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m.

NTE INEN 1529-14 (1998) (Spanish): Control

microbiolgico de los alimentos.
Staphylococcus aureus. Recuento en placa de
siembra por extensin en superficie
 INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIN
Quito - Ecuador

NORMA TCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1 529-14:98

CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS. RECUENTO EN PLACA DE
SIEMBRA POR EXTENSIN EN SUPERFICIE.

Primera Edicin

First Edition

DESCRIPTORES: Alimentos, control microbiolgico, Staphylococcus aureus

AL 01.05-312
CDU: 614.31:579.672:579.86
CIIU: 9320
ICS: 07.100.30
 CDU: 614.31:579.672:579.86 CIIU: 9320
ICS: 07-100-30 AL 01.05-312

Norma Tcnica CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS. NTE INEN

Ecuatoriana STAPHYLOCOCCUS AUREUS. RECUENTO EN PLACA DE 1 529-14:98
Opcional SIEMBRA POR EXTENSIN EN SUPERFICIE 1998-01

1. OBJETO
Instituto Ecuatoriano de Normalizacin, INEN Casilla 17-01-3999 Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro Quito-Ecuador Prohibida la reproduccin

1.1 Esta norma describe el mtodo de recuento en placa de siembra por extensin en superficie para
determinar el nmero de clulas viables de S aureus coagulase positivos, presentes en un gramo
centmetro cbico de muestra de alimento.

2. ALCANCE

2.1 Este mtodo es indicado para productos de consumo humano y de alimentacin animal que
contengan una alta carga de estafilococos coagulasa positivos.

3. DEFINICIONES

3.1 Staphylococcus aureus: Especie bacteriana perteneciente a la familia Micrococcaceae y

al gnero Staphylococcus, cuyos miembros tienen la forma de cocos que generalmente se
agrupan formando racimos, inmviles, Gram positivos, aerobios y anaerobios facultativos,

temperatura ptima 37 C. Producen un pigmento amarillo dorado, son halotolerantes. Poseen
las enzimas coagulasa, fosfotasa y desoxirribonucleasa que le distinguen de otros
estafilococos. Producen exotoxinas: hemolisina y enterotoxina.

3.2 Recuento de Staphylococcus aureus: Es la determinacin del nmero de clulas viables de

Staphylococcus aureus presentes en un gramo o centmetro cbico de muestra, utilizando medios
selectivos.

3.3 Coagulasa: Enzima que coagula el plasma sanguneo de conejo o humano.

3.4 Termonucleasa: Enzima termoestable que degrada al cido desoxirribonuclico hasta nucletido.

4. FUNDAMENTO

4.1 Para el objeto de esta norma se utiliza el agar Baird-Parker. Este mtodo se basa en el acentuado
paralelismo que existe entre la produccin de coagulasa por parte del S.aureus y su capacidad
de utilizar la lipoprotena de la yema de huevo y de reducir el telurito a teluro. Las cepas que presenten una
reaccin negativa de la coagulasa, o dbilmente positiva, pueden ser distinguidas de otras
bacterias mediante un ensayo adicional, por ejemplo, la deteccin de termonucleasa.

5. MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

5.1 Medios de cultivo y reactivos

(Contina)
___________________________________________________________________________________
_
DESCRIPTORES: Alimentos, control microbiolgico, Staphylococcus aureus.

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NTE INEN 1 529-14 1998-09

5.1.1 Requisitos bsicos: Para que haya uniformidad en los resultados, es necesario que los
componentes de los medios sean de una calidad uniforme y de grado analtico o, a su vez, se
debe utilizar medios completos deshidratados, reconstituir y utilizarlos segn las instrucciones del fabricante.

