VECTORES LIPIDICOS EN TERAPIA GENICA

ISSN 0025-7680
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MEDICINA (Buenos Aires) 2000; 61: 205-214

ARTICULO ESPECIAL

VECTORES LIPIDICOS
NUEVAS ESTRATEGIAS APLICADAS A LA TERAPIA GENICA
EDER L. ROMERO1, MARIA JOSE MORILLA1, LAURA S. BAKAS2, 3
1

Departamento de Ciencia y Tecnologa, Universidad Nacional de Quilmes; 2 Departamento de Ciencias Biolgicas, Facultad
de Ciencias Exactas; 3 INIBIOLP, Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de La Plata
Resumen

A diferencia del resto de las molculas biolgicas, los fosfolpidos son capaces de autoensamblarse
espontneamente. Con ellos es relativamente simple generar estructuras selladas extremadamente
estables, de tamao, forma y empaquetamiento controlables, llamadas liposomas. En este artculo revisaremos el
uso de liposomas para generar vectores que mejoren los procesos de transfeccin en clulas eucariotas, tanto in
vivo como in vitro. Empleando vectores lipdicos, es potencialmente posible enviar selectivamente un segmento de
ADN a cualquier sitio del cuerpo, forzarlo a ingresar al interior celular y aun controlar el destino intracelular de la
carga transportada. La clave del xito de la transfeccin por medio de vectores lipdicos radica en que protegen
mecnicamente al ADN de la degradacin plasmtica, ofreciendo a la vez la oportunidad de controlar su
biodistribucin, independientemente del tamao del segmento de ADN que se quiera expresar. Asimismo, son no
carcinognicos y pobremente inmunognicos. Los avances en la qumica de sntesis de lpidos permitirn construir
vectores cada vez ms eficientes, que compitan con los altos niveles de transfeccin de los vectores virales, sumado a las ventajas de extrema versatilidad, facilidad de preparacin y bioseguridad propias de las molculas
autoensamblables.
Palabras clave: liposomas, lipoplex, lpidos catinicos, encapsulacin, terapia gnica, transfeccin

Lipid vectors. New strategies for gene therapy. Phospholipids are capable of spontaneous selfassembling, a remarkable differential property if compared with the rest of biological molecules. By
their means it is relatively easy to generate extremely stable sealed structures, with controlled shape, size and
packing, known as liposomes. In this article, we review the use of liposomes to improve the transfection process in
eucariotic cells, in vitro as well as in vivo. By employing lipid vectors, it is feasible to selectively transport a DNA
segment to any target of the body, to force it to enter a cell and once inside it, to exert a control on its ultimate
intracellular fate. The goal of lipid vectors to succesfully transfect a cell in vivo, lies on the provision of a mechanical
protection for DNA against plasma degradation, together with the possibility of controlling DNA biodistribution,
independently of its size and sequence. Moreover, lipid vectors are not carcinogenic and are poorly immunogenic.
Current challenge in lipid synthesis allows for a vector design which should be efficient enough to compete with
high transfection levels of a viral vector, but with the extreme versatility, simplicity and biosafety characteristic of
self assembling molecules.
Abstract

Key words: liposomes, lipoplex, cationic lipids, encapsulation, gene therapy, transfection

Cmo y por qu buscar nuevas estrategias

de liberacin en terapia gnica
El tratamiento de enfermedades a travs de la estrategia conocida como terapia gnica, consiste en introducir
material gentico exgeno en clulas o tejidos para la
cura o mejora de sntomas asociados 1. El material
gentico puede introducirse en forma de largas cadenas
de ADN o bien en forma ON de 15-20 bases de longi-

Recibido: 15-III-2000

Aceptado: 5-IV-2000

Direccin postal: Dra. Eder Romero, Departamento de Ciencia y Tecnologa, Universidad Nacional de Quilmes, Saenz Pea 180, 1876
Bernal, Argentina
Fax: (54-11) 4365-7100
e-mail: elromero@unq.edu.ar

Abreviaturas
ADN: cido desoxirribonucleico
ARN: cido ribonucleico
CAT: cloramfenicol acetil transferasa
DC-COL: (3 [N-(N'-dimetilaminoetil)-carbamoil] colesterol)
DMPC: 1,2 dimiristoilfosfatidilcolina
DMRIE: ()-N-(2-hidroxietil)-N, N, dimetil-2,3-bis (tetradecicloxi)-1propaminim bromide)
DOPC: 1,2 dioleoilfosfatidilcolina
DOPE: 1,2 dioleoilfosfatidiletanolamina
DOSPA: 2,3-dioleoiloxi-N(2(espermincarboxiamido)etil)N-N-dimetil1propanoamonio trifluoroacetato
DPPC: 1,2 dipalmitoilfosfatidilcolina
DSPE: 1,2 diestearoilfosfatidilcolina
EDTA: etilendiaminotetracetato
ON: oligonucetidos
PEG: polietilenglicol
SMNF: sistema mononuclear fagocitario
SLN: seales de localizacin nuclear
VML: vesculas multilamelares
VU: vesculas unilamelares
VUG: vesculas unilamelares grandes
VUP: vesculas unilamelares pequeas

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tud. En el primer caso, se busca expresar genes ajenos

