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INDICE
INTRODUCCIN .............................................................................................................. 17
Distrofia muscular de Duchenne ....................................................................................... 18
El ratn mdx: modelo de la DMD ..................................................................................... 20
Dao y reparacin muscular ............................................................................................. 21
Terapias para tratar las distofias musculares .................................................................... 24
Relacin entre factores pro-fibrosantes y pro-inflamatorios en la DMD. ........................ 26
HIPTESIS......................................................................................................................... 35
OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................... 35
OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................ 35
1. Determinar el efecto del andrograflido sobre la expresin y los efectos de TGF y
CTGF en el msculo esqueltico. ................................................................................. 35
1.1. Evaluar el efecto del andrograflido sobre la expresin de CTGF y TGF en
msculos distrficos. ................................................................................................. 35
1.2. Determinar el efecto del andrograflido sobre los niveles de MEC e inflamacin
en msculos distrficos. ............................................................................................ 35
1.3. Estudiar el efecto del andrograflido en la inflamacin y fibrosis muscular
inducida por TGF. ................................................................................................. 35
1.4. Evaluar el efecto del andrograflido en la inflamacin y fibrosis muscular
inducida por CTGF. ................................................................................................... 35
2. Determinar si la modulacin de la fibrosis por el andrograflido afecta la migracin
celular, la eficiencia de las terapias celulares y la funcin muscular. ........................... 36
2.1. Estudiar si la disminucin de la fibrosis por el andrograflido facilita la
migracin celular en el msculo esqueltico. ............................................................ 36
Material Biolgico.............................................................................................. 37
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.2
Anticuerpos ........................................................................................................ 39
1.3
1.4
1.5
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
3.
Metodologa ............................................................................................................... 48
3.1
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3
3.2.
3.2.1.
3.3.3.
3.4
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.
3.9.
3.10.
3.13.
3.14.
3.17.
3.18.
3.19.
3.20.
3.21.
3.22.
3.22.1.
3.22.2.
3.23.
Anlisis Estadstico......................................................................................... 69
RESULTADOS ................................................................................................................... 70
1.-Determinar el efecto del andrograflido sobre la expresin y los efectos de TGF y
CTGF en el msculo esqueltico. ..................................................................................... 70
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico
de animales distrficos mdx
Figura 2. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico
de animales distrficos mdx.
Figura 3. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico
de animales distrficos mdx.
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresin de TGF en msculos
distrficos.
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el numero ncleos positivos para la protena
smad 3 fosforilada en ratones mdx.
Figura 6. El ejercicio induce un aumento en la expresin de CTGF en msculos
distrficos.
Figura 7. El andrograflido no afecta la induccin de TGF en ratones mdx ejercitados.
Figura 8. El andrograflido inhibe la induccin de CTGF en msculo de ratones mdx
ejercitados.
Figura 9. El Andrografolido inhibe el aumento en el nmero de ncleos positivos para
smad-3 fosforilada en ratones mdx ejercitados.
Figura 10. El Andrografolido inhibe el aumento en el nmero de ncleos positivos para
smad-3 fosforilada en ratones mdx ejercitados.
Figura 11. El andrograflido disminuye el numero de macrfagos en el msculo distrfico
de ratones mdx
Figura 12. El andrograflido disminuye el numero de clulas inflamatorias en el msculo
distrfico de ratones mdx
Figura 13. El andrograflido inhibe la induccin de fibrosis en msculos distrficos.
Figura 14. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III en msculos
ditsrficos.
Figura 15. El andrograflido inhibe la induccin de MEC en msculo de ratones mdx.
Figura 32. Las clulas migratorias se encuentran preferentemente en areas con bajo
contenido de Colgeno tipo III.
Figura 33. El tratamiento previo con andrograflido aumenta la eficiencia de la terapia
celular.
Figura 34. El andrograflido induce un aumento en la fuerza en msculos distrficos.
Figura 35. El andrograflido induce un aumento en la fuerza en msculos distrfico.