5.1.2 Composicin y preparacin de los medios de cultivo y reactivos, ver NTE INEN 1 529-1.

5.1.2.1 Agar azul de O-toluidina-DNA (cido desoxirribonuclico)

5.1.2.2 Agar Baird Parker

5.1.2.3 Caldo infusin cerebro corazn (ICC) o caldo triptona soya (TSB).

5.1.2.4 Agua peptona al 0,1 %

5.1.2.5 Plasma de conejo con heparina o EDTA

5.2 Instrumental y vidriera

5.2.1 La vidriera debe resistir esterilizaciones repetidas y estar perfectamente limpia y estril.

5.2.1.1 Pipetas Pasteur.

3
5.2.1.2 Pipetas bacteriolgicas de boca ancha graduadas en 1/10 de cm .

5.2.1.3 Placas Petri de vidrio o desechables de 90 mm x 10mm y de 140 mm x 10mm.

5.2.1.4 Tubos de ensayo de 120 mm x 12 mm.

5.2.1.5 Tubos de 75 mm x 7 mm.

5.2.1.6 Tubos capilares de 3 mm de dimetro.

5.2.1.7 Varillas de vidrio en forma de L

5.2.1.8 Aguja de inoculacin, hecha preferiblemente de alambre de nicrn o de platino-iridio.

5.2.1.9 Microscopio

5.2.1.10 Estufa de secado, con regulador de temperatura

5.2.1.11 Incubadoras, con regulador de temperatura, para cultivos a 37 C y 43 C.

6. PREPARACION Y CONSERVACIN DE LA MUESTRA

6.1 La unidad analtica debe provenir de una unidad de muestra de por lo menos 100 g, segn la NTE INEN 1529-2
y ser preparada segn esta norma.

6.2 Las unidades de muestras perecederas que llegan al laboratorio deben mantenerse en refrigeracin de 0 C

a 5 C, por no ms de 24 h. En general, las muestras deben mantenerse en las condiciones
adecuadas al producto, hasta el momento del examen.

(Continua)
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7. PROCEDIMIENTO

7.1 Siembra

-1 3
7.1.1 A partir de la dilucin 10 , pipetear por duplicado volmenes de 0,1 cm sobre la superficie
seca de placas individuales de agar Baird Parker.
3
7.1.1.1 Inocular por duplicado volmenes de 1 cm de la muestra lquida (productos poco
3 -1
contaminados) , 1 cm de la suspensin madre (10 ) de otros productos en la superficie seca de
placas individuales grandes (140 mm de dimetro) de agar Baird Parker o, en la superficie de tres
placas de 90 mm de dimetro (para los recuentos y pruebas confirmatorias equivalen a una grande).

7.1.2 Con la varilla en L, diseminar el inculo, uniformemente, sobre la superficie del agar, hasta
que sea absorbido por el medio. Utilizar una varilla por dilucin.

7.1.3 Invertir las placas e incubar entre 35 y 37 C durante 32 2 h. Las placas de productos
fermentados o madurados en los que, los micrococos son mucho ms abundantes que los

estafilococos, es mejor que sean incubadas a 42 C durante 18 a 40 h.

7.2 Recuento de las colonias de S. aureus presuntivos

7.2.1 Elegir las placas de dos diluciones consecutivas que contengan entre 15 y 150 colonias
tpicas y/o atpicas. Las primeras se caracterizan por ser de forma regular, negras u oscuras
intensas, brillantes, convexas, con un estrecho borde blanco, rodeadas por un halo de medio transparente. Las
colonias atpicas de S. aureus yema de huevo negativas son sin halo transparente.

7.2.2 En cada una de las placas, contar las colonias sospechosas tpicas o atpicas y, si en una misma placa hay
desarrollo de estos dos tipos, contarlas separadamente.

7.2.3 Desechar las placas que en ms de la mitad de la superficie presentan crecimiento invasivo.
Si menos de la mitad de la superficie est cubierta, contar las colonias en la parte clara y extrapolar de tal manera
que, el nmero corresponda a la superficie total de la placa.

7.2.4 Si las placas de todas las diluciones contienen ms de 150 colonias, contar en las
placas inoculadas con la menor cantidad de muestra.

