Desarrollo del inoculo y cultivo

celular por lote de Pichia stipitis

Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia stipitis
NRRL Y-7124, utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono

NRRL Y-7124, utilizando Xilosa y

Glucosa como fuente de carbono

Crdenas Acosta Jos.

Cueva Paredes Estrella.
Li Salazar Ashley.
Silva Natividad Juan.
Yupanqui Bacilio Ivon.
 Desarrollo del inoculo y cultivo celular por lote de Pichia stipitis
NRRL Y-7124, utilizando xilosa y glucosa como fuente de carbono

NDICE
Pg.

I. OBJETIVOS 2

Objetivo general 2
Objetivos especficos2

II. METODOLOGA EXPERIMENTAL 3

Diseo de medios de cultivo 3

Preparacin de medios, programa de muestreos 5
CULTIVO DEL M.O, MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL 11

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS 18

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS 33

Preparacin de reactivos 33
Preparacin y esterilizacin de medios 33

V. REFERENCIAS BIBILIOGRFICAS 34

VI. ANEXOS 35

I. OBJETIVOS:
1.1 OBJETIVOS GENERALES:
- Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en
matraces, empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124,
evalundose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad de
agitacin en la cintica de crecimiento y la produccin de etanol.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:

- Disear y preparar el medio liquido de cultivo.
- Lograr la activacin celular y desarrollo del inoculo

1
- Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa
- Determinar la cintica de consumo de la fuente de carbono
- Determinar la cintica de generacin de etanol
- Determinacin del M, qs y los rendimientos del nutriente limitante
en clulas y en etanol, adems de las respectivas productividades en
clulas y etanol.
- Evaluar el valor del pH al inicio y al final de la cintica.

II. METODOLOGA EXPERIMENTAL:

II.1. DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO:

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la

eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y
la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar.
Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos
relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser
empleados como son los requerimientos nutricionales del
microorganismo y algunos especficos del proceso.

Para la formulacin del diseo de cultivo se tiene en cuenta los

siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo Pichia stipitis
NRRL Y-7124.

Para el Diseo del medio de cultivo:

Macronutrientes C, N, Mg, K y P

2
 Micronutrientes: Concentracin
Nutriente Zn, Ca, Fe, Cu, Co Peso
y (g)
(g/L) Mn
Extracto de levadura
Estado 3
Medio lquido 0.15
Peptona de casena 5 0.25
Agar 20 1
Extracto de malta 3 0.15

Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de

cultivo mnimo.

Fuente de carbono y energa (45%) : xilosa y glucosa

Fuente de N - 9% : Sulfato de amonio
Fuente de Mg 0.4% y S 0,25% : Sulfato de magnesio
heptahidratado
Fuente de K 0.5% : Fosfato dicido de
Potasio
Fuente de P 2.0% : Fosfato dicido de
Potasio

Xf =2 g/l

Condiciones de cultivo:

Temperatura : 30C
Velocidad de agitacin(Shaker) : 120 rpm

II.1.1. Medio Slido De Mantencin (Pgy- Agar)

TABLA 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin

(50 mL)

II.1.2. Medio Activacin:

3
 TABLA 02: Concentracin de Nutrientes para el medio de
activacin (30 mL)

Concentracin Peso
Nutriente
(g/l) (g)
Glucosa 10 0.3
xilosa 10 0.3
Extracto de
3 0.09
levadura
Extracto de malta 5 0.15
0.15
Solucin de sales 5 ml/L
ml
T: 30C, N: 120 rpm

II.1.3. Medio De Fermentacin

Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del

matraz.
Para una concentracin final: 2 g/l.

TABLA 03: Concentracin de Nutrientes para el medio de

fermentacin (200 ml)

Nutriente Concentracin (g/L) Peso (g)

Glucosa 0.2 0.04
Xilosa 3.49 0.698
(NH4)2SO4 1.57 0.314
KH2PO4 0.4 0.08
MgSO4-7H2O 0.15 0.03
Solucin de
5 ml/L 1ml
sales
Ajustar pH 4.5
T 30C, N 120 rpm

II.1.4. Nutrientes Para El Medio De Fermentacin:

% en % en Yx/s So S'o
Elemen
Nutriente P.M. Nutrien
to Clula (g/g) (g/l) (g/l)
te
C C5H10O5 150 46.57 48 0.52 3.49 3.49
C C6H12O6 180 46.57 40 0.43 4.19 8.38
N (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.30 0.78 1.57
S (NH4)2SO4 132 0.55 24.24 44.07 0.04 0.08
K KH2PO4 136 2.75 28.68 10.43 0.17 0.35

4
 P KH2PO4 136 2.5 22.78 9.11 0.20 0.40
(MgSO4.7H
Mg 246 0.3 9.87 32.90 0.05 0.11
2O)
(MgSO4.7H
S 246 0.55 12.99 23.62 0.08 0.15
2O)

Nutriente Limitante: Xilosa

Max =0.301

Tiempo de fermentacin: 7.6 horas

II.1.5. Sales Para El Medio De Fermentacin : por bibliografa

Nutriente Concentracin (g/l)

CaCl2.2H2O 2.9
ZnSO4.7H2O 0.4
FeSO4.7H2O 6.42
CuSO4.5H2O 0.25
CoCl2.6H2O 0.24
MgSO4.7H2O 2.2
HCl 0.06

2 PREPARACIN DE MEDIOS:

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de

fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la
productividad de los mismos.
Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de
naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos
ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de

5
 formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis
de metabolitos y para el mantenimiento celular.

2.2.1. Condiciones de Asepsia: Cuando se trabaja con cultivos

microbianos, la tcnica asptica se utiliza para prevenir la introduccin
de organismos adicionales al cultivo. Diagrama 1

2.2.2. Preparacin del medio de mantencin, segn la TABLA 01

para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124: Se inicia teniendo en
cuenta la referencia de composicin de medios de cultivo de
mantencin para Pichia stipitis NRRL Y-7124. Diagrama 02

2.2.3. Preparacin del medio de activacin, segn la TABLA 02

para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124. Diagrama 03

2.2.4 Preparacin del medio de fermentacin, segn la TABLA

03 para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y-7124 Diagrama 04

Diagrama 01

Matraz
-Nombre de
ROTULAR
cepa.
-Fecha.
Mechero bunsen Nombre del
ENCENDER Previamente desinfectado el
rea de trabajo con alcohol
de 96
6
 Si los matraces tienen un
Los Matraces SOSTENER tapn de algodn, aflojar un
poco de manera que no est
muy apretado

La boca de ambos matraces

FLAMEAR para matar cualquier
microorganismo presente en
el aire y que pueda

RETIRAR Tapar con el meique

FLAMEAR La Boca de ambos

matraces

Posicin inclinada (riesgo de

MANTENER contaminacin sea mnimo)

Inculo
SEMBRAR Matraz estril

Boca de los matraces

FLAMEAR taparlos de nuevo

Inculo
Matraces en el caldo
MEZCLAR
sembrado

Los tapones antes que los

FLAMEAR coloques en los matraces.

Diagrama 02
Agua destilada
MEDIR En una matraz de
250 ml.

PESAR Cantidades de cada

compuesto.

Agua destilada Hasta llegar a los 50

MEDIR ml que se requiere.
7

PREPARAR
CALENTAR
AGREGAR
COLOCAR
ENFRIAR
AGITAR
 En un Mechero Bunsen
(lograr una coloracin
celeste),

Constantemente con un
varilla por un minuto
(aparicin de la primera
burbuja).

5 tubos de ensayo con

tapa.

6-7 ml de la mezcla en
caliente a cada tubo de
ensayo, con pipeta de 10
ml.

Una vez tapados los tubos

de ensayos, por 1 hora.

En un vaso precipitado, y
llevarlos a la olla a presin
(auto clave).

121 C / 20 min

COLOCAR A posicin inclinada a T. Amb.

Diagrama 03
Componentes para el medio
PESAR
de la tabla N02
Por separado.
- Extracto de levadura en una
ESTERELIZAR matraz.
- Glucosa en un matraz de
125 ml.
- Las sales en un tubo de

DISOLVER Por separado los

componentes.

8
 ALISTAR El volumen de las sales
minerales.

Al matraz que contiene el

Sales
AGREGAR extracto de levadura, con
minerales
la ayuda de la micro
pipeta.

EL pH a 7 de la solucin
AJUSTAR que contiene glucosa y
xilosa.

ESTERELIZAR 121C 15

MEZCLAR

Diagrama 04

Componentes para el medio

PESAR
de la tabla N03 Cada compuesto en agua
destilada:
- Glucosa en un matraz de 1
DISOLVER L con agua destilada.
- (NH4)2SO4 en un matraz con
agua destilada
- Solucin de sales, KH2 PO4,
(MgSO4).7H2O en un matraz
con agua destilada.
ESTERELIZ Las disoluciones por
separado.
9
 ENFRIAR

ESTERILIZAR Materiales a utilizar, garantizar asepsia

Abajo el Mechero para mantener un ambiente estril

COLOCAR

SOMETER
El Asa Bacteriolgica al fuego del mechero hasta el rojo vivo.
2.2 CULTIVO DEL M.O, MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL,
ETC.
ENFRIAR
2.2.1 Resiembra celular (Solido - slido Por
) unos segundos
a Materiales y equipos:

Aza bacteriolgica
EXTRAER
Una Tubo
dedel
azada ensayo conEnsayo
Tubo de medio que
slido donde se
contena lasencuentra el M.O.
clulas desarrolladas en medio s
Mechero Bunsen, trpode y rejilla.

b Procedimiento:
RESEMBRAR
En tubos de ensayo preparados con medio slido (Agar)

REALIZAR Azada desde dentro hacia fuera en el tubo

LLEVAR A la Incubadora a 30C durante 24 a 48 horas.

10

FLAMEAR El tubo de Ensayo para cerrarlo

2.2.2 Activacin celular y desarrollo del inculo
a Materiales y equipos:

Matraz de 125 ml.

Algodn
Gasa
Agua destilada
Aza bacteriolgica
Shaker
Mechero Bunsen, trpode y rejilla

b Procedimiento:

TOMAR
Una azada de la cepa incubada en medio slido Pichia stipitis NRRL Y-712

INOCULAR En el Matraz con los 30ml del medio de activacin

TAPAR
El Matraz con un tapn de gasa y algodn.
Hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por
el incremento en la turbidez del medio.
LLEVAR Al Shaker a 120rpm, T = 35 C y un t = 24

11
 2.2.3 Determinacin de la cintica de crecimiento de la biomasa
(ESPECTOFOTOMETRO)

a Materiales y equipos
Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentacin
Espectrofotmetro
pH metro
Gasa y algodn
Centrifuga
INOCULAR
30ml de caldode(medio
Tubos ensayorico + biomasa) a un matraz de 1L contenido 270ml de medio
Capachos de papel aluminio
A partir de este paso se determinar la cintica de crecimiento de la biomasa.
b Procedimiento:
EXTRAER Una muestra de 5ml del caldo.

MEDIR X0 y S0 con D.O

man las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del mechero.

a de muestras se inicia desde la dilucin del medio de activacin en el medio de fermentacin.
se realizaran cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguie

EXTRAER 5ml del medio de cultivo

3ml para el tubo de espectrofotmetro y el resto se le agreg al tubo de centrifu

SEPARAR

MEDIR Absorbancia a 640nm y pH

COMPLETAR 5ml en el tubo de centrifugado, se devuelve.

2.2.4 Determinacin de la concentracin celular por D.O

a Materiales y equipos:
CENTRIFUGAR A la mxima velocidad por 20 minutos
Espectrofotmetro.
Centrfuga.

VERTER Y GUARDAR
El sobrenadante
12 en viales y ponerlos en refrigerador

Con el fin de despus determinar el consumo de sustrato

 Estufa.

b Reactivos:
Muestra del medio.
Agua destilada.

c Procedimiento:

TOMAR Volumen
conocido

CENTRIFUGA 5000 rpm ; Tiempo:

20

RESUSPENSE Sobrenadante

ELIMINAR Centrifugado con agua

destilada

5000 rpm ; Tiempo:

CENTRIFUGA 20 a fin de eliminar
R restos de sustrato que
NUEVAMENT pudieran alterar la
determinacin.

ELIMINAR Sobrenadante

REDISOLVER Precipitado

SECAR Estufa: 80 C
hasta peso
constante
2.2.5 Determinacin de azcares reductores: mtodo del DNS (cido
dinitrosaliclico)

a Materiales y equipos:
Espectrofotmetro.
Agitador magntico.
Mechero bunsen.

13
 Balanza analtica
Esptula.
Papel aluminio capachitos.
2 Vasos de precipitado de 1 litro
Matraz de aforo de 1 litro.
Pipeta.
Gradilla.

b Reactivos:

10 g /L de cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

200 mL / L de NaOH 2N
300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Sacarosa Estndar

c Procedimiento:

Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en

aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se
disuelve el cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un
matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolucin
de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un
litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la
muestra:

Volumen del reactivo DNS

AADIR
a un volumen de muestra a
analizar

MANTENER bao: agua a ebullicin

MEZCLA tiempo: 5

Agua ENFRIAR
destilada
10
volmenes
AADIR

14
Absorbancia a 540
LEER nm blanco: agua
destilada
 CINTICA CULTIVO CELULAR POR LOTES
Plan de Muestreos y Registro de Datos
Grupo: A3
Da de la experiencia:

Micro-organismo:
Fuente Carbono: ..pH T
C.. N rpm
TIEMPO Absorbancia Nombre del
N HORA Observaciones
(horas) (640 nm) alumno

15
 III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
III.1. PREPARACIN DE MEDIO SLIDO DE
MANTENCIN

a. Materiales y Equipos:

Balanza analtica: Las balanzas

analticas modernas, que pueden
ofrecer valores de precisin de lectura
de 0,1 micras a 0,1 mg, estn bastante
desarrolladas de manera que no es
necesaria la utilizacin de cuartos
especiales para la medida del peso.

Lo utilizaremos: En este caso

pesaremos todos los compuestos para
el medio as que tiene que ser con

Matraz Erlenmeyer: Es ms seguro

que un vaso de precipitado, ya que la
estructura del matraz evita perdidas de
la sustancia o solucin contenida
(agitacin o evaporacin).Es ideal para
agitar soluciones. Se puede tapar
fcilmente utilizando algodn o tapa.
Lo utilizaremos: Este se llena
primeramente con agua para diluir
todos los componentes pesados.

16
 Mechero Bunsen: Se utiliza para
calentar, fundir o evaporar
sustancias. La llama del mechero
que arde correctamente es
transparente y tiene un matiz
azulado.

Lo utilizamos: Aqu se calienta la

mezcla del matraz agitando con la
varilla de vidrio y hasta la aparicin
de la primera burbuja.

Esptula, pipeta: Objetos

de ayuda al pesar y medir
volmenes respectivamente.

Tubo de ensayo: Es un pequeo tubo

de vidrio con una abertura en la zona
superior, y en la zona inferior es cerrado
y cncavo. Esta hecho de un vidrio
especial que resiste las temperaturas
muy altas, sin embargo los cambios de
temperatura muy radicales pueden
provocar el rompimiento de tubo (Pyrex)
Lo utilizaremos: A estos tubos se le
adiciona 6-7 ml de la mezcla e
inmediatamente se tapa.

Varilla de vidrio: Son unas varillas

de unos 20 cm de longitud que se
utilizan para agitar las disoluciones
ayudando a que los slidos se
17 disuelvan en los disolventes ms
rpidamente.
Lo utilizaremos: nos ayuda al
 Glucosa Agua destilada

Olla a presin: Se introducen

los tubos y se afloja las tapas Algodn, gasa y capachitos
para el intercambio de gases de aluminio

b. Reactivos y nutrientes:

Cepa de Pichia stipitis NRRL

Y-7124: es una levadura
fermentadora de hexosas y
pentosas que presenta un
rendimiento de etanol de 0.4 gg-
1, sin produccin de xilitol. Este
cultivo a trabajar nos da

18
Extracto de levadura:
Es un excelente estimulador del
crecimiento de bacterias, es utilizado en
la preparacin de medios de cultivo
microbiolgicos. Extracto de Levadura es
la parte soluble en agua
de autolisis levadura que es
cuidadosamente controlada para

Extracto de malta
Peptona

III.2. PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN:

a. Materiales y Equipos:

Balanza analtica 2 matraces

Mechero Bunsen Una probeta de 100 ml

19
 Varilla de vidrio, pipeta y
Estufa: La estufa de secado es esptula
un equipo que se utiliza para
secar y esterilizar recipientes
de vidrio y metal en el
laboratorio. Se identifica
tambin con el nombre Horno

dispositivo que se utiliza en los

laboratorios de qumica y
biologa para mezclar lquidos
o
PH metro: es un sensor utilizado en el preparar disoluciones y suspen
mtodo electroqumico para medir siones
el pH de una disolucin. La
determinacin de pH consiste en
medir el potencial que se desarrolla a
travs de una fina
membrana de vidrio que separa
dos soluciones con diferente concentracin

b. Reactivos y nutrientes:

Glucosa: es un Extracto de
azcar que est levadura: Es un
presente de excelente estimula
manera natural en dor del crecimiento
elementos tales de bacterias,
como las frutas o20 es utilizado en la
la miel. Las frutas preparacin
tambin poseen de medios de
otro tipo de azcar
cultivo
natural que se
 Solucin de sales

Extracto de malta: Debido a su

especial sabor, color y agradable
aroma, el extracto de malta se usa
ampliamente en la industria
alimentaria con el fin de mejorar
las propiedades organolpticas,
valor nutricional, textura y vida til
de los productos.

Alcohol Agua destilada

III.3. PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN:

a. Materiales y Equipos:

21
2 matraces de 125 ml
Matraz 1L.

Balanza analtica Varilla de vidrio

Gasa, capachitos y pH metro

algodn.

b. Reactivos y nutrientes:

Sacarosa: es el trmino apropiado

para describir el azcar comn. Dos
azcares simples, glucosa y fructosa,
se combinan para formar el hidrato de
carbono complejo conocido como
sacarosa. La sacarosa es fina, incolora,
inodora y tiene un sabor dulce. La
sacarosa da un impulso de energa
rpida para el cuerpo. Es fermentable y

22
 Extracto de levadura Agua destilada

(NH4)2SO4 = sulfato de amonio: En

bioqumica, la precipitacin del sulfato de
amonio es un mtodo comn para purificar
las protenas al lado de precipitacin
selectiva; El sulfato de amonio es
extremadamente soluble en agua y as que
puede hacer las soluciones muy
concentradas que pueden salar hacia fuera
las protenas, causando su precipitacin en

KH2PO4 = fosfato de Alcohol

potasio:

MgSO4.7H2O Solucin de sales

c. Equipos

EQUIPO DESCRIPCIN

23
BALANZA ANALTICA
Marca: Adventurer

Una balanza analtica es una clase

de balanza de laboratorio diseada para
medir pequeas masas, en un principio
de un rango menor del miligramo (y que
hoy da, las digitales, llegan hasta la
diezmilsima de gramo: 0,00001 g o
0,01 mg).

CENTRFUGA
Marca: P-Selecta

Una centrifugadora es una mquina que

pone en rotacin una muestra para
(por fuerza centrfuga)
acelerar la decantacin o
la sedimentacin de sus componentes o
fases (generalmente una slida y una
lquida), segn su densidad. Es muy
usada en laboratorios de control de
calidad y en fbricas que
elaboran zumos a base de ctricos, para
controlar el nivel de pulpa fina, mediante
separacin del zumo exprimido.

ESPECTROFOTMETRO
Marca: Sigma
Modelo: 2-16PK
Un espectrofotmetro es un instrumento
usado en el anlisis qumico que sirve
para medir, en funcin de la longitud de
onda, la relacin entre valores de una
misma magnitud fotomtrica relativos a
dos haces de radiaciones y
la concentracin o reacciones qumicas
que se miden en una muestra. Tambin
es utilizado en los laboratorios de
qumica para
la cuantificacin de sustancias y microor
ganismos.

24
 PHMETRO
Marca: Inolab

El pH-metro es un sensor utilizado en el

mtodo electroqumico para medir
el pH de una disolucin. La
determinacin de pH consiste en medir el
potencial que se desarrolla a travs de
una fina membrana de vidrio que separa
dos soluciones con diferente
concentracin de protones. En
consecuencia se conoce muy bien la
sensibilidad y la selectividad de las
membranas de vidrio delante el pH. Una
celda para la medida de pH consiste en
un par de electrodos, uno de calomel
( mercurio, cloruro de mercurio) y otro de
vidrio, sumergidos en la disolucin de la
que queremos medir el pH.

AGITADOR MAGNTICO
Marca: Thermolyne
Modelo: Maxi-mix II

Un agitador magntico consiste de una

pequea barra magntica (llamada barra
de agitacin) la cual est normalmente
cubierta por una capa de plstico
(usualmente Tefln) y una placa debajo
de la cual se tiene una magneto rotatoria
o una serie de electromagnetos
dispuestos en forma circular a fin de
crear un campo magntico rotatorio. Es
muy frecuente que tal placa tenga un
arreglo de resistencias elctricas con la
finalidad de dotarle de calor necesario
para calentar algunas soluciones
qumicas.

- Fermentador:
Marca: Sartoriustedin
Capacidad: 2 litros
Partes: software, CPU, reactor.

25
 Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
biolgicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un
recipiente en el que se lleva a cabo un proceso qumico que involucra
organismos o sustancias bioqumicamente activas derivadas de
dichos organismos. Este proceso puede ser aerbico o anaerbio.
Estos biorreactores son comnmente cilndricos, variando en tamao
desde algunos mililitros hasta metros cbicos y son usualmente
fabricados en acero inoxidable. Un biorreactor puede ser tambin un
dispositivo o sistema empleado para hacer crecer clulas o tejidos en
operaciones de cultivo celular. Estos dispositivos se encuentran en
desarrollo para su uso en ingeniera de tejidos.

- Shaker: El agitador orbital modelo SAROTIUS STEDIM est diseado

para usos generales en laboratorios de anlisis clnicos, industriales,
de fsica, qumica y en todo tipo de ensayos que requieran agitar,
mezclar, disolver casi todo tipo de lquidos y soluciones con distinto
grado de viscosidad. Estn diseados ergonmicamente para ser
funcionales y confiables ahora y en el futuro. Su sistema
microprocesado, permite un control exacto de la velocidad de giro,
independiente de la carga, puesto que supervisa constantemente la
velocidad corrigiendo automticamente cualquier variacin de la
misma. Posee adems un timer que permite controlar con precisin
en el tiempo de la experiencia a realizar. El dispositivo mecnico de
agitacin est formado por una base amplia, metlica, con fuertes
nervaduras, y una plataforma mvil.

26
 - OLLA A PRESIN (AUTOCLAVE)

La olla a presin es un recipiente hermtico para

cocinar que no permite la salida de aire o lquido por
debajo de una presin establecida. Debido a que el
punto de ebullicin del agua aumenta cuando se
incrementa la presin, la presin dentro de la olla
permite subir la temperatura de ebullicin por
encima de 100 C . La temperatura ms alta hace
que los alimentos se cocinen ms rpidamente
llegando a dividirse los tiempos de coccin
tradicionales por tres o cuatro. Por ejemplo, un
repollo se cocina en un minuto, los porotos verdes en
cinco, las papas pequeas y medianas (hasta 200g) pueden tardar unos
cinco minutos y un pollo completo no ms de veinticinco. Generalmente, se
utiliza para conseguir en un corto periodo de tiempo los mismos efectos de
la coccin a fuego lento.
- AUTOCLAVE
Una autoclave es un recipiente de presin metlico de paredes
gruesas con un cierre hermtico que permite trabajar a alta presin
para realizar una reaccin industrial, una
coccin o una esterilizacin con vapor de agua.
Su construccin debe ser tal que resista la
presin y temperatura desarrollada en su
interior. La presin elevada permite que el agua
alcance temperaturas superiores a los 100 C.
La accin conjunta de la temperatura y el vapor
produce la coagulacin de las protenas de los
microorganismos, entre ellas las esenciales para
la vida y la reproduccin de stos, hecho que
lleva a su destruccin.

27
 MENU DE LLAVE DE
MANOMETRO
CONTROL SEGURIDAD

- REFRIGERADORA DOMESTICA

MARCA: PHILLIPS
DESCRIPCION: La funcin de una mquina de
refrigeracin es tomar el calor de un ambiente a
baja temperatura (en este caso un armario cerrado y
aislado trmicamente) y cederlo en el ambiente
exterior (para el refrigerador domstico sera la
cocina), empleando una fuente de energa externa
para mantener el proceso. Un refrigerador es una
bomba de calor (como las de agua, bombea calor de
un lugar a bajo nivel trmico a otro de mayor
nivel), impulsada generalmente por un motor elctrico. Es asimismo posible
emplear sales eutcticas o absorcin.
- ESTUFA ELECTRICA:

MARCA: P-SELECTA
MODELO: 209
DESCRIPCION: Equipo de 75 litros de capacidad,
con una cavidad de 500 x 400 x 400 mm, que
permite el secado de muestras en un rango de
temperatura til comprendido entre 0 y 200 C.
La estufa de secado se emplea para esterilizar o
secar el material de vidrio y metal utilizado en
los exmenes o pruebas, que realiza el laboratorio y que proviene de la
seccin de lavado, donde se enva luego de ser usado en algn
procedimiento. La esterilizacin que se efecta en la estufa se denomina de
calor seco y se realiza a 180 C durante 2 horas; la cristalera, al ser
calentada por aire a alta temperatura, absorbe la humedad y elimina la

28
posibilidad de que se mantenga cualquier actividad biolgica debido a las
elevadas temperaturas y a los tiempos utilizados.
- INCUBADORA ELECTRICA

MARCA: P-SELECTA
MODELO: 206
DESCRIPCION: una incubadora es un dispositivo que
sirve para mantener y hacer crecer cultivos
microbiolgicos o cultivos celulares. La incubadora
mantiene la temperatura, la humedad y otras
condiciones en grado ptimo, tales como el contenido
de dixido de carbono (CO2) y de oxgeno en su
atmsfera interior. Las incubadoras son esenciales
para una gran cantidad de trabajos experimentales
en biologa celular, la microbiologa y en biologa
molecular y se utilizan para cultivos celulares, tanto
bacterianos como de clulas eucariotas.

CUADRO DE RESUMEN: MATERIALES A UTILIZAR

Instrumentos MANTENCIO ACTIVACIO FERMENTACI

N N ON
Asa x
bacteriolgica
Matraces x x x
Tubos de ensayo x x
Mechero x x
Rejilla de x
asbesto
Trpode x x
Pipeta x
Shaker x x
Refrigeradora
Estufa elctrica x
Incubadora x
elctrica
Olla a presin x x
(autoclave)
Algodn x
Gasa x x
Balanza x x
analtica
pH-metro x x
Papel aluminio x

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 MEDIO NUTRIENTE
Solido de Extracto de levadura
Peptona de casena
mantencin
Agar
(PGY- Agar) Extracto de malta
Extracto de peptona
Peptona de casena
Activacin
K2HPO4
Glucosa
Glucosa
Xilosa
Fermentacin (NH4)2SO4 CUADRO
DE KH2PO4
MgSO4-7H2O
Solucin de sales
RESUMEN: REACTIVOS QUE UTILIZAREMOS

30
31
I CRONOGRAMA DE ACTIVIDAFES Y/O TAREAS:

32
II REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Biotechnol. Bioprocess. Eng. 2000, 5: 27-31 - Department of

Molecular Science and Technology, Ajou University, Suwon 442-
749, Korea - Enari, T. M. and M. L. Suihko (1984)

Ethanol production of pentose and hexoses from cellulose

materials. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1: 229-240. - Vol. 28, No.
01, pp. 151 - 156, January - March, 2011 - Martnez, A.,
Rodrguez M. E., York S. W.

Determinacin de parmetros de co-cultivo de

scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae para la
fermentacin de residuos lignocelulosicos para la obtencin de
bioethanol Ana Karina Castillo Plata

III ANEXOS, clculos:

HALLANDO EL % EN CLULAS: se sabe la frmula del m.o.:

33
 CH1,79 O0,6 N0,17

Peso % por
Cantida
ELEMENTO molecul Peso (g) element
d
ar o
C 12 1 12 46.57
H 1 1.79 1.79 6.95
O 16 0.6 9.6 37.25
N 14 0.17 2.38 9.24
TOTAL(g) 25.77

Peso (g) = peso molecular * cantidad

Peso ( g )100
por elemento=
TOTAL

Calculando el porcentaje por elemento por tablas para

bacterias:
Elemen Porcenta PROMEDI
to je O
S 0.1 1 0.55 %
Mg 0.1 0.5 0.3%
K 1 4.5 2.75%
P 2-3 2.5%
Fe 0.02-0.2 0.11%

HALLANDO EL % EN NUTRIENTE:

PM del componentecantidad
%NUTRIENTE= X 100
PM del compuesto

HALLANDO EL % Y X/S: (solamente para el carbono multiplicar la

formula de rendimiento por 0.5)
nutriente
Y x / s=
celula

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 HALLANDO EL % S0:
Biomasa
So=
Y x /s

Dato:
C0= 10%Cf= 10% (2) =0.2
Cf-Co= biomasa=2-0.20=1.8

HALLANDO EL % S0: menos al limitante

So =So2

HALLANDO TIEMPO DE FERMENTACION:

X
ln ( )
Xo
= Maxt

ln ( 0.22 )=0.301t
t=7.6 horas=7 horas ,36 min

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