Figura 36. El andrograflido mejora el performance de los animales distrficos frente al
ejercicio.
INDICE DE TABLAS
ABREVIATURAS
AraC
Citosina -D-arabinofuransido
BCA
Acido bicinconnico
BCIP/NBT
cDNA
DNA complementario
CTGF
dCTP
Desoxicitosntrifosfato
DEPC
Di-etilpirocarbonato
DMEM
DMSO
Dimetilsulfxido
DNA
Acido desoxirribonucleico
dTs
Desoxitimidinas
MEC
Matriz extracelular
NFB
EDTA
FAK
FITC
kb
Kilobase
kDa
Kilo Daltones
Luc
Luciferasa
MAP
mRNA
PMSF
RNA
cido ribonucleico
RT-PCR
SDS
SFB
TA
TCA
Acido tri-cloractico
TGF-
TNF-
TRITC
UV
Ultravioleta
RESUMEN
La fibrosis se caracteriza por una acumulacin excesiva de componentes de la
matriz extracelular (MEC) y es el resultado De una cascada de eventos posteriores a una
lesin y que resulta en la formacin de cicatrices permanentes. En el msculo esqueltico la
fibrosis est mayormente asociada a las distrofias musculares. La ms severa de estas, es la
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), patologa gentica recesiva ligada al cromosoma
X, caracterizada por la ausencia de la protena distrofina. El modelo murino de la DMD es
el ratn mdx. En la actualidad no existe un tratamiento efectivo para la DMD. Se han
estudiado diversas estrategias para intentar re-expresar la protena distrofina en el musculo
de los pacientes y del ratn mdx, mediante la utilizacin de vectores virales como tambin
mediante terapias celulares utilizando diferentes tipos celulares con potencial miognico,
sin embargo, todas ellas han mostrado una baja efectividad debido a la escasa o nula
incorporacin de los vectores en el tejido muscular. El grupo de Giulio Cossu, demostr
que clulas con potencial miognico pero que sobre-expresan la enzima MMP-9 han
mostrado una efectividad significativamente mayor. Este resultado puso de manifiesto que
la fibrosis presente en los msculos distrficos dificulta la incorporacin celular en el
tejido. Dentro de los factores involucrados en la induccin de fibrosis en los msculos
distrficos encontramos el factor de crecimiento transformante tipo (TGF-) y el factor
de transcripcin NFB. Un elemento comn es el factor de crecimiento de tejido conectivo
(CTGF), el cual es inducido por TGF y adems presenta en su promotor sitios de unin
para NFB. Se ha demostrado que CTGF es capaz de mediar la accin pro-fibrosante de
TGF. Sin embargo, los mecanismos por los cuales NFB y TGF colaboran en la
ABSTRACT
andrographolide, which has been used to treat multiple sclerosis and rheumatoid arthritis,
without side effects.
In this Thesis we propose the following hypothesis: The andrographolide
inhibits the fibrosis, which affects the muscle physiology in a mechanism that involves
CTGF and TGF-. The goal of this thesis work was: To determine the effect of
andrographolide over TGF- and CTGF in the skeletal muscle. And also evaluate if
the modulation of fibrosis by andrographolide affects cellular migration, efficiency of
cell based therapies and muscle function.
By using the exercise-induced model of fibrosis in mdx mice, we studied the
regulation CTGF and TGF expression, observing that andrographolide is able to inhibit
CTGF expression, without affecting the TGF expression. On this context, we
demonstrated that TGF, as well as CTGF, have pro-inflammatory activity in the skeletal
muscle and TGF can activate NFB in muscle cells. In in vivo assays, we show that
fibrosis significantly decreases the cell migration, effect that can be reverted by
andrographolide treatment. Moreover, we demonstrated that prophylactic treatment of
dystrophic muscles with andrographolide, increases in 300% the number of muscular fibers
able to re-express dystrophin in response to cell based therapies. Besides, the inhibition of
fibrosis by andrographolide per se, has benefic effects in the muscle physiology increasing
contractile force and performance of mdx mice in exercise protocols.