7.3 Seleccin y purificacin de colonias: Los ensayos confirmatorios deben realizarse a

partir de colonias previamente seleccionadas y purificadas.

7.3.1 De cada una de las placas seleccionadas (7.2), escoger al azar, las bien aisladas, en un
nmero equivalente a la raz cuadrada del nmero de colonias contadas en la placa, con un mnimo de cinco. Si
en una misma placa hay desarrollo de colonias con y sin halo transparente, tomar por separado la raz cuadrada del
nmero total de cada tipo de colonias contadas en la placa, mnimo cinco de cada tipo.

7.3.2 Evitando cualquier roce, tocar en el centro de cada una de estas colonias elegidas e inocularlas
3
individualmente, en tubos que contengan aproximadamente 5 cm de caldo infusin cerebro
corazn (ICC) o caldo soya triptona (TSB).

7.3.3 Incubar los tubos a 43 1 C durante 6 a 18 h

(Continua)

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7.3.4 De los tubos que presenten crecimiento, hacer un frotis y teirlo por el mtodo de Gram. Verificar la
presencia de solo cocos Gram positivos agrupados en racimo.

7.3.5 Con cada uno de estos cultivos, realizar la prueba de la coagulasa y termonucleasa, numeral 7.4.

7.4 Pruebas confirmatorias

7.4.1 Prueba de la coagulasa, ver Anexo A

3
7.4.1.1 En tubos de 75 mm x 7 mm que contengan 0,5 cm de plasma-EDTA de conejo, inocular
3
individualmente 0,1 cm de cada uno de los cultivos de presuntos S. aureus (7.3.4) y, en el tubo
3 3
control, pipetear 0,1 cm de ICC y 0,5cm de plasma.

7.4.1.2 Incubar los tubos en un bao de agua de 35 a 37 C por 4 a 6h.

7.4.1.3 A cada hora, inclinar delicadamente los tubos y observar la presencia de cogulos.

7.4.1.4 Si al inclinar el tubo, casi horizontalmente, sobresale un cogulo, considerar que la prueba
es positiva 2 +.

7.4.1.5 La formacin de un cogulo bien diferenciado que ocupe ms de los 3/4 del volumen original del lquido,
constituye una prueba de la coagulasa positiva 3 +.

7.4.1.6 Se tiene una prueba de la coagulasa positiva 4 +, cuando la coagulacin es total y el cogulo no se disloca
al invertir el tubo, siendo necesario agitar el tubo delicadamente.

7.4.1.7 Diferenciar los cogulos verdaderos de los falsos, agitando suavemente el tubo para
que los seudocogulos se deshagan.

7.4.1.8 En el tubo control, el plasma debe permanecer inalterado.

7.4.1.9 Considerar como S. aureus coagulasa positivos a aquellos que han producido una coagulacin de
3+ 4+.

7.4.2 Prueba de la termonucleasa

3
7.4.2.1 Distribuir en portaobjetos aproximadamente 3 cm de agar azul de toluidina O-cido
3
desoxirribonuclico (DNA) fundido o volmenes de 10 cm en placas Petri de 9 cm de dimetro. Dejar
solidificar el agar.

7.4.2.2 Con un capilar estril, hacer orificios de 3 mm de dimetro; (en cada portaobjetos puede caber 10 a 12
orificios).

7.4.2.3 Calentar los cultivos en ICC (7.3.4 y 7.3.5) en bao de agua hirviente durante 15 minutos.

7.4.2.4 Utilizando pipetas Pasteur o tubos capilares, depositar pequeas alcuotas de estos cultivos en cada
orificio.

7.4.2.5 Incubar las placas o los portaobjetos entre 35 y 37 C, en ambiente hmedo, durante 4 h.

(continua)

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7.4.2.6 La reaccin es positiva, cuando alrededor de los pocitos aparece un halo rosa brillante fuerte de
al menos 1 mm de ancho.

