el uno por ciento de los microorganismos se ha

logrado aislar de sus ambientes naturales, esto se debe a que los mtodos de
aislamiento tienen dificultades para simular las condiciones ambientales en las que se
encuentran las poblaciones. A pesar de estos inconvenientes se han podido recuperar
microorganismos puros cuyas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y metablicas
han permitido el desarrollo de un gran nmero de productos comerciales a partir de sus
enzimas.Entre las enzimas secretadas por estos microorganismos se encuentran las
lipasas que tienen importantes caractersticas como el de ser estables en solventes
orgnicos, no necesitan de cofactores, presentan alta regioselectividad,
quimioselectividad y estereoselectividad por ello son consideradas biocatalizadores de
alta versatilidad.

Las lipasas se han obtenido de bacterias y algunos hongos principalmente, sin

embargo, los costos de produccin son elevados y estn determinados por el
rendimiento en la produccin adems de la purificacin de las enzimas. Con la finalidad
de encontrar microorganismos que presenten una mayor produccin de lipasas se
contina con esta bsqueda, algunos hongos son productores de lipasas por lo que son
una buena alternativa de investigacin para la obtencin de lipasas para su posible
aplicacin en la industria de los alimentos.

14
4. HIPTESIS.

Es posible aislar una cepa de hongo silvestre generadora de enzimas lipolticas para su
posible aplicacin en la industria de los alimentos.

5. OBJETIVOS.

5.1. OBJETIVO GENERAL.

Obtener y caracterizar de manera preliminar una cepa de hongo silvestre con capacidad
de producir lipasas.

5.2. OBJETIVOS ESPECFICOS.

Aislar una cepa de hongo silvestre con capacidad de producir lipasas.

Identificar el gnero al que corresponde la cepa de hongo aislada
Determinar las condiciones de cultivo para la esporulacin
Determinar la cintica de crecimiento en cultivo en suspensin
Determinar la actividad de lipasa generada durante el cultivo en suspensin

15
6. METODOLOGA.

El trabajo experimental se desarroll en el Laboratorio 34 de Proyectos Investigacin

de la Facultad de Ciencias Qumicas, bajo el esquema de trabajo que se presenta en la
Figura 1.

Etapa 1. Aislamiento de una cepa del hongo

Etapa 2. Identificacin del hongo

Etapa 3. Determinacin cualitativa de actividad de

lipoltica

Etapa 4: Generacin de esporas en medio lquido

Etapa 5. Determinacin de la Cintica de crecimiento

por peso seco

Crecimiento celular: masa celular seca

Determinacin de la actividad lipoltica

Figura 1. Esquema general del trabajo experimental

16
6.1 Aislamiento de la cepa e identificacin del hongo.

A partir de un cultivo in vitro de clulas de zarzamora (Rubusadenotrichus) que

originalmente se emplearan para la produccin de metabolitos secundarios
(antocianinas) las cuales presentaron contaminacin fngica, aislndosedos hongos
contaminanteslos cualesfueron resembrados en placas por el mtodo de estriado y en
tubo inclinado en agar Dextrosa Sabouraud incubndolas a 22 C durante siete das
realizando durante este tiempo la observacin y registro de las caractersticas de macro
y micromorfologapara su identificacin (Mier et al., 2013).

6.2 Determinacin cualitativa de la actividad lipoltica.

El hongo seleccionado se cultiv en un medio selectivo para microorganismos

productores de lipasas cuya composicin es: extracto de levadura (0.5g), extracto de
carne (0.5g), fosfato de potasio dibsico (K2HPO4 ) (0.5g), agar bacteriolgico (1.8 g) y
como fuente lipdica aceite de oliva (0.3g) (YMP+ Lipido) (Pea, 2006). La temperatura
de incubacin fue de 22-23C. Se consider la presencia de hongos lipolticos por la
generacin de halos transparentes alrededor de la colonia.

6.3Microcultivo.

Se vertimedioSabouraud en una caja de Petri estril hasta obtener una capa de

aproximadamente 2 mm de altura. Una vez solidificado el medio, se cortaron bloques
de aproximadamente 1 cm2 con una hoja de bistur estril. Se coloc esta porcin del
medio sobre un cubreobjetos estril, se inocul el hongo en los lados del cuadrado.
Posteriormente se deposit el microcultivo sobre un algodn empapado en agua
destilada estril y se incub siete das a22-23 C (Mier et al., 2013)

17
6.4 Generacin de esporas

Las esporas son estructuras caractersticas de los mohos, debido a que intervienen en
sus procesos reproductores, a travs de la formacin de estas, se pueden realizar
estudios que nos permitan conocer acerca del crecimiento y desarrollo de estos
organismos. Para la generacin de esporas fueron empleados dos medios de cultivo
caldoextracto de malta y el caldo dextrosa Sabouraud, con la finalidad de promover un
desarrollo ptimo del hongo.

6.5Conteo en cmara de neubauer.

Para realizar el conteo de esporas en el microscopio se utiliz la cmara de Neubauer

(Mier et al., 2013).

6.6Cintica de crecimiento del hongo.

La cepa se sembr en tubos inclinados en medio Dextrosa Sabouraud y una vez que la
colonia se encontren condiciones de color caracterstico y desarrollo macroscpico
viable, se adicionaron 10 mL de solucin fisiolgica a un tubo de conservacin y se
agitaron durante 20 segundos.La solucin de esporas se deposit en un frasco estril.

Se emplearon matraces Erlenmeyer de 100 mL con 20 mL de medio selectivo estril y

1mL de la solucin de esporas.se inocularon 30 matraces para tomar 2 matraces diarios
durante los das 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. La incubacin se realiz a temperatura ambiente
(22C). Al mismo tiempo se determin la actividad lipoltica en funcin del aumento de
acidez por titulacin con NaOH.

18
6.7Obtencin del extracto crudo enzimtico.

Los cultivos de hongos se centrifugaron a 4500 rpm durante 5 min. Se separ el

sobrenadante obtenido que contiene lipasas extracelulares para determinar su
actividad.

6.8Titulacin.

Se determin la produccin de cidos grasos teniendo en cuenta el cambio en la acidez

del medio de cultivo ocasionado por la accin de las enzimas lipolticas. La
concentracin de cidos grasos libres se determin mediante titulacin usando 20 mL
del sobrenadante, se adicionaron unas gotas de fenolftalena como indicador y se titul
con NaOH 0.01N, de igual manera se realiz un ensayo control, el porcentaje de acidez
se define como los mL de NAOH requeridos para neutralizar los cidos grasos
contenidos en la muestra, se calcula de acuerdo a la frmula:

. . . 100
% =

19
7. RESULTADOS

7.1 Aislamiento una cepa de hongo silvestre con capacidad de producir

lipasas.

El hongo aislado en este trabajo se present como un contaminante en un medio

para el cultivo in vitro de clulas de zarzamora (Figura 2). Debido a que
macroscpicamente presentaba las caractersticas de un hongo perteneciente al
gnero Penicillium y bibliogrficamente se haba establecido que este gnero tiene
especies productoras de lipasas (Adak y Banerjee, 2013), se decidi favorecer su
crecimiento resembrndolo en un medio de Dextrosa Sabouraud (Figura 3).

Figura 1.Cultivo in vitro de tejido de zarzamora (Rubusadenotrichus) contaminado

con hongos.

20
A lo largo de siete das se realiz un seguimiento de su crecimiento observndose la
presencia de dos cepas cuyas caractersticas macroscpicas sugeran que uno
perteneca probablemente al gnero Mucor y el otro a Penicillium. Se decidi
seleccionar y aislar por medio de, al menos cinco resiembras, al segundo el cual
mostr colonias de crecimiento rpido, textura algodonosa y blanca en un principio
cambiando a un verde azulado, filamentoso y de color plido al reverso lo que
permiti sugerir que el hongo pertenece al gnero Penillium(Figura 3 y Figura 4).

Figura 2. Crecimiento del hongo aislado que presenta las caractersticas de

crecimiento del gnero Penicillium.

21
 Figura 3.Colonia caracterstica del hongo aislado.

Al tomar muestras de hongos filamentosos para observarlos al microscopio,

frecuentemente se fragmenta el micelio, este inconveniente se obvia obteniendo un
microcultivo (Figura 5).

Figura 4.Microcultivo para la observacin microscpica de Penicilliumsp

22
La observacin al microscopio (Figura 6) confirm que el hongo aislado pertenece al
gnero Penicilliumya que fue evidente la formacin de conidios mediante una
estructura que recuerda la forma de pincel, las ramificaciones terminan en unas
clulas que se conocen como fialides las cuales originan esporas.

Figura 5.Formas microscpicas del hongo aislado, caractersticas del gnero

Penicillium.

La produccin de lipasa se confirm por la formacin de un halo trasparente

alrededor de la colonia (Figura 7)

23
 Figura 6. Formacin de halo transparente en el medio productor de lipasas.

La produccin de lipasas es dependiente de factores importantes como el pH del

medio, la temperatura de crecimiento y la concentracin de oxgeno disuelto. Sin
embargo, es dependiente principalmente de agentes inductores como los aceites,
triacilglicridos, cidos grasos libres, steres hidrolizables, tween, sales biliares y
glicerol (Sharmaet al., 2001). Para B. sphaericus se ha encontrando que el mejor
inductor fue el aceite de ssamo (Manikandanet al., 2004), mientras que para la
levadura Candida rugosa, productora de lipasas a nivel industrial, fuentes de carbono
como cidos grasos, monooleato de sorbitnpolioxietilnico 80 (Tween
80), monolaurato de sorbitnpolioxietilnico 20 (Tween 20) o glucosa han resultado
ser los mejores inductores.

En este trabajo la variable que se evalu fue el agente inductor, probndose dos:
mantequilla y aceite de oliva en una cantidad de 0.3 gr., notando un mejor desarrollo
del hongo y un dimetro mayor del halo de inhibicin en este ltimo, sugiriendo que
la lipasa de este hongo responde favorablemente a los inductores de origen vegetal
coincidiendo con los estudios de Mendoza (2010) .

24
7.2.Crecimiento en cultivo en suspensin y determinacin de la actividad de
lipasa del hongo aislado.

El crecimiento se puede definir como el aumento ordenado de todos los

constituyentes qumicos de un organismo, en los organismos unicelulares conlleva al
aumento en el nmero de individuos en la poblacin. Uno de los mtodos ms
usados para medir el crecimiento microbiano es secar volmenes conocidos de
cultivo celular hasta obtener un peso constante. Con este fin se establecieron las
condiciones para la esporulacin de Penicilliumsp.,utilizando dos medios diferentes:
caldo dextrosa Sabouraud y extracto de malta encontrndose que el mayor nmero
de esporas se produjo en el primero (Tabla 1), esto se debe a las fuentes de
nitrgeno del medio.

Tabla 1.Generacin de esporas de Penicilliumsp., en dos medios de esporulacin.

Generacin de esporas
Das
caldo extracto de malta Caldo dextrosa Sabouraud
Nmero de esporas Nmero de esporas
7 16 46
20 66 337

El crecimiento del hongo aislado fue seguido a lo largo de 7 das. Puede observarse
un lento crecimiento durante las primeras 32 horas y el inicio de la fase estacionara
alrededor de las 72 horas (Figura 8). Resultados similares son reportados por Shafei
y Allam (2010) quienes encontraron que para Penicilliumchrysogenum la produccin
de biomasa se encuentra en su fase estacionaria a partir de las 72 h de fermentacin
prolongndose hastalas 172 h.

25
 concentracion g. micelio/ml

0.02 2
yY=0.0017079
= 0.0017085 + 7.253e-05x
+ 7.2535 R = 0.76282
x 10-5 R=0.87341
0.01
concentracion g. micelio/ml

0.01
0.01
0.01
0.01
0
0
0
-50 0 50 100 150 200
tiempo horas

Figura 7.Crecimiento de Penicilliumsp. En un medio (YMP suplementado con aceite

de oliva), con una temperatura de 22-23 C.

Los resultados obtenidos con respecto a la actividad lipoltica muestran que a las 72
horas se incrementa para decaer despus de 132. Shafei y Allam (2010) encontraron
pico mximo de actividad de lipasa a las 96 horas para Penicilliumchrysogenum.En
otro estudio realizado por Miranda y colaboradores (2009) en el que utilizaron un
reciduo solido agroindustrial reportandi que Penicilliumsimplicissimumencontrando
una mxima actividad de la lipasaque va de las 72 hasta las 92 horas de
fermentacin.

26
 1.2

0.163299316

0.098319208

0.484424057
1

0.051639778

0.172240142
0.13662601

0.103279556
0.104880885
0.8
Acidez (%)

0.6
0.116904519

0.4

0.2

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo (h)

Figura 8. Determinacin de acidez durante el crecimiento de Penicilliumsp

en un medio selectivo para microorganismos productores de lipasas.

Existen diferentes factores que pueden tanto inhibir como inducir la produccin de
lipasas, los cuales pueden variar segn el microorganismo, entre estos factores se
encuentra la fuente de nitrgeno, que generalmente es de tipo orgnico como
extracto de levadura, peptona y triptona, o de tipo inorgnico como el cloruro de
amonio. Entre los factores inhibitorios ms comunes se encuentran la presencia de
azcares, iones metlicos y sales, por su parte algunos sustratos lipdicos pueden
inducir dicha produccin (Sharmaet al., 2001).

Otro tipo de factores que influyen son el pH y la temperatura. Se ha reportado que la

mayora de los microorganismos presentan una mayor produccin de enzima a pH
7.0, mientras que aunque la temperatura puede o no estar relacionada, se ha
observado que estas enzimas generalmente estn activas en un rango entre 20-45C
(Sharmaet al., 2001).

27
En este trabajo no se evalu ninguna variable para optimizar la actividad lipoltica por
lo que ser necesaria la continuacin de la investigacin que lleve a un futuro
inmediato el optimizar las condiciones de produccin de la enzima o enzimas
presentes en Penicilliumsp., as como a su aislamiento y purificacin para su
aplicacin biotecnolgica.

28
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Se obtuvo y caracterizo una cepa de un hongosilvestre perteneciente al gnero

Penicillium, productor de una lipasa extracelular, pudindose establecer que la fase
estacionaria empieza alrededor de las 72 horas coincidiendo con la mxima actividad
lipoltica la cual decae completamente a las 132 horas de fermentacin.

Se recomienda evaluar otros inductores de la lipasa as como la optimizacin del

medio de cultivo y las condiciones de fermentacin para incrementar la produccin
de las enzimas y su actividad lipoltica.

Ser importante el considerar fermentaciones en estado slido ya que los medios de

cultivo pueden ser elaborados a partir de residuos agroindustriales, lo cual llevara a
una reduccin de los costos de produccin asociados al sustrato.

29
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