al genoma original; en el segundo se desea reprimir la
actividad de un nico gen por una variedad de mecanismos.
En sus diferentes formas, la terapia gnica puede
usarse en el tratamiento de enfermedades adquiridas
(cncer), heredadas (fibrosis cstica) o como medida preventiva (vacunas). El desarrollo de este campo se nutre
de la biologa molecular, que permite producir cidos
nucleicos en cantidades considerables. Ha probado ser
efectiva in vitro, tanto en sistemas libres de clulas como
en cultivos celulares. Sin embargo su fin ltimo debiera
ser la aplicacin exitosa en seres vivos. Para lograr esto,
los plsmidos y oligonucletidos deben ingresar al cuerpo (por va endovenosa, intraperitoneal, intramuscular,
subcutnea, instilacin o aerosol) y atravesar una serie
de barreras anatmicas hasta llegar a sus clulas blanco, penetrar la membrana plasmtica, atravesar el citoplasma e ingresar al ncleo (excluyendo las estrategias
antisentido), donde deben expresarse y eventualmente,
replicarse correctamente.
Existen muchas maneras de hacer transfeccin in
vitro; in vivo en cambio, la presencia de barreras anatmicas que en cultivos celulares no existen, genera formidables problemas. Es claro entonces que, aparte del
diseo correcto del vector de expresin, el cuello de botella de la terapia gnica es el logro de un vector que
ayude a atravesar esas barreras y permita la liberacin
eficiente de genes en forma selectiva. Este vector debe
ser estable in vitro e in vivo, proteger al material gentico
de la degradacin frente a nucleasas, no-txico, noinmunognico y fcil de preparar en grandes cantidades.
Se han podido desarrollar diferentes formas de transponer genes al interior de las clulas. Por ejemplo, es
posible introducirlos directamente al interior celular por
inyeccin de plsmidos purificados o usar las tcnicas
de gene gun. Nosotros nos limitaremos a revisar las caractersticas de aquellas tcnicas que empleen vectores
de liberacin de genes sitio-especficamente. Veremos
que hoy por hoy, los vectores ideales no existen.
Los ingenios propuestos como vectores pueden agruparse en tres tipos: vectores fsicos (electroporacin,
microinyeccin, bombardeo con partculas), vectores
qumicos (DEAE dextrn, polibreno-dimetil sulfxido, precipitacin por fosfato de calcio, liposomas, conjugados
con polilisina) y vectores biolgicos (virus). Por razones
de eficiencia y bioseguridad, en la actualidad los vectores
ms usados son los virales (adenovirus, retrovirus y virus adeno-asociados, virus herpex simplex y lentivirus),
los liposomas, polmeros y pptidos. Los vectores virales
poseen una eficiencia de transfeccin muy elevada; asimismo sus problemas asociados son varios, entre los
que podemos mencionar inmunogenicidad (que elimina
a largo plazo la expresin transgnica), carcinogenicidad

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y limitada capacidad de carga en trmino de tamao de

cidos nucleicos. Traen aparejada adems la necesidad de contar con la tecnologa para desarrollar virus
defectivos en sus mecanismos de replicacin. Entre los
vectores no virales, los ms usados son los liposomas,
que generan complejos catinicos o como agentes
encapsulantes. En ellos enfocaremos nuestra revisin.
Si comparamos los vectores liposomales con los
virales, las ventajas de los primeros residen en su no
inmunogenicidad, su toxicidad casi nula y la carencia de
limitacin en el tamao del cido nucleico a transportar.
Su sntesis, adems de simple, puede hacerse a la medida para dirigirlo a un tipo celular dado, adems de prepararse en gran escala. Estos vectores son capaces de
liberar ADN o ARN superenrollado o lineal, con o sin
protenas asociadas, aun a clulas que no se dividen y
usualmente se preparan con lpidos biodegradables. Por
otro lado, las principales desventajas de los vectores
liposomales son su menor eficiencia de transfeccin y
su expresin transitoria; sin embargo, esta expresin de
corta duracin puede aprovecharse para tratar enfermedades agudas o crnicas que no requieran reemplazo de genes defectivos.
Actualmente existen kits comerciales para transfeccin gnica in vitro, a pesar de que in vivo an existen graves problemas de formulacin. Veremos a continuacin por qu las formulaciones comerciales fallan al
intentar transfecciones in vivo.

Encapsulacin liposomal de ADN versus

complejacin en lipoplex
Desde 1970 se intent usar liposomas para el
encapsulamiento de AN, aunque los resultados siempre
fueron desalentadores. Fue sin embargo a partir de la
introduccin de liposomas catinicos que no encapsulan
sino que forman complejos coloidales solubles con el
ADN conocidos como lipoplex, que se logr liberar
genes con una eficiencia aceptable. Ms tarde surgieron tcnicas que permitieron retornar a la encapsulacin
de cidos nucleicos con mucha mayor eficiencia que al
principio. Tanto la encapsulacin como el complejamiento
con liposomas catinicos conforman lo que llamaremos
vectores liposomales (Fig. 1). La principal diferencia entre las dos clases de vectores anteriormente citados radica en que slo si se encapsulan los AN, es posible
explotar las propiedades de los liposomas como sistema transportador de drogas, particularmente la liberacin sitio-especfica del compuesto encapsulado. Sin embargo, las formulaciones comnmente empleadas en terapia contienen lpidos cargados negativamente y por lo
tanto una limitada capacidad para ingresar al citosol. En
cambio el lipoplex, a pesar que la encapsulacin no tiene lugar, la complejacin con sus lpidos catinicos otor-

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Fig. 1. Representacin esquemtica de varios modelos de lipoplex. I Modelo

estequiomtrico. II ADN condensado recubierto por lpidos. III ADN condensado, encapsulado en liposoma de estructura elongada. IV. Agregados esfricos
con halo fibrilar (espaghetti y albndigas). V. Estructuras de fase hexagonal
inversa, con hlices de ADN formando canales acuosos en fase lquido cristalina. VI. Modelo de fase lamelar intercalada: ADN condensado bidimensionalmente en sandwich con bicapas catinicas que forman fases lamelares
intercaladas. Puede presentarse como estructuras planas o esfricas.

ga estabilidad y compactacin extra al ADN. La elevada

efectividad de la transfeccin observada con estos complejos catinicos, puede deberse a la atraccin
electrosttica sufrida hacia las membranas celulares
cargadas negativamente. En este caso los problemas a
superar estn relacionados con la limitada estabilidad
del complejo in vivo a causa de la interaccin con componentes sricos y la toxicidad celular observada. Actualmente se est trabajando en el diseo de nuevos
lpidos sintticos que permitan mejorar la eficiencia de
la transfeccin en cada caso particular. Como veremos
a lo largo de este trabajo, la eficiencia del proceso de
transfeccin depende de un fino balance en cada uno

de los pasos involucrados, desde la preparacin del

vector hasta su expresin en el ncleo. El equilibrio entre el enorme nmero de variables involucradas an no
se ha encontrado.

Optimizacin del empleo de liposomas

in vivo
El tipo de liposoma ms conveniente para cumplir la funcin de transportador de drogas suele ser el que posee
mayor tiempo de residencia en circulacin (excepto que
las clulas blanco sean los macrfagos hepticos y/o

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esplnicos). Estos liposomas, llamados estricamente

estabilizados, se obtienen a partir de la inclusin de diferentes tipos de molculas hidroflicas (estabilizadoras)
que impiden la opsonizacin de la partcula una vez en
el torrente sanguneo. El estabilizador ms exitoso y
ampliamente usado es el PEG2000. Estos transportadores de larga vida media tienen la potencialidad de acumularse en el sitio de enfermedad, en zonas donde exista
una permeabilidad vascular anormal, por ejemplo procesos tumorales o infecciones2.
Una estrategia distinta es emplear liposomas con
ligandos superficiales que les permitan dirigirse
especficamente hacia clulas blanco que contengan los
receptores apropiados. Los complejos ligando-receptor
deben ser internalizables por una ruta endoctica; de otra
manera slo se cumplira con el paso inicial de unin a
la membrana plasmtica y no habra posibilidad de ingreso del contenido encapsulado al interior celular.
No debe olvidarse que los liposomas rara vez se fusionan espontneamente con las membranas celulares.
Si la formulacin liposomal no posee ninguna de las caractersticas anteriormente mencionadas, la entrada al
interior celular se dificulta enormemente a menos que
las vesculas sean fagocitadas. Sin embargo, si bien la
fusin de la membrana plasmtica con el liposoma es
un hecho poco frecuente, es posible inducirla si se simulan ciertos mecanismos de entrada virales, fundamentalmente de virus Sendai3. Tambin se han usado componentes sensibles a la cada de pH que se registra a
continuacin de la endocitosis, de manera que el
liposoma fusione su membrana con la membrana
endosomal4. Ambas estrategias finalizan en la fusin
intermembranas. Dado que la simple incorporacin de
material fusognico puede desestabilizar las membranas, hay creciente inters en el uso de liposomas sensibles a pH con ligandos especficos unidos a su superficie conocidos como inmunoliposomas5.
En trminos generales, al formular liposomas capaces de encapsular sustancias para ser transportadas
hacia un tipo celular blanco, deben reunirse las siguientes condiciones: capacidad para circular por largo tiempo, unin especfica a receptores celulares, con fusin
subsecuente disparada por mecanismos similares a los
de los virus.

Encapsulacin de cidos nucleicos en

liposomas
El empleo de liposomas como agentes para encapsular
y liberar sitio-especficamente AN, es una extensin natural de su aplicacin como sistema de liberacin controlada de drogas.
Debido a que el ADN existe en solucin como una
molcula lineal6, su eficiencia de encapsulacin es mu-

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cho menor que para otras macromolculas. La eficiencia del proceso puede incrementarse cambiando las propiedades fsicas del ADN en solucin. Es sabido que la
disminucin del tamao del ADN facilita su internalizacin. Sin embargo, esta compactacin ha de ser reversible, ya que para la transfeccin y expresin gentica
el cido nucleico debe estar descondensado.
Es importante destacar que el ADN unido a protenas o compuestos orgnicos permanece competente
para la transfeccin. El ADN puede condensarse por
asociacin con protenas o pequeas molculas orgnicas para incrementar la eficiencia de transfeccin7. Sin
embargo, no todos los polielectrolitos catinicos son
apropiados para condensar al ADN que se quiere
encapsular; por ejemplo, los complejos con histonas,
forman agregados cuyo encapsulamiento es imposible8.
La asociacin con lisozima, una protena bsica que se
asocia con ADN a pH fisiolgico, origina un incremento
de 100 veces en la eficiencia de transfeccin. Resultados similares se obtuvieron condensando el ADN con
protenas de bacterifagos.
La desventaja del encapsulamiento de ADN en
liposomas es que prcticamente est limitado al uso de
especies lipdicas cargadas negativamente, lo que limita su aplicacin in vivo. El mayor inconveniente es su
reducida interaccin con las membranas celulares y por
lo tanto su incapacidad de ingresar al citosol. Actualmente se intenta realizar modificaciones qumicas de
estas molculas que permitan superar el problema, incrementar su vida en circulacin y asegurar su ingreso
al citosol.
La mayora de las tcnicas de encapsulacin para
aplicacin in vivo emplean liposomas sensibles al pH,
que liberan el contenido en respuesta a un pH bajo. Tpicas composiciones son DOPE y un lpido ligeramente
cido, como cido oleico o hemisuccinato de colesterol
(CHEMS). El DOPE tiene una cabeza pequea en relacin con su porcin hidrofbica, que desestabiliza las
membranas por formacin de fases hexagonales HII cada
vez que se halla en medios cidos. Se cree que la presencia de estos lpidos fusognicos causa la disrupcin
del endosoma y liberacin del ADN atrapado al citosol.

Complejacin de cidos nucleicos en

lipoplex
A diferencia de la encapsulacin de cidos nucleicos en
liposomas, la complejacin de cidos nucleicos para formar lipoplex se lleva a cabo muy velozmente, entre segundos a minutos. El lipoplex se forma por interacciones
electrostticas entre las cabezas de los lpidos y las cargas negativas de los cidos nucleicos. Cuando la suspensin liposomal se pone en contacto con el ADN, la
energa liberada en la interaccin durante la mezcla r-

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pida es muy elevada; presumiblemente, esta energa se

use en reordenamientos de las bicapas que conducen a
la formacin del complejo. Los lipoplex son heterogneos
en tamao y forma dependiendo de la relacin lpido
catinico/ADN, relacin de cargas, concentracin, estructura de lpidos y mtodo de preparacin. Debe ser
tenido en cuenta que la interaccin electrosttica primaria depende de la fuerza inica del medio. La baja fuerza
inica de las soluciones empleadas en la preparacin
del lipoplex maximizan esta interaccin, mientras que
en condiciones fisiolgicas la elevada fuerza inica contribuye a la desestabilizacin del complejo.
Se ha avanzado mucho en la qumica de sntesis de
lpidos catinicos, piedra fundamental en la obtencin
de complejos de elevada eficiencia de transfeccin. Bsicamente todas las molculas de lpidos usados tienen
una porcin hidrofbica, un grupo cabeza polar y una
zona de unin entre cadenas hidrofbicas y cabezas
polares.
Ejemplos de lpidos comnmente empleados en terapia gnica son: DOTMA, DOSPA, DOTAP, Tfx-50,
DOSPER, DOGS y DDAB; TM y TPS; DMRIE y DLRIE.
Otro grupo de lpidos empleados en la preparacin de
liposomas para terapia gnica derivan del colesterol: DCcol, lpido 67, BGSC, BGTC.

Lipopoliplex: complejos liposomaspolicationes-ADN

Existen ciertas dificultades asociadas a la administracin in vivo de los lipoplex: tienden a agregarse para
formar partculas grandes y heterogneas, lo que disminuye su eficiencia de transfeccin, y se unen inespecficamente a componentes sricos negativos. Las protenas sricas pueden disgregar al lipoplex, lo que causa la destruccin prematura del ADN; por ltimo, los
lipoplex son rpidamente destruidos por el sistema
mononuclear fagocitario (SMNF).
Si se tiene en cuenta que la causa principal de agregacin de los complejos es la pobre condensacin del
ADN con lpidos catinicos, esto puede impedirse por el
agregado de policationes, que aumenten el grado de condensacin del ADN. As, al agregar un policatin de elevada densidad de carga a una mezcla de ADN y lpidos
catinicos, se forma un vector autoensamblado ms
compacto que el lipoplex, denominado lipopoliplex9. A
este efecto, puede usarse L-polilisina o protaminas provenientes de esperma10. Las protaminas parecen ser ms
efectivas que las polilisinas y menos txicas para uso
humano; son molculas pequeas (5000 PM), con un
66% de residuos de arginina. Se cree que poseen seales de localizacin nuclear (SLN) que pueden facilitar la
entrada de los genes al ncleo desde el citoplasma, lo
que constituye una ventaja sobre la L-polilisina.

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Vectores lipdicos y oligonucletidos: una

perspectiva diferente
La captacin celular de los ON antisentido desnudos es
muy pobre. En forma de lipoplex o encapsulados en
liposomas, la captura celular se incrementa. Sin embargo, el diseo de vectores de targeting de ON est menos desarrollado que para las largas secuencias de ADN.
La generacin de lipoplex es dificultosa, dado que los
ON son segmentos cortos que no forman estructuras
ordenadas, ya que no pueden condensarse y no tienen
rigidez. Por otro lado, su encapsulacin en liposomas
an no ha podido llevarse a cabo con elevada eficiencia,
dada su extrema hidrofilicidad y su carcter cido. A pesar
de las dificultades para lograr la complejacin o
encapsulacin de ON en vectores lipdicos, estas pequeas molculas ofrecen la siguiente ventaja: unos
pocos ON antisentido son suficientes para ejercer una
actividad teraputica, ya que la cantidad de molculas
de ARNm es pequea comparada con el nmero de
copias de protenas que produce. Asimismo, la
inactivacin de la traduccin tambin se dispara a travs de la activacin de ARNasa H; este mecanismo
cataltico de amplificacin de seales reduce la cantidad
de ON necesarios para bloquear eficientemene la expresin de un gen.
La liberacin in vivo de ON encapsulados en
liposomas an no ha sido adecuadamente estudiada. A
diferencia de los liposomas, los complejos catinicos
parecen ser mejores para proveer una liberacin
intracelular de ON antisentido, al menos in vitro. Probablemente estos complejos sean captados por endocitosis
y el camino endoctico se interrumpa, permitiendo la liberacin intracitoplasmtica del material encapsulado,
que luego se transporta al interior del ncleo por un proceso independiente de energa.

Estabilidad de liposomas y lipoplex in vivo

Ciertos parmetros son tiles para caracterizar las
formulaciones liposomales o complejos lipdicos; citaremos:
a) porcentaje de carga, definida como la cantidad de carga
de droga asociada a liposomas o complejos catinicos en
comparacin con la cantidad de droga libre en solucin u
otro estado, b) eficiencia de carga o porcentaje de encapsulacin, correspondiente al monto de agente capturado
en la preparacin y c) liberacin o cantidad de agente liberado de las partculas transportadoras en diversas condiciones que induzcan prdida o liberacin controlada.
En general, para la administracin endovenosa se
requiere un alto porcentaje de carga seguido de una alta
tasa de liberacin en el sitio blanco. Los liposomas pueden cumplir con este requerimiento; si se disean apropiadamente, retienen el material gentico encapsulado

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in vivo eficientemente y puede regularse la tasa de liberacin de material gentico, a la vez que se lo protege
mecnica y fisicoqumicamente11. Los lipoplex, en cambio, son extremadamente inestables en plasma12.

El proceso de transfeccin
El proceso de transfeccin es complejo. Los pasos probables estn resumidos as: (Fig. 2).
1. Unin de complejos o liposomas a molculas en
fluidos biolgicos.
2. Transporte desde el sitio de inyeccin hasta la superficie celular blanco.
3. Unin a la superficie blanco.
4. Captura celular por endocitosis.
5. Liberacin del complejo del endosoma.
6. Descobertura del ADN
7. Captura al interior nuclear.
8. Expresin del gen.
Es sabido que las molculas pequeas entran por
difusin pasiva y/o transporte activo al interior celular.
Las molculas grandes en cambio, penetran por fusin
de membranas, pinocitosis, endocitosis, fagocitosis y/o
endocitosis mediada por receptores.
La relacin estequiomtrica lpidos catinicos/ADN,
la forma del complejo y el tipo de lpido del lipoplex o
liposoma afecta la tasa de entrada del vector liposomal
a travs de la membrana celular13. En un primer paso el
transportador lipdico se asocia con la membrana celular aparentemente a travs de la interaccin con
proteoglicanos sulfatados, luego es internalizado, principalmente por endocitosis. Las transfecciones a lneas
celulares deficientes en proteoglicanos han fallado debido a deficiencias a nivel de la unin superficial y la
internalizacin posterior4. Sin embargo, aquellos lipoplex
que tuvieron mejores uniones superficiales, no necesa-

riamente produjeron los mayores niveles de expresin

transgnica15.
Una vez que el vector lipdico es incorporado a las
clulas, el plsmido y su vector son retenidos en los
endosomas, que se mueven a lo largo de los filamentos
del citoesqueleto alejndose de la membrana celular va
filamentos de actina, usando GTP como fuente de energa. Las miosinas de clase I tambin participan en los
caminos endocticos. La interaccin de los lpidos con
las membranas endosomales juega un rol muy importante en la transfeccin. El material dentro de los
endosomas tiene tres destinos eventuales: I) fusionarse
con lisosomas, donde las enzimas lisosomales digieren
el material exgeno, II) translocarse fuera de las clulas
o III) liberarse al citosol. Es sabido que la expresin
transgnica se incrementa cuando el contenido
plasmdico endosomal se libera al citosol III. DOPE, un
lpido adyuvante, participa en la ruptura de la membrana
en condiciones cidas, por sufrir una transicin a fase
hexagonal II. Si se sustituye DOPE por DOPC, estabilizador de la estructura de bicapa, la expresin transgnica
disminuye16. Ciertos lpidos o polmeros sintticos tienen capacidad buffer, como la polietilenimida que inhibe
la actividad de enzimas lisosomales acdicas por disminucin de concentracin de protones, promoviendo la
liberacin del plsmido17. Tambin son capaces de aumentar la expresin transgnica los inhibidores de
enzimas lisosomales catepsina D y cloroquina.
La fusin con protenas virales como la hemaglutinina
puede desestabilizar membranas endosomales por cambios de conformacin a pH cido. As, se han usado
pptidos fusognicos que copian las funciones de las
protenas de fusin virales e incrementan la eficiencia
de transfeccin transgnica. Estos pptidos tienen una
estructura de -hlice hidrofbica a pH cido que cambian a conformacin al azar e hidroflica a pH neutro.

Fig. 2. Eventos intracelulares: desde la formacin de los complejos ADN-liposomas hasta la sntesis de protenas.

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Los modelos in vitro que usan liposomas cargados

negativamente para simular el entorno endosomal, sugieren que los plsmidos son liberados de los endosomas
como molculas desnudas, por atracciones electrostticas entre lpidos catinicos y lpidos aninicos, en la
hoja citoplasmtica de la membrana endosomal18. El
plsmido liberado subsecuentemente entra al ncleo y
ocurre la transfeccin. Sin embargo, la penetracin nuclear es uno de los pasos ms difciles del evento de
transfeccin intracelular. La transfeccin a clulas
sincronizadas muestra que los eventos mitticos pueden incrementar la eficiencia de transfeccin19. La expresin transgnica puede incrementarse por lo tanto,
estimulando la proliferacin celular, ya que durante la
mitosis se produce la apertura nuclear que permitira el
ingreso del plsmido. Es posible dirigir la entrada al ncleo si se usan histonas unidas a plsmidos que proporcionan secuencias consenso de SNL18.
En definitiva, no se conocen bien los mecanismos de
entrada de plsmidos al ncleo. Una hiptesis, nacida
de observaciones por microscopia electrnica, sugiere
que los lpidos de complejos ADN-liposomas pueden fusionarse con la envoltura nuclear para facilitar la entrada nuclear del plsmido. La entrada de ciertos plsmidos
es independiente del proceso de proliferacin celular;
este sera un tipo de entrada especial, dependiente de
la secuencia especfica del plsmido.
Una vez dentro del ncleo, el proceso de transcripcin est finamente regulado y requiere de la presencia
de factores transcripcionales del hospedador para iniciar la reaccin. La tasa de transcripcin depende de la
estructura gentica del vector, como la fuerza del promotor y la presencia de un enhancer. La mayora de los
vectores actualmente usados incluyen fuertes promotores virales, como el promotor del citomegalovirus. Un
problema es que ciertos promotores no virales son capaces de inducir una respuesta inmune, a travs de la
generacin de altos niveles de citoquinas, como factor
de necrosis tumoral y -interfern, las cuales sinergsticamente inhiben la expresin transgnica20. Comparado con los promotores virales, un promotor -actina
constitutivo produce 5 veces mayor expresin transgnica bajo las mismas concentraciones de citoquinas que
en el caso anterior. Como la degradacin nuclear del
plsmido liberado causara una expresin transgnica
transitoria, el diseo de un vector epismico podra resultar en expresin transgnica aumentada y duradera.
Hay un vector epismico, producto de una modificacin
del vector SV40 (107/402-T) que contiene un antgeno
grande SV40 T mutado en posiciones 107 y 402, que
ofrece replicacin del vector en modelos tumorales y
duracin prolongada de la expresin transgnica. El uso
de un vector epismico derivado del papovavirus humano tambin ha demostrado una duracin prolongada en
la expresin transgnica in vivo por hasta 3 meses21.

211

Problemas inherentes a la administracin in

vivo de lipoplex
Cuando se piensa en extrapolar resultados experimentales de sistemas in vitro a condiciones in vivo, es importante saber que no se ha hallado correlacin en la eficiencia de transfeccin entre ambas condiciones. Por
ejemplo, la relacin ptima ADN/lpidos catinicos es diferente en ambas condiciones. La estabilidad de los complejos en plasma es uno de los factores ms importantes que hacen a la diferencia entre resultados in vivo e in
vitro. In vivo se requiere un exceso de cargas positivas
del complejo para neutralizar las protenas sricas de
carga negativa22. Asimismo, el comportamiento de las
clulas en cultivo suele diferenciarse mucho del de las
clulas in vivo, por ejemplo con respecto a la capacidad
fagoctica. En cultivos celulares se requiere poco ADN
para la transfeccin y no importa si est precipitado. La
aplicacin de complejos o liposomas precipitados a un
cultivo celular no reduce la eficiencia de transfeccin;
las mismas condiciones aplicadas in vivo, generan una
eficiencia de transfeccin sumamente baja. Las razones de este fracaso residen en el gran tamao y la desigual morfologa de los complejos generados a partir de
kits comerciales. Asimismo, la transfeccin es dosis dependiente y usando kits comerciales la dosis de ADN
transferida es muy baja para ser empleada in vivo, dada
la degradacin que sufre en circulacin. Debe tenerse
en cuenta que in vivo, fundamentalmente en la administracin endovenosa, estn en juego la farmacocintica,
biodistribucin y estabilidad del lipoplex. En el otro extremo, si los lipoplex van a ser administrados localmente, pueden usarse las mismas formulaciones que para
transfectar in vitro, como es el caso de la administracin
intratumoral (que proporciona una mnima interaccin
con el entorno fisiolgico, disminuyendo los problemas
de degradacin), la instilacin intratraqueal, aerosolizacin o ruta intraperitoneal. La administracin intramuscular y subcutnea son casos intermedios entre los extremos in vitro y la administracin intravenosa. Es claro
entonces, que para cada ruta de penetracin los lipoplex
deben tener una estructura y carga neta diferentes; por
ejemplo, para la va endovenosa deben ser muy pequeos y muy compactos, lo que no es fundamental para
trabajar in vitro. Independientemente de la destruccin
que pueden sufrir por parte de las protenas plasmticas,
una vez en sangre los lipoplex circulan libremente hasta
que son capturados, fundamentalmente por las clulas
de Kupffer en el hgado. No estn capacitados para
extravasar ni siquiera a travs de las fenestraciones
endoteliales hepticas23. La biodistribucin de estos complejos, depender de la tasa relativa de fagocitosis de
los macrfagos hepticos y esplnicos, y a la posibilidad
de atrapamiento mecnico en sitios donde los capilares
tienen una luz demasiado angosta como los pulmonares.

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212

La biodistribucin en ratas, luego de la administracin

endovenosa, muestra que el pulmn es el rgano ms
transfectado (en clulas endoteliales), obedeciendo a un
comportamiento del tipo dosis-respuesta24, 25. En hgado
y bazo en cambio los lipoplex son capturados fundamentalmente por los macrfagos.
En terapia gnica se cuenta con la ventaja de poder
expresar selectivamente protenas en sitios particulares, ubicando promotores tejido-especficos en el
transgen. Si bien los lipoplex son inestables en plasma, parte de su inestabilidad consiste en la formacin
de agregados, durante los cinco primeros minutos de
circulacin; a continuacin se descomponen por
interaccin con protenas plasmticas. Frecuentemente, se registra leucopenia y trombocitopenia asociada
a su administracin. Estos agregados son importantes
a la hora de transfectar pulmones, ya que las partculas quedan atrapadas en la luz del angosto endotelio
capilar. Regulando las relaciones lpidos catinico:
adyuvante y ADN: lpido cargado, puede controlarse la
agregacin. La naturaleza del lpido adyuvante afecta
la tasa de agregacin; por ejemplo, sustituyendo DOPE
un adyuvante comn in vitro por colesterol, se obtiene expresin transgnica ms intensa y por ms tiempo in vivo; de esto se desprende que los complejos con
DOPE son ms lbiles in vivo que in vitro.

Administracin en animales modelo

La eficiencia de la transfeccin en animales modelo se
mide a travs de la expresin de una protena reportera,
la CAT. El blanco tisular ms estudiado en animales experimentales es el pulmn. Un hecho a remarcar es que
de acuerdo a la ruta de administracin, no slo las
formulaciones han de ser distintas, sino que las
eficiencias de transfeccin son en extremo variables. En
trminos generales, la administracin de lipopoliplex por
va sistmica produce transfecciones muy poco eficientes. Empleando instilacin traqueal, los rdenes de expresin son de 15-125 ng protena CAT/mg de protena
en pulmn. En contraste, los niveles de expresin obtenidos por administracin sistmica a blancos pulmonares
son mucho menores: unos 1-2 ng CAT/mg de protena
en pulmn. Cambiando el tipo de lpido, recientemente
se ha logrado incrementar muchsimo los niveles de expresin luego de la administracin sistmica de complejos de DOTAP: 0.5 g CAT/mg de protena en pulmn
de ratn. Tambin se hall expresin en otros 12 tejidos, aunque de 100 a 1.000 veces menores. Transportadores que unan un ligando adecuado (por ejemplo,
asialofetuna) incrementan la expresin en el hgado
hasta 7 veces. En resumen, para cada tipo de clula
blanco deben prepararse transportadores ad-hoc.

Administracin en humanos
Actualmente la terapia gnica con vectores lipdicos se
halla en etapa de pruebas clnicas en humanos, slo
para vectores del tipo lipopoliplex, no an para liposomas.
Es sabido, por ejemplo, que la expresin por parte de
clulas tumorales de la protena HLA-B7 (perteneciente
al sistema inmune y componente del antgeno mayor de
histocompatibilidad), induce la generacin de linfocitos
T citotxicos responsables de reconocer tales clulas
como extraas y eliminarlas selectivamente. En protocolos clnicos se inyectaron lipopoliplex con el ADNc de
HLA-B7 intratumoralmente, a unos 90 pacientes que fallaron en responder a terapias estndar de tratamiento
de cncer. El 60% de los pacientes sufra de melanoma
maligno. En un 33% de los casos, el tumor en el sitio de
la inyeccin regres completamente. En un 5%, el tratamiento con lipopoliplex fue capaz de reducir los tumores
que no haban sido inyectados.
Tambin se usaron lipopoliplex para expresar genes
de la protena del sistema inmune interleucina 2 (IL-2)
para tratar tumores renales. Es sabido que la administracin endovenosa de IL-2 desnuda, trae aparejados
serios efectos colaterales; sin embargo al complejarla
con lipopoliplex e inyectada intratumoralmente, se observ un gran incremento local de la concentracin de
IL-2, sin efectos txicos locales o sistmicos.
En fibrosis cstica, los lipopoliplex de DC-col se han
utilizado en forma de aerosol, para liberar localmente
genes de CFTR (protena reguladora de conductancia
transmembrana) defectiva en esa enfermedad, a clulas del epitelio nasal26, 27. En 6 de los 7 pacientes se detect ARNm de CFTR, sin toxicidad asociada. El defecto
en el canal de conduccin de cloruros mediados por
AMPc, tpico de la fibrosis cstica, se rectific parcialmente en algunos pacientes. Similares resultados se
obtuvieron recientemente con formulaciones de DOTAP
combinado con DC-col28, 29.
En la leucodistrofia de Canavan, una enfermedad
autosmica recesiva, luego de la inyeccin intracraneal
directa de lipopoliplex de L-polilisina, DC-col y un gen de
la aspartoacilasa (ASPA), desaparecieron los signos de
acumulacin de N-acetil aspartato, un metabolito
neurotxico, en o cerca del sitio de inyeccin. Tampoco
se observaron efectos txicos30.

Conclusiones
Los virus son efectivos en transferir genes a clulas,
porque han evolucionado mecanismos especializados
que les permiten unirse a tipos celulares especficos y
liberar eficientemente su carga al interior celular. Sin
embargo, los problemas asociados a su uso como ve-

VECTORES LIPIDICOS EN TERAPIA GENICA

hculo de liberacin asistida de genes son: a) algunos

virus pueden disrumpir el ADN de las clulas que infectan; b) los virus atenuados pueden cambiar una
vez en el interior del hospedador y volver a tener actividad patognica y c) el paciente puede generar una
respuesta inmune contra el virus. Esto ltimo podra
destruir al virus y a las clulas infectadas antes de
que el gen enviado acte, inutilizando la estrategia
teraputica. Por estas razones, se trata de buscar
vectores que no sean agentes infecciosos para descargar genes u ON exgenos en clulas enfermas.
Asimismo, debe considerarse la posibilidad de que se
requieran tratamientos repetidos, en vez de una nica
dosis de terapia que produzca una cura permanente.
Los vectores lipdicos pueden ser muy tiles en los
tratamientos repetidos, ya que no generan respuestas inmunes. Tampoco existe el peligro de dao por
reactivacin ni de disrupcin de genoma; esto pone a
los vectores lipdicos muy por encima de los virus en
trminos de bioseguridad. Por otro lado, los datos reunidos al presente indican que las eficiencias de
transfeccin in vivo de los lipoplex, comparadas con
las eficiencias de los vectores virales son bastante inferiores. En trminos generales, puede hacerse la siguiente estimacin: algunos virus son casi 100% efectivos en la liberacin de su genoma a las clulas invadidas; esto implica que 103 virus infectarn a 10 3 clulas que son sus blancos naturales, es decir, invadirn
eficiente y selectivamente 103 clulas del tipo correcto. En cambio para transfectar 103 clulas con lipoplex,
se requerirn aproximadamente 106 copias de genes
teraputicos en 106 lipoplex: esto significa que su eficiencia es 1.000 veces menor. Si bien los lipoplex se
obtienen simple y velozmente, no pueden almacenarse; deben ser preparados y administrados en el
momento. Al presente, la forma y el tamao de los
lipoplex son casi incontrolables y es sabido que la forma y tamao son factores de peso a la hora de definir
una determinada biodistribucin, cuando se administran sist-micamente. Por ello y por su absoluta inestabilidad en plasma, su uso est limitado a la administracin local. Los liposomas son vectores mucho ms
estables in vivo que los lipoplex; en esto y en el hecho
de que pueden sintetizarse con ligandos y estructuras
adecuadas que permitan dirigirlos hacia un blanco celular particular radica su enorme potencialidad. Sin embargo, la optimizacin de la encapsulacin de una droga en particular es trabajosa y difcil de escalar industrialmente. El tiempo de almacenamiento de las formulaciones es bajo, en general de unos pocos meses y
an no se conocen datos relativos a los AN; sin embargo, su almacenamiento es posible, lo que abre
buenas perspectivas en el campo farmacolgico. Actualmente existen en el mercado slo cinco formu-

213

laciones liposomales de drogas antiparasitarias y

antineoplsicas. Si bien el desarrollo de una formulacin liposomal es lento y los problemas de escalaje
industrial son grandes, dado que es posible incrementar el ndice teraputico de una droga encapsulada
hasta 10 3 veces, la estrategia de encapsulacin
liposomal de AN ofrece un campo inexplorado que mereciera investigarse todava ms.
Las soluciones salinas de oligonucletidos fosforotioatos, (los ms estudiados), inyectadas endovenosamente se distribuyen ampliamente por todos los tejidos,
con excepcin del cerebro. Esto tiene una ventaja potencial en caso que la enfermedad presente una variedad de
tejidos blanco, ya que los oligonucletidos llegan masivamente a casi todos los tejidos. En tanto el antisentido no
afecte los tejidos sanos, no sea txico y su actividad
bloqueante sea suficiente por s misma como para revertir la enfermedad, esta estrategia no presenta inconvenientes. Este es el nico caso en que los ON antisentido
funcionan con moderada eficiencia in vivo en animales
modelo y en ciertos estudios clnicos.
Uno de los principales problemas asociados a la administracin in vivo de los ON fosforotioato, es la necesidad de contar con un sistema que desve la distribucin sistmica nicamente hacia los tejidos blancos, dada
su elevada toxicidad renal, independientemente de su
secuencia. Utilizar un sistema transportador, ya sea
liposomal o lipoplex, para modular su biodistribucin y
para reducir su toxicidad, otorgara la ventaja de incrementar la exposicin a tejidos enfermos para una misma dosis, o aun dosis menores, lo que reducira el elevado costo de estos derivados.
Una alternativa a la administracin sistmica de los
oligonucletidos, ya sea encapsulados, complejados o
libres, es la inyeccin intra-cerebroventricular o va catter asociado con angioplastia; tambin la inyeccin directa en tumores y administracin en la va porta para
targeting en el hgado. La administracin local de complejos catinicos antisentido puede ser una estrategia
efectiva, ya que por este medio se puede lograr liberacin intracelular muy eficiente; con liposomas sera muy
costoso y no justificable. Sin embargo, an falta mucho
trabajo para demostrar que esto puede llegar a funcionar efectivamente en enfermedades humanas. Por ltimo, el targeting a tumores slidos, ya sean lipoplex o
liposomas, y la liberacin intracelular verdaderamente
eficiente, es todava una realidad no cumplida. Quedan
por desarrollarse sistemas transportadores de drogas
altamente estables en circulacin (los lipoplex son lbiles)
que puedan penetrar efectivamente la masa tumoral y
su extravasacin quede reducida a las inmediaciones
de la vasculatura (no es posible reducir el dimetro de
un liposoma por debajo de los 50 nm), sin acceder a las
zonas ms profundas.

MEDICINA - Volumen 61 - N 2, 2001

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Bibliografa
1. Tseng W, Huang L. Liposome-based gene therapy.
Pharmaceutical Science and Technology Today (PSTT)
1988; 1: 23-7.
2. Tari AM, Andreeff M, Kleine HD, Lopez-Berestein G.
Cellular uptake and localization of liposomal-methylphosphonate oligodeoxynocleotides. J Mol Medicine 1996,
74: 623-8.
3. Ellison KE, et al. Fusogenic liposome-mediated DNA
transfer into cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol 1996;
28: 1385-99.
4. Legendre JY, Szoka FC. Delivery of plasmid DNA into
mammalian cells using pH-sensitive liposomes:
comparison with cationic liposomes. Pharm Res 1992; 9:
1235-42.
5. Ma DD, Wei AQ. Enhanced delivery of synthetic
oligonucleotides to human leukaemic cells by liposomes
and immunoliposomes. Leuk Res 1996; 20: 925-30.
6. Saenger W. Principles of nucleic acid structure. New York:
Springer-Verlag 1984; p 556.
7. Manino R, Allebach E, Strohl W. Encapsulation of high
molecular weigth DNA in large unilamellar phosphatidylcholine vesicle. FEBS Lett 1979; 101: 229-32.
8. Jay D, Gilbert W. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:
1979-80.
9. Gao X, Huang L. Potentiation of cationic liposomesmediated gene delivery by polications. Biochemistry 1996,
35: 1027-36.
10. Sorgi FL, Bhattacharya S, Huang L. Protamine sulfate
enhances lipid mediated gene transfer. Gene Therapy
1997; 4: 961-8.
11. Huges JA, Bennet CF, Cook PD, Guinosso CJ, Mirabelli
CK, Juliano RL. Lipid membrane permeability of 2'-modified
derivatives of phosphorothioate oligonucleotides. J Pharm
Sci 1994; 83: 597-600.
12. Zelphati O, Szoka J. Intracellular distribution and
mechanism of delivery of oligonucleotides mediated by
cationic liposomes. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:
11493-8.
13. Zhou X, Huang L. DNA transfection mediated by cationic
liposomes containing lipopolylisine: characterization and
mechanism of action. Biochim Biophys Acta 1994; 1189:
195-203.
14. Matsui HJ, Svensson B. Improved activity and modulation
action pattern obtained by random mutagenesis at the
fourth beta-alpha loop involved in substrate binding to the
catalytic (beta/alpha) 8-barrel domain of barley alpha
amylase 1. Biol Chem 1997; 272: 25641-7.
15. Reimer DL, Kong S, Bally MB. Analysis of catonic
liposome-mediated interactions of plasmid DNA with
murine and human melanoma cells in vitro. J Biol Chem

1997; 272: 19480-2.

16. Farhood H, Serbina N, Huang L. The role of dioleoylphosphatidylcholine in cationic liposome mediated gene
transfer. Biochim Biophys Acta 1995; 1235: 289-95.
17. Boussif O, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 7297-301.
18. Zelphati O, Wagner E, Leserman L. Synthesis and antiHIV activity of tiocholesteryl-coupled phosphosdiester
antisense oligonucleotides incorporated into immunoliposomes. Antiviral Res 1994; 25: 13-25.
19. Fritz JD, Herwiejer H, Zhang G, Wolff JA. Gene transfer
into mammalian cells using histone-condensed plasmid
DNA. Hum Gene Ther 1996; 7: 1395-404.
20. Qin L, Ding Y, Pahud D, Robson N, Shaked A, Bromerg
J. Adenovirus-mediated gene transfer of viral interleukin10 inhibits the immume response to both alloantigen and
adenoviral antigen. Hum Gene Ther 1997; 8: 1365-74.
21. Cooper MJ, et al. Safety modified episomal vectors for
human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:
6450-5.
22. Thierry AR, Rahman A, Dritschilo A. Liposomal delivery
as a new approach to transport antisense oligonucleotides.
Izant JG (ed) New York: Raven Press, 1992.
23. Yang JP, Huang L. Overcoming the inhibitory effect of
serum on lipofection by increasing the charge ratio of
cationic liposome to DNA. Gene Ther 1997; 4: 950-60.
24. McLean JW, et al. Organ-specific endotellial cell uptake
of actionic-liposome-DAN complex in mice. J Phys 1997;
273: H387-404.
25. Thierry AE, Lunardi I, Bryant J, Rabinivich P, Gallo R,
Mahan L. Systemic gene therapy: biodistribution and longterm expression of a gene transgene expression. Proc Natl
Acad Sci USA 1995; 92: 9472-6.
26. Alton EWFW, Middleton PG, Caplen NJ, et al. Noninvasive liposome mediated gen delivery can correct the
ion transport defect in cystic fibrosis mutant mice. Nature
Genetics 1993; 5: 135-42.
27. Hyde SC, Bell DR, Higgins CF, et al. Correction of the ion
transport defect in cystic fibrosis transgenic mice by gen
therapy. Nature 1993; 362: 250-5.
28. Porteous DJ, Dorin JR, Mclachlan G, et al. Evidence for
safety and efficacy of DOTAP cationic liposome mediated
CFTR gen transfer to the nasal epithelium of patients with
cystic fibrosis. Gen Therapy 1997; 4: 210-8.
29. Gill DR, Southern KW, Mofford KA, et al. A placebocontrolled study of liposome-mediated gene transfer to the
nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. Gen Ther
1997; 4: 199-209.
30. Zhou JH, Pai BS, Reed MW, et al. Discovery of short, 3'cholesterol-modified DNA duplexes with unique antitumor
cell activity. Cancer Res 1994; 54: 5783-7.

---Tous les vices la mode passent pour vertus.

Todos los vicios de moda pasan por virtudes
Molire (1622-1673)

Don Juan, 1665