8. CLCULOS

8.1 Clculo del nmero de colonias de S. aureus por placa

8.1.1 En cada placa, calcular el nmero de S.aureus relacionando el nmero de colonias tpicas
sometidas a confirmacin que dieron coagulasa positiva con el total de las colonias tpicas contadas.

8.1.2 Si en las placas seleccionadas para el recuento se han desarrollado colonias tpicas y atpicas (7.2
y 7.3.1), realizar los clculos por separado, luego, sumar estos dos valores para obtener el nmero de S. aureus
por placa.

8.1.3 Cuando por lo menos el 80% de las colonias tpicas y atpicas sometidas a confirmacin son
coagulasa positiva, tomar el nmero de S. aureus presuntivos contados en 7.2 como el nmero de S.
aureus por placa.

8.2 Clculo del nmero, (N) de unidades formadoras de colonias (UFC), de S. aureus por
centmetro cbico gramo de muestra.

8.2.1 Placas que contienen entre 15 y 150 colonias. El nmero N de UFC de S. aureus se calcula
mediante la siguiente ecuacin:

nmero total de colonias calculadas

N=
Cantidad total de muestras sembrada

C
N=
V (n1 + 0,1n 2 )d

En donde:

C = suma de las colonias de S. aureus calculadas en todas las placas elegidas;

n1 = nmero de placas contadas de la primera dilucin seleccionada;
n2 = nmero de placas contadas de la segunda dilucin seleccionada;
-2
d = dilucin de la cual se obtuvieron los primeros recuentos, por ejemplo 10 ;
V = volumen del inculo sembrado en cada placa.

Ejemplo:
3
Volumen sembrado: 0,1 cm ;
2
Dilucin 10- : Placa a) 120 colonias tpicas y 20 atpicas;
Placa b) 100 colonias tpicas y 30 atpicas;
-3
Dilucin 10 : Placa a) 20 colonias tpicas y cero atpicas;
Placa b) 15 colonias tpicas y cero atpicas

(Continua)

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Clculo:

-2
Dilucin 10 :

Placa a) 120 tpicas y 20 atpicas:

- Siete de las 11 colonias tpicas seleccionadas, fueron coagulasa positiva, por tanto, 76 colonias son
consideradas de S. aureus.

- Dos de las cinco colonias atpicas seleccionadas fueron coagulasa positiva, luego, ocho de las 20 colonias
tpicas son consideradas S. aureus.

Total de colonias, tpicas y atpicas: 76 + 8 = 84

Placa b) 100 tpicas y 30 atpicas:

- Seis de las 10 colonias tpicas seleccionadas fueron coagulasa positiva, luego, 60 de las 100 son
consideradas de S. aureus.

- Dos de las cinco colonias atpicas fueron coagulasa positiva, por tanto, 12 de las 30 atpicas son de S.
aureus.

Total de colonias, tpicas y atpicas: 60 + 12 = 72

-3
Dilucin 10 :

Placa a) 20 colonias tpicas y cero atpicas:

- Tres de las cinco colonias seleccionadas fueron coagulasa positiva, luego, 12 de las 20 colonias son
consideradas de S. aureus.

Total de colonias tpicas: 12

Placa b) 15 colonias tpicas y cero atpicas:

- Cuatro de las cinco colonias (80%) fueron coagulasa positiva, luego, las 15 son consideradas de S. aureus

Total de colonias tpicas: 15

84 + 72 + 12 + 15
N =
0,1 (2 + 0,1 x 2)10 -2

183
=
0,002
4
= 83 181,1 expresar como 8,3 x 10

(Continua)

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8.2.2 Estimacin de nmeros pequeos

8. 2.2.1 Productos lquidos: si en las placas sembradas con muestra no diluida (producto original
lquido) se han desarrollado menos de 15 colonias de S. aureus, realizar los clculos utilizando
la siguiente frmula:

1
NE = m x
Vi

En donde:

NE = nmero estimado de colonias por centmetro cbico o gramo de muestra;

m = media de las colonias confirmadas en ambas placas;
Vi = volumen inoculado

8.2.2.2 Productos slidos: si las placas sembradas con la dilucin (suspensin) ms concentrada
presentan menos de 15 colonias de S. aureus, realizar los clculos con la siguiente frmula:

1
NE = m x xf
Vi
En donde:

f = factor de dilucin (valor inverso de la dilucin de la muestra).

8.3 Redondeo de nmeros: El valor obtenido redondear a dos cifras significativas, de la siguiente
manera (NTE INEN 52):

8.3.1 Si el tercer digito, empezando por la izquierda es menos de cinco, mantener inalterado el
segundo digito y reemplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el valor calculado fuere 83 181,
4
redondearlo a 83 000 y expresar como 8,3 x 10 . Si el tercer digito, empezando por la izquierda
es superior a cinco, aadir una unidad al segundo dgito. Por ejemplo, si el valor obtenido fuere 83
4
681 redondearlo a 84 000 y expresar como 8,4 x 10 .

8.3.2 Si el tercer digito empezando por la izquierda es igual a cinco y es seguido de por lo menos, un digito,
aadir una unidad al segundo digito y reemplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el valor
4
obtenido fuere 83 581, redondearlo a 84 000 y expresar como 8,4 x 10 . Si el tercer digito es igual a cinco y
no le sigue otro(s) dgito(s), lo es solo por ceros, aadir una unidad al segundo digito, si ste es
4
impar; si es par cero, conservado inalterado. Ejemplo, 83 500 redondear a 84 000 y expresar como 8,4 x 10 ;
4
82 500 redondear a 82 000 y expresar como 8,2 x 10 .

8.4 Presentacin de resultados

8.4.1 Presentar el resultado como nmero, N, de unidades formadoras de colonias, UFC, de

3
Staphylococcus aureus por cm g de muestra utilizando solo dos cifras significativas
X
multiplicadas por 10 , donde x es la respectiva potencia de 10.

8.4.2 Si las placas inoculadas con la dilucin o suspensin ms concentrada no contienen colonias de S. aureus,
expresar Ios resultados como: nmero estimado NE de UFC de S. aureus menor que (<) 1,0 multiplicado
3
por 1/ Vi y por el respectivo factor de dilucin f. Ejemplo, si se sembr alcuotas de 0,1 c m de la dilucin
-1
10 , expresar el resultado as:

(Continua)

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NTE INEN 1 529-14 1998-09

3 2
NE de UFC de S.aureus / cm g = < 1,0X,10

8.4.3 Si no hay desarrollo de colonias de S. aureus en las placas inoculadas con alcuotas no diluidas (producto
original lquido), expresar el resultado como:
3
NE de UFC de S. aureus < 1,0 x 1/Vi. Ejemplo, si se sembr 0,1 cm de muestra pura,
expresarse as:
3 1
NE de UFC de S. aureus/cm = < 1 , 0 x 1 0

8.4.4 Si las placas sembradas con la dilucin menos concentrada (productos slidos o
lquidos) presentan ms de 150 colonias confirmadas, expresar el resultado de la siguiente manera:
3
NE de UFC de S.aureus/cm g = > al valor obtenido x1/Vi x f e indicar entre parntesis la
dilucin.

Este resultado sirve como gua para decidir el nmero de diluciones que se han de realizar en
anlisis posteriores. La decisin de aceptacin o rechazo de una partida de alimentos debe
basarse solo en valores N.

9. PRECISION

9.1 Repetibilidad del recuento de colonias y error personal:

9.1.1 Los resultados obtenidos por la misma persona al contar por segunda vez las colonias
de una misma placa, no deben variar en ms del 5% y cuando realizado por otra persona, no ms del 10%

9.1.2 El mtodo de clculo relacionando el nmero total de colonias contadas en las placas
de dos diluciones consecutivas con el total de la muestra sembrada, aumenta la precisin
del resultado. Sin embargo, solo por razones estadsticas, en el 95% de los casos los limites
de confianza para la tcnica del recuento en placa vara de 16% a 52% , este intervalo
se ampla para los recuentos menores de 15 colonias por placa. En la prctica, se puede
encontrar una mayor variacin, especialmente entre resultados obtenidos por diferentes analistas.

10. INFORME DEL ENSAYO

10.1 En el informe del ensayo indicar la norma de referencia, la temperatura de

incubacin, los resultados obtenidos, todas las condiciones operativas no especificadas en
esta norma o aquellas consideradas como opcionales y los incidentes que puedan haber influenciado en el
resultado. Adems, se debe incluir toda la informacin necesaria para la completa identificacin de la muestra.

(continua)

-8- 1994-044
NTE INEN 1 529-14 1998-09

ANEXO A

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LA COAGULASA

(Continua)

-9- 1994-044
NTE INEN 1 529-14 1998-09

APNDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR

Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 52:94 Reglas para redondear nmeros.
Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-1:94 Control microbiolgico de los alimentos.
Preparacin de medios de cultivo.
Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 1529-2:94 Control microbiolgico de los alimentos. Toma y
preparacin de muestras.

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Norma Britnica BS 5763: Part 1: 1991 - ISSO 4863:1991 Methods for Microbiological examination of food

and animal feeding stuffs". Enumeration of micro-organisms - Colony count technique at 30 C. British
Standards Institution. London, 1991.

Norma Britnica BS 4285: Section 2.1: 1984 "Microbiological examination for dairy purposes". Enumeration
of microorganisms by poured plate technique. British Standards Institution. London, 1984.

Norma Britnica BS 5763: Part 7: 1983 - ISO 6888 - 1983 "Microbiological examination of food and animal
feeding stuffs" Enumeration of Staphylococcus aureus by colony count technique. British Standards
Institution. London, 1983.

Mossel, D.A.A., Moreno Garca, B. (1982). "Microbiologa de los Alimentos", 1a. edicin espaola. Acribia
Zaragoza - Espaa, 1982.

ICMSF. "Microorganismos de los Alimentos 1 - Tcnicas del Anlisis Microbiolgico". Acribia Zaragoza -
Espaa.

-10- 1994-044

INFORMACIN COMPLEMENTARIA

Documento: TITULO: CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS Cdigo:

NTE INEN 1529-14 ALIMENTOS. STAPHYLOCOCUSS AUREUS. RECUENTO EN AL 01.05-312
PLACA DE SIEMBRA POR EXTENSION EN SUPERFICIE
ORIGINAL: REVISIN:
Fecha de iniciacin del estudio: 1992-12-11 Fecha de aprobacin anterior por Consejo Directivo
Oficializacin con el Carcter de
por Acuerdo No. de
publicado en el Registro Oficial No. de

Fecha de iniciacin del estudio:

Fechas de consulta pblica: de a

Subcomit Tcnico: Control microbiolgico de los alimentos

Fecha de iniciacin: 1994-04-28 Fecha de aprobacin: 1994-05-31
Integrantes del Subcomit Tcnico:

NOMBRES: INSTITUCIN REPRESENTADA:

Dr. Ramiro Gallegos (Presidente) SUBDIRECTOR TECNICO

Bioq. Elena Larrea DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,
MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS
Ing. Bolvar Cano DIRECCION DE PROTECCION AL
CONSUMIDOR Y DIRECCION DE
NORMALIZACION
Dra. Hipatia Navas. (Secretaria Tcnica) DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,
MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS

Otros trmites:

El Consejo Directivo del INEN aprob este proyecto de norma en sesin de 1995-01-10

Oficializada como: OPCIONAL Por Acuerdo Ministerial No. 0427 de 1997-12-29

Registro Oficial No. 229 de 1998-01-06