INTRODUCCIN
Existen varios modelos animales para la DMD como el perro, GRMD (golden
retriever muscular dystrophy), el gato, HFMD (hypertrophic feline muscular dystrophy), y
el ratn, mdx (x-linked muscular dystrophy). Los tres modelos no expresan distrofina, pero
es el perro el modelo que ms asemeja la patologa en el humano (Blake y cols., 2002).
El ratn mdx fue descubierto por un grupo de investigadores que buscaban mutantes
de actividad enzimtica glicoltica en ratones, quienes observaron que una de sus cepas
presentaba en el plasma, niveles elevados de piruvato quinasa y creatina quinasa (Bulfield y
cols., 1984). Los autores describieron el hallazgo de un modelo animal que presenta
cambios distrficos en los msculos que son dependientes de la edad del ratn y ligados al
cromosoma X tal como lo son la DMD y DMB (distrofia muscular de Becker). Dada la
facilidad para trabajar con el ratn, ste se ha convertido en el modelo in vivo ms utilizado
para estudiar la patologa. La progresin de la enfermedad en este modelo sigue un curso
temporal bien delimitado, existe un perodo de necrosis alcanzando un mximo entre las 34 semanas y una respuesta regenerativa importante que se evidencia por la presencia de
ncleos centrales en las fibras (Blake y cols., 2002). Si bien el ratn mdx tampoco expresa
distrofina, el grado de distrofia en los msculos de las extremidades es mucho menor en
comparacin con el nio. Sin embargo el diafragma del ratn mdx ha sido descrito como el
msculo que presenta mayor degeneracin y ms se asemeja al msculo distrfico de la
DMD (Stedman y cols., 1991). Este tambin sufre reemplazo del parnquima muscular por
tejido fibrtico y se ha observado un aumento en la cantidad del factores pro-fibrosantes
(Andreetta y cols., 2006). Dentro de este contexto, se ha demostrado que el ejercicio es
capaz de inducir dao muscular en este modelo, evaluado a travs de la actividad creatina
quinasa presente en el plasma de estos ratones (De luca A. y cols., 2005). Estos
antecedentes, sugieren que el excesivo dao observado en el msculo diafragma se debe
principalmente a la actividad fsica a la cual est sometido.
El msculo esqueltico tiene una gran capacidad regenerativa y sta depende de una
poblacin de clulas que se encuentran bajo la lmina basal de las fibras musculares y que
estn normalmente mitticamente inactivas, las clulas satlite. En respuesta a estmulos
como estrs inducido por traumas, las clulas satlite se activan, expresan marcadores de
clulas musculares y comienzan a proliferar, luego se diferencian y forman nuevas fibras o
se fusionan con fibras pre-existentes (Chen and Goldhamer, 2003; Hawke and Garry, 2001;
Seale and Rudnicki, 2000).
En la reparacin normal del msculo despus de una lesin aguda, como en
animales de experimentacin o en humanos luego de lesiones deportivas o accidentes, las
fibras daadas o muertas son removidas por clulas inflamatorias como los macrfagos,
para luego ser reparadas o reemplazadas por clulas satlites residentes del tejido muscular
(Mauro, 1961). Sin embargo, en enfermedades humanas crnicas como la DMD, las fibras
musculares recin generadas son tambin susceptibles a la degeneracin, ya que conservan
el defecto molecular, lo que conlleva a constantes ciclos de degeneracin de las fibras
musculares estableciendo un proceso inflamatorio crnico (Porter y cols., 2002a). En la
DMD, la poblacin celular de clulas satlite va disminuyendo a medida que progresa la
enfermedad, resultando en un reemplazo progresivo del tejido muscular por tejido adiposo
y fibrtico. Sin embargo, los eventos celulares y moleculares que ligan al fenmeno de
inflamacin con el desarrollo de fibrosis aun son desconocidos. Por consiguiente, es
importante determinar los factores involucrados con el fin de obtener nuevos blancos
teraputicos que logren separar ambos procesos.
Los macrfagos son el principal tipo de clula inflamatoria encontrada luego de una
lesin muscular. En el msculo distrfico, actan por un lado removiendo los restos
celulares como tambin modulando el proceso de regeneracin. La evidencia actual apunta
a que la naturaleza, duracin e intensidad de la respuesta inflamatoria en el msculo daado
impacta crticamente en el desarrollo ptimo del proceso de reparacin del msculo o,
alternativamente, en la formacin de tejido fibroso, particularmente durante la progresin
de las distrofias musculares. Cuando se interfiere con la respuesta inflamatoria transitoria,
originada luego de una lesin aguda, puede afectar negativamente la remocin de los restos
celulares y por ende la formacin de nuevas fibras musculares, mientras que por otro lado
el interferir con la inflamacin crnica en las distrofias musculares parece ser beneficiosa
en la atenuacin de la degeneracin y la progresin de la fibrosis, al tiempo que mejora la
regeneracin (Tidball, 2005). Estudios que utilizan una variedad de agentes antiinflamatorios en ratones mdx, que actan sobre citoquinas, como TNF- y sus receptores
celulares, y sobre las principales vas pro-inflamatorias, tales como NFB, han dado como
resultado una mejora de la progresin de la distrofia (Pelosi y cols., 2007; Peterson and
Guttridge, 2008; Radley y cols., 2008). Estudios realizados por Arnold y cols. han
demostrado que los macrfagos presentes luego de una lesin muscular constituyen una
poblacin heterognea, cuyas funciones seran opuestas (Arnold y cols., 2007). Una
poblacin de macrfagos (M1, ED-1 (CD68) positivos) producen altos niveles de
citoquinas pro-inflamatorias como TNF e IL-1 y se encuentran en las primeras etapas
despus de una lesin muscular en asociacin con el reclutamiento de monocitos y la
eliminacin de material necrtico. Por otra parte, una subpoblacion de macrfagos antiinflamatorios (M2C, ED-2 (CD163) positivos) son abundantes en las etapas avanzadas del
proceso de regeneracin en asociacin con la recuperacin y reparacin de tejidos en los
que secretan IL-10 y tienen una funcin de desactivacin de la primera oleada de
macrfagos M1 (Arnold y cols., 2007). In vitro, los macrfagos pro-inflamatorios
aumentan la proliferacin e inhiben su diferenciacin, mientras que los macrfagos antiinflamatorios estimulan la diferenciacin y la fusin de stos. Es importante destacar que el
agotamiento de cualquiera de estos tipos de macrfagos tiene efectos negativos en el
proceso de reparacin despus de una lesin muscular (Arnold y cols., 2007).
eficiencia puede ser aumentada al utilizar clulas con potencial miognico que
sobrexpresen la metaloproteinasa MMP-9. Esta enzima tiene como sustratos mltiples
protenas de MEC como colgeno tipo I, III y fibronectina (Hrabec y cols., 2007), lo cual
sugiere que estas clulas al tener la capacidad de degradar la MEC adquieren mayor
capacidad migratoria y por ende se distribuyen de mejor manera en el msculo distrfico.
Por lo tanto, es interesante evaluar si una disminucin en la fibrosis aumenta la migracin
celular y de esta forma la eficiencia de las terapias celulares.
que presentan menor dao y fibrosis muscular, lo cual sugiere fuertemente la participacin
de NFB en la patologa fibrtica muscular. A nivel molecular la actividad de NFB es
regulada principalmente por la protena IB. NFB es secuestrada por IB en el
citoplasma impidiendo su translocacin al ncleo y la consiguiente activacin
transcripcional (Ahn y cols., 2007). La accin de IB depende de un citoesqueleto de
actina estable. A nivel muscular la ausencia de distrofina produce la inestabilidad del
citoesqueleto de actina (Rybakova y cols., 2000) lo que producira una ineficiente
inhibicin de NFB. Agentes que estabilizan IB y por ende impiden la activacin de
NFB han mostrado tener efectos protectores frente al dao muscular (Carlson y cols.,
2005). Existen diversos inhibidores especficos para NFB, dentro de ellos se encuentra el
andrograflido. El andrograflido es un terpeno de origen natural, encontrado
abundantemente como el principal compuesto activo en extractos de la planta
angiosprmica Andrographis paniculata (PARACTIN). El andrograflido es un potente
inhibidor de la actividad de NFB modifica en forma covalente un residuo de cistena de la
subunidad p50 (Xia y cols., 2004), lo cual impide la unin al DNA de este factor de
transcripcin. El andrograflido no afecta las rutas de activacin NFB (fosforilacin y
degradacin proteasomal de IB), como tampoco afecta la translocacin nuclear, de esta
forma inhibe la expresin de varias protenas pro-inflamatorias que son inducidas por
NFB (Burgos y cols., 2005; Hidalgo y cols., 2005; Iruretagoyena y cols., 2005). El
andrograflido ha sido utilizado como frmaco para el tratamiento del resfro comn
(Gabrielian y cols. 2002), artritis reumatoide (Burgos y cols., 2009) y esclerosis mltiple,
(Iruretagoyena y cols., 2005), sin presentar efectos secundarios adversos, lo cual desde el
punto de vista farmacolgico lo hace muy atractivo. Por lo tanto sera interesante estudiar el
uso del andrograflido para entender como factores relacionados con inflamacin y fibrosis
se relacionan entre si en el msculo esqueltico
La mayora de los factores pro-fibrognicos son producidos por la clulas
inflamatorias infiltradas en el tejido, por clulas mesenquimales, fibroblastos y como
tambin por clulas especificas del tejido, lo que facilita los efectos profibrognicos
paracrinos que perpetan la fibrosis impulsada por la inflamacin (Wynn, 2008). Una de las
ms potentes citoquinas pro-fibrognicas es el factor de crecimiento transformante tipo beta
o TGF. A la fecha se han descrito tres isoformas de TGF (TGF1, TGF2 y
TGF3), todas las cuales son sintetizadas como protenas precursoras (Zhou y cols.,
2006). Cuando TGF se activa se libera y se une a un receptor heterodimrico. La ruta de
sealizacin clsica activada por TGF consiste en la unin de TGF a su receptor lo
activando el dominio quinasa de ste, lo cual resulta en la fosforilacin de las protenas
smad-2 y smad-3, las cuales unen smad 4 para formar un complejo que transloca dentro del
ncleo, activando la transcripcin (Bonniaud y cols., 2005). Sin embargo, tambin se ha
demostrado que TGF puede sealizar a travs de varias vas adicionales, dentro de las
cuales podemos encontrar la protena quinasa p38 activada por mitgenos (MAPK), ERK,
c-abl, JNK, etc.(Shi and Massague, 2003). Estas vas de sealizacin aparentemente
modifican la expresin de genes de una manera selectiva. Por ejemplo, FAK, JNK y TAK1
se requieren para la diferenciacin de fibroblastos a un fenotipo fibrtico denominado
miofibroblastos, cuya caracterstica principal es su alta capacidad de sintetizar MEC y tener
actividad contrctil debido a la expresin de SMA (alfa actina de msculo liso)
(Vaughan y cols., 2000; Hinz y cols., 2007). Por otro lado, ERK es necesaria para la
expresin de colgeno tipo I. Sin embargo, p38 MAPK no parece estar involucrado en la
actividad fibrognica de TGF. Por lo tanto, es probable que otras vas de sealizacin
sean anormalmente activadas en fibroblastos o clulas musculares de una manera
independiente de la ruta cannica de TGF.
TGF se expresa en el msculo normal despus de la lesin y en el msculo
distrfico de los pacientes con DMD y ratones mdx. Igualmente importante es la capacidad
de TGF de disminuir la produccin de enzimas que degradan la MEC, tales como la
enzima colagenasa, al tiempo que aumenta la produccin de protenas que inhiben las
enzimas que degradan MEC como las TIMPs y PAI-1. La inyeccin, in vivo, directa de
TGF recombinante en el msculo estimula la expresin de TGF en clulas musculares
en una forma autocrina e induce la formacin del tejido conectivo en el rea de la inyeccin
(Brandan y cols., 2008; Zhu y cols., 2007). En conjunto, estos estudios ponen de relieve el
papel crucial de TGF en la iniciacin de los procesos de fibrosis, y en la induccin de
diferenciacin de las clulas musculares en miofibroblastos en el msculo lesionado. El
antagonismo de la sealizacin de TGF por una serie de estrategias han demostrado que
inhibe la fibrosis y mejora la regeneracin muscular en varios modelos experimentales. Sin
embargo, no se ha demostrado ningn agente con la capacidad de reducir la fibrosis, una
vez formada. Por ejemplo, la inmunomodulacin directa de TGF inhibi la acumulacin
de tejido conectivo (Isaka y cols., 2000; Denton y cols., 2007) y la progresin de la fibrosis
en el diafragma de ratones mdx, aunque la inflamacin aument considerablemente
(Andreetta y cols., 2006). Estos resultados sugieren una fuerte relacin entre el fenmeno
de fibrosis y el de inflamacin.
Dentro de los genes regulados por TGF-, se encuentra una protena de sumo inters
en las patologas fibrticas: el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) (Igarishi y
cols., 1993). Una de las principales caractersticas de CTGF, es su efecto sobre la
produccin de MEC, donde regula positivamente la expresin de colgeno tipo I, integrina
5 y fibronectina (Frazier y cols., 1996).
Basado en estudios de expresin de CTGF durante el desarrollo se ha sugerido que
este factor cumple una funcin en la formacin de cartlago, hueso, dientes y maduracin
de clulas nerviosas (Leask y Abraham, 2003). Consistente con esto los ratones deficientes
en CTGF mueren al nacer debido a una alteracin de los embriones en la produccin de
matriz especfica de hueso, incapacidad de condrocitos para proliferar y una alterada
osificacin de las costillas (Ivkovic y cols., 2003).
CTGF es una protena modular rica en cistena perteneciente a la familia
Cyr61/CTGF/NOV (CCN) de factores de crecimiento (Perbal, 2004) cuyos miembros
tienen una gran variedad de funciones biolgicas altamente dependientes de su contexto
celular, dentro de las que se incluyen la proliferacin, migracin y diferenciacin celular
(Perbal, 2004; Leask y Abraham, 2003; Leask y Abraham, 2006). CTGF est involucrado
en una serie de procesos celulares que incluyen la diferenciacin, proliferacin (Yosimishi
y cols., 2001; Grotendorst y cols., 2004), adhesin (Ball y cols., 2003), migracin (Gao y
Brigstock, 2006), apoptosis (Hishikawa y cols., 1999), produccin de MEC (Frazier y cols.,
1996), condrognesis (Ivkovic y cols., 2003) y angiognesis (Babic y cols., 1999). Hasta la
fecha no se ha identificado un receptor especfico de alta afinidad para CTGF, pero se sabe
que algunas de sus funciones tales como adhesin y migracin las realiza a travs de
integrinas y proteoglicanes de heparn sulfato (Babic y cols., 1999; Ball y cols., 2003; Gao
y Brigstock, 2004; Droppelmann y cols., 2009). CTGF adems interacta con el receptor
relacionado al receptor de lipoprotenas de baja densidad (LRP-1) a travs del cual sera
internalizado y degradado va endosomas (Segarini y cols., 2001).
Los niveles de CTGF se correlacionan con el grado y severidad de fibrosis en
muchos tejidos incluyendo desrdenes fibrticos de la piel como esclerosis sistmica y
queloides (Igarishi y cols., 1993), lesiones ateroesclerticas (Oemar y cols., 1997), fibrosis
pulmonar (Lasky y cols., 1998), fibrosis renal (Ito y cols., 1998), pancreatitis crnica (di
Mola y cols., 1999), fibrosis heptica (Paradis y cols., 1999) y distrofias musculares (Sun y
cols., 2008).
Los efectos de TGF sobre la fibrosis pueden ser, al menos parcialmente, imitados
y amplificados por CTGF. Se han reportado aumentos en los niveles de CTGF en el
msculo esqueltico de pacientes con DMD, perros distrficos y ratones mdx. La inyeccin
subcutnea de TGF indujo la produccin de CTGF, mientras que la inyeccin de CTGF
puede causar una reaccin fibrtica equivalente a la de TGF. Esta respuesta fibrtica es
especfica para TGF y CTGF, y no es imitada por EGF, PDGF o FGF2 (Frazier y cols.,
1996). Estos resultados sugieren un papel de ambos (TGF y CTGF) en la induccin de
fibrosis, inhibicin de la miognesis y promocin de desdiferenciacin de mioblastos en
miofibroblastos (Vial y cols., 2008). Debido a que muchas actividades de CTGF son
paralelas a aquellas inducidas por TGF-, se ha sugerido que algunas de las respuestas de
TGF- son mediadas a travs de CTGF (Gore-Hyer y cols., 2002; Grotendorst y cols.,
2004). Se ha observado que durante el proceso de reparacin frente a un dao TGF- es
inducido antes que CTGF sugiriendo que este factor es un mediador ro abajo de TGF-
(Igarishi y cols., 1993).
que ratones mdx heterocigotos para CTGF presentan menor grado de fibrosis muscular
(Tesis Gabriela Morales, en curso) y que, adems, la sobrexpresin de CTGF en el msculo
esqueltico de un ratn control induce similares caractersticas a las observadas en un
msculo distrfico (Morales y cols., 2011). En resumen, estos antecedentes indicaran que
al igual que en otros tejidos fibrticos CTGF se correlaciona con el desarrollo y la
severidad de la fibrosis muscular esqueltica, por lo que sera relevante buscar formas de
inhibir su expresin o actividad para prevenir su efecto fibrtico.
Aunque en el adulto CTGF no se expresa bajo condiciones normales en la mayora
de los tejidos, la expresin de esta protena puede ser inducida por TGF-, factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF),
angiotensina II, glucocorticoides, endotelina 1 e hipoxia, el cido lisofosfatdico (LPA),
entre otros estmulos (Leask y Abraham, 2006; Leask y cols., 2009;(Muehlich y cols.,
2004; Ruperez y cols., 2003; Vial y cols., 2008)).
Un factor comn a todos estos inductores es NFB. El promotor de CTGF presenta
sitios de reconocimiento de diferentes factores de transcripcin y dentro de este punto se ha
demostrado que el promotor de CTGF presenta sitios para NFB, los cuales son
importantes para la expresin de CTGF, ya que al ser mutados, inhiben la expresin de un
reportero para CTGF en respuesta a estmulos como el estrs mecnico (Chaqour y cols.,
2006). Adems la sola inhibicin de NFB disminuye la expresin de CTGF y colgeno
tipo I. Estos antecedentes sugieren una fuerte relacin entre la citoquina profibrosante
CTGF y el factor de transcripcin relacionado con inflamacin NFB.
Estudios recientes han sugerido la participacin de CTGF en la respuesta
inflamatoria en donde acta como factor quimiotctico para monocitos y aumenta la
produccin de factores pro-inflamatorios (Cicha, 2005). Esto indicara que CTGF adems
de su propiedad pro-fibrtica estara involucrado en la respuesta inflamatoria, la cual es una
caracterstica de la DMD. De este modo es importante determinar si CTGF y/o TGF
tienen actividad proinflamatoria en el msculo esqueltico.
Esta tesis plantea estudiar los eventos celulares y moleculares involucrados en la
fibrosis muscular esqueltica asociada a las distrofias musculares. Determinando el papel
de las citoquinas TGF y CTGF y su relacin con los procesos de inflamacin y fibrosis,
como tambien la participacin del factor de transcripcin NFB a travs del inhibidor de
origen botnico andrograflido.
HIPOTSIS
El andrograflido inhibe la fibrosis, la cual afecta la fisiologa muscular en un
mecanismo que involucra a CTGF y TGF
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto del andrograflido en la fibrosis, inflamacin y funcin de msculos
distrficos.
OBJETIVOS ESPECFICOS
MATERIALES Y METODOLOGA
1.
Materiales
1.1
Material Biolgico
b)
Biosystem (Thermo Fisher Scientific, Walthman MA, USA), el cual contiene el cDNA de
CTGF ratn, con su secuencia 5 y 3 UTR.
c)
pGL2-Basic, fue obtenido de Promega, WI, EE.UU., gen reportador para la enzima
p3Tp-Luc, Reportero inducible por TGF el que contiene la regin promotora del
inhibidor del inductor del plasmingeno (PAI-1) sub-clonado en un vector modificado que
contiene el cDNA para la luciferasa de lucirnaga. Fue donado por el Dr. Fernando Lopez
Casillas, Universidad Nacional de Mexico (Wrana y cols., 1992).
a)
cols., 1985) utilizando la lnea celular establecida por Yeffe y Saxel a partir del msculo
esqueltico de la extremidad posterior de un ratn C3H normal (Yaffe y Saxel, 1977).
b)
1.2
Anticuerpos
Los anticuerpos que fueron utilizados en el desarrollo experimental de esta Tesis
Tabla 1. Lista de anticuerpos y las aplicaciones en que fueron utilizadas. WB: Western
blot, IFI: Inmunofluorescencia indirecta, IHC: Inmunohistoqumica
Nombre
Anti-CTGF
Anti-GFP
Antgeno (Especie)
CTGF (humano)
GFP (aequoerea)
Origen
Cabra
Conejo
Tcnica y
Fuente de
Dilucin
obtencin
WB:1/500
Santa Cruz
IHC:1/100
(CA, USA)
WB:1/1000
Santa Cruz
(CA, USA)
Anti-Fibronectina
Anti-Colgeno I
Fibronectina (humano)
Conejo
Conejo
WB:1/5000
Sigma
IFI:1/100
(MO, USA)
WB:1/1000
IFI:1/100
Anti-Colgeno III
Anti-fosfo Smad3
Smad-3
Conejo
Conejo
WB:1/500
Rockland
IFI:1/50
(PA, USA)
WB:1/1000
Cell
IFI:1/50
Signaling
(humano)
Anti-Smad3
Smad-3
(MA, USA)
Conejo
Cell
(humano)
Signaling
(MA, USA)
Anti-GAPDH
Gliceraldehdo
Ratn
WB:1/5000
Chemicon-
deshidrogenasa (ratn)
Millipore
(MA, USA)
Anti-Tubulina
-Tubulina
Ratn
WB:1/5000
(erizo de mar)
Anti-Miosina
Miosina neonatal
neonatal
(humano)
Anti CD 68
Anti CD 68 (ratn)
Anti CD 206
Anti F4/80
1.3
Sigma
(MO, USA)
Ratn
Conejo
Conejo
Cabra
WB:
Santa Cruz
IFI:1/50
(CA, USA)
WB:1/500
Serotec
IFI:1/100
(OX, UK)
WB:1/500
Serotec
IFI:1/100
(OX, UK)
WB:1/500
Abcam
IFI:1/100
(CA, USA)
Los partidores que fueron utilizados en el desarrollo experimental de esta Tesis son
detallados en la Tabla 2, en la cual se indican sus secuencias.
Gen
Forward primer
Reverse Primer
IFN-g
5-GACAATCAGGCCATCAGCAAC-3
5-CGGATGAGCTCATTGAATGCTT-3
CD68
5-CAAAGCTTCTGCTGTGGAAAT-3
5-GACTGGTCACGGTTGCAAG-3
CD206
5-GGATTGTGGAGCAGATGGAAG-3
5-CTTGAATGGