UNIVERSIDAD NACIONAL DE ANCASH

SANTIAGO ANTUNEZ DE
FACULTAD: MAYOLO
ING. DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

ESCUELA:

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO:

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRATICA N7 y 8: DETERMINACIN DE COLIFORMES POR

.

EL MTODO DEL NMP

DOCENTE:

GAMARRA RAMIREZ NORMA E.

ALUMNO:

CODIGO:

ALVARADO JAMANCA JORGE J.

101.0204.478

HUARAZ-ANCASH-PERU

2014

I.

INTRODUCCIN

Los microorganismos coliformes son un grupo de especies bacterianas

que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia
relevante como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.
Los agentes patgenos transmitidos por el agua constituyen un problema
mundial que demanda un control urgente mediante la implementacin de
medidas de proteccin ambiental a fin de evitar el incremento de las
enfermedades relacionadas con la calidad del agua Los microorganismos
coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o
anaerobios facultativos, y fermentan la lactosa a 35 C con la produccin
de cido y gas.
El grupo de los microorganismos coliformes es el ms ampliamente
utilizado en la microbiologa de los alimentos como indicador de
prcticas higinicas inadecuadas. El uso de los coliformes como indicador
sanitario puede aplicarse para:
La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en

la fabricacin de los alimentos.

La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque

su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.

Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas del

equipo.
La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes
reas del procesamiento de alimentos.

II.

OBJETIVOS
Brindar al estudiante la tcnica del cmputo bacteriano a travs
del mtodo de Nmero Ms Probable
Distribuir paso a paso la identificacin de coliformes totales y
coliformes fecales: E.coli

III.

FUNDAMENTO TERICO
1. IMPORTANCIA DE LOS ORGANISMOS COLIFORMES

El uso de organismos intestinales normales como indicadores de contaminacin

fecal, en lugar de los patgenos mismos, es un principio de aceptacin universal
en la vigilancia y evaluacin de la seguridad microbiana en los sistemas de
abastecimiento de agua. Lo ideal sera que el hallazgo de dichas bacterias
indicadoras denotara la presencia posible de todos los organismos patgenos
pertinentes. Las exigencias a las que debe responder un organismo indicador
las podemos agrupar en:
Epidemiolgicas: La relacin entre un indicador, su naturaleza o concentracin
y la probabilidad de aparicin de infecciones en la poblacin debe establecerse
a partir de estudios o encuestas epidemiolgicas.
Ecolgicas: Un buen indicador debe ser especfico de contaminacin fecal;
debe hallarse de forma constante en las heces de los animales de sangre
caliente y estar asociado de forma exclusiva a las aguas residuales. Es decir, su
presencia en ambientes no polucionados debe ser mnima o nula.
Bacteriolgicas: Los organismos indicadores deben ser ms resistentes que los
patgenos a los agentes desinfectantes y por otra parte, ser incapaces de
reproducirse o crecer, en el ambiente acutico.
Taxonmicas: Los organismos indicadores deben ser fcilmente reconocibles y
clasificables en especies de acuerdo con los criterios bacteriolgicos
existentes. Es decir, cuando un organismo indicador corresponda a una
poblacin de determinados organismos, sta debe estar perfectamente
definida.
Metodolgicas: Un buen organismo indicador debe ser fcilmente aislable,
identificable y enumerable en el menor tiempo posible y con el menor coste.
Debe ser capaz de crecer en los medios de cultivo empleados, estar distribuido
al azar en las muestras y ser resistente a la inhibicin de su crecimiento por
otras especies.
(LOPEZ; VZQUEZ y PENA)
2. CARACTERSTICAS
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos
a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato

de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa
como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio
de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo
permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y
producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un
periodo de 24 a 48 h.
La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de
caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y
diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y
posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las
colonias tpicas.
(Camacho; Giles; Ortegn, M. Palao, B. Serrano y O. Velzquez)

3. PRUEBA DE LA PRODUCCIN DE INDOL

El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado pro ciertas bacterias
para formar tres metabolitos principales indol, escatol e indolacetico. Diversas
enzimas intracelulares que intervienen en este proceso reciben el nombre de
triptfanos, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la
produccin de indol. El principal intermediario en la degradacin del triptfano
es cido indolpiruvico.
La degradacin del triptfano libera indol, acido pirvico, amoniaco y energa.
El cido pirvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo
glucoltico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO2 y H2O y una gran
produccin de energa. El NH3 puede ser utilizado para sintetizar nuevos
aminocidos empleando la energa que se encuentra para la reaccin anablica.
La prueba de indol se bas en la forma de un complejo de color rojo cuando el
indol reaccin con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehdo (sustancia
activa del reactivo Kovacs).

La formacin de indol se produce solamente en aquellos organismos capases de

fermentar los hidratos de carbono. La elevada cides producida por la
fermentacin de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o
inhibir la enzima.
El agregado de triptfano estimula la produccin de indol mientras que la
glucosa la inhibe.

(Bailn; cruz Gonzales y cervantes)

IV.

MATERIALES Y MTODOS
a) Materiales:
Materiales de vidrio esterilizados:
Matraz

Tubos de ensayo
Pipetas graduadas 1; 5 y 10 ml.
Campana Durkham
Bao Mara
Incubadora
Solucin regladora de peptona
Caldo lauril
Caldo verde brillante bilis_ brilla)
b) mtodos
Se prepar la homogenizacin de alimentos similar al RAP.
Se efecto la dilucin similar al RAP.
Inoculacin: Se inoculo en cada uno de los tubos que contiene el caldo de
Lauril provistos de campana Durkham, previamente rotulados 1ml del

alimento homogenizado, con las diluciones -1,-2,-3.

Se inocular los tubos de Lauril a 35C por 48 hrs.
De cada uno de los tubos de Lauril se verifico aquellos que han producido

gas (ms de la mitad de la campana Durkham).

Se forman 3 grupos de 3 tubos con campana Durkham conteniendo caldo
Brilla (Verde Brillante Bilis), se efecta la inoculacin de los positivos
con una asa de Folle previamente flameada a cada uno de los tubos,
respetando las diluciones e incubar a 35C x 48hrs. La formacin de gas

en el tubo de Brilla confirma la presencia de Bacterias Coliformes.

De los tubos positivos de la prueba precedente deben ser inoculados a
otras series de tubos que contiene Caldo E. Coli provistos de campanas e
incubar en bao mara a 45C x48hrs .La prueba positiva para E.coli es la

formacin de gas en la Campana Durkham y ligero enturbiamiento.

Luego se procedi a la prueba del indol, la cual ser positiva a la
aparicin de un anillo rosado que se forma en la superficie, al agregarle 3

gotas del Reactivo Kobacs al Indol.

Ambas pruebas positivas: Del E.coli e indol indican la presencia de

Coliformes Fecales.
Con los tubos de coliformes positivos se efecta el clculo NMP de
acuerdo al nmero de estos de una determinada dilucin, mediante la
Tabla NMP.

TABLA DE NMP:

Numero de Tubos
1:10

V.

1:100

NMP (gr o ml)

1:1000

ndice de confianza
Inferior
Superior

0
0
0

0
0
1

0
1
0

3
3
3

0.5
0.5

9
13

1
1
1
1

0
0
1
1

0
1
0
1

4
7
7
11

0.5
1
1
3

20
21
23
36

1
2
2
2

2
0
0
1

0
0
1
0

11
9
14
15

3
1
3
3

36
36
37
44

2
2
2
3

1
2
2
0

1
0
1
0

20
21
28
23

7
4
10
4

47
47
150
120

3
3
3
3

0
0
1
1

1
2
0
1

39
64
43
75

7
15
7
14

130
380
210
230

3
3
3
3

1
2
2
2

2
0
1
2

120
93
150
210

30
15
30
35

380
380
440
470

3
3
3
3

3
3
3
3

0
1
2
3

240
460
1100
2400

36
71
150

1300
2400
4800

RESULTADOS Y DISCUSIONES
a) Resultados:
Procedimiento a seguir:

90 ml
diluyente
+ 10 ml
de
muestra

1 ml de
diluyente +
muestra

Por consiguiente se obtuvo:

Prueba presuntiva:

9ml de
diluyente en
cada tubo

Como se puede observar en los tubos (+) existe presencia de gas;

enturbiamiento del medio y un precipitado blanco.
Numero de Tubos
1:10

1:100

NMP (gr o ml)

1:1000

150

ndice de confianza
Inferior
Superior
30

Por lo tanto:
150 coliformes total / ml de agua de rio
Prueba confirmativa:
1. Caldo Brilla:
Como se puede observar en los tubos (+) existe presencia de gas;
enturbiamiento del medio y un precipitado blanco.

440

Numero de Tubos
1:10

1:100

NMP (gr o ml)

1:1000

150

ndice de confianza
Inferior
Superior
30

440

Por lo tanto:
150 coliformes / ml de agua de rio
2. Caldo E.Coli
Como se puede observar en los tubos (+) existe presencia de gas; enturbiamiento
del medio y un precipitado blanco.

Numero de Tubos
1:10

1:100

NMP (gr o ml)

1:1000

150

ndice de confianza
Inferior
Superior
30

440

Por lo tanto:
150 coliformes de E. Coli/ ml de agua de rio

b) Discusin:
En el desarrollo de la prctica se dio la aplicacin del mtodo donde deben
cumplirse dos condiciones: que los microorganismos estn distribuidos al azar y
que la presencia de un solo microorganismo viable en el volumen inoculado, d
lugar a desarrollo visible luego de la incubacin. Esto se cumple con lo dicho en
la bibliografa y comparacin de la prctica.
Estos mtodos se utilizan para la observacin de la existencia de coliformes
fecales y totales en el agua principalmente como se ven nuestros resultados
existen una alta cantidad de coliformes por ml al comparar con los valores de
consumo de agua y hielo para el ser humano.

VI.

CONCLUSIONES

 Como se pudo observar la existencia de coliformes en la muestras

por consiguiente en la muestra presenta una alta cantidad de
microorganismos patgenos.
Reconocemos y ponemos en prctica las tcnicas rpidas y
adecuadas as realizamos el anlisis cualitativo y cuantitativo par
tener los resultados de presencia de coliformes en agua.
Cada estudiante se familiariza con estos mtodos y aprende el
proceso que se realiza paso a paso la metodologa para la
determinacin de coliformes en agua que se dio en esta prctica.
VII.

RECOMENDACIONES
Extraer algunas muestras con un recipiente completamente
esterilizados.
Toda muestra al momento de ser tomada es necesario que este
bien rotulada y que esta sea completamente representativa.
Algunos tubos no presentan precipitados blancos pero si gases.
Realizar los clculos correctamente para la preparacin de
caldos para determinar coliformes.

VIII.

CUESTIONARIO
1. Porque los organismos coliformes son considerados como
indicadores de la calidad de los alimentos.

La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas

que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante

como indicadores de contaminacin del agua y los alimentos. Tradicionalmente se

los ha considerado como indicadores de contaminacin fecal en el control de
calidad del agua destinada al consumo humano en razn de que, en los medios
acuticos, los coliformes son ms resistentes que las bacterias patgenas
intestinales y porque su origen es principalmente fecal. Por tanto, su ausencia
indica que el agua es bacteriolgicamente segura.
Asimismo, su nmero en el agua es proporcional al grado de contaminacin fecal;
mientras ms coliformes se aslan del agua, mayor es la gravedad de la descarga
de heces.
En la higiene de alimentos los coliformes no se consideran indicadores de
contaminacin fecal sino solamente indicadores de calidad.
Los coliformes totales se usan para evaluar la calidad de la leche
pasteurizada, leche en polvo, helados, pastas frescas, frmulas para
lactantes, fideos y cereales para el desayuno.
Los coliformes fecales se usan para evaluar los mariscos frescos.
Por ltimo, la E. coli se usa como indicador en quesos frescos, quesillo.
2. Indique tipos de coliformes se podra encontrar en carnes de
pollo refrigerada y porque.
Los microorganismos psicrotrofos (microorganismos que crecen a temperaturas
de refrigeracin) son especialmente importantes en aquellos productos que se
conservan refrigerados. Algunos de ellos pueden causar modificaciones
organolpticas, como olores anormales muy variados.
Las pseudomonas son los microorganismos principalmente responsables de la
alteracin superficial de la carne de pollo refrigerada en atmsferas aerobias.
Las pseudomonas son una de las fuentes ms importantes de la alteracin de los
alimentos.
La mayor parte de las enterobacterias presentes en la superficie de las canales
procede de contaminacin de origen fecal y su presencia en niveles elevados
puede indicar una manipulacin poco higinica y/o un almacenamiento inadecuado.
Los mohos y las levaduras estn distribuidos ampliamente en el ambiente y
pueden llegar a los alimentos a travs del equipo o aire contaminados. Aunque la
escasa vida til de la carne de pollo limita estas repercusiones de la

contaminacin fngica, puede provocar infecciones o incluso desencadenar

reacciones alrgicas.
3. Que otros microorganismos indicadores se conocen en los
alimentos.
Salmonella.
Enterococos.
Clostridium.
Sthapylococcus aureus.

IX.

BIBLIOGRAFA

 GOEZ LOPEZ, Mariano; VZQUEZ GARCA, Mara Jos; PENA

CAAMAO, Pilar; Determinacin y diferenciacin de escherichia coli y
coliformes totales usando un mismo sustrato cromogenico (Laboratorio
Central. Aquagest Galicia)
http://www.bvsde.paho.org/acrobat/determi.pdf

Camacho, A., M. Giles, A. Ortegn, M. Palao, B. Serrano y O. Velzquez.

2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecalesEcoli-NMP_6529.pdf
Q.F.B LUCIA BAILON LIRA; Q.F.B. ROBERTO CRUZ GONZALES MENDEZ Y
M. EN C. ARMANDO CERVANTES SANDOBAL; Atlas de Pruebas Bioqumicas
Para Identificar Bacterias: Universidad Nacional Autnoma de Mxico; 2003;
pag. 82

http://microbitos.files.wordpress.com/2010/06/atlasmicrobiologia1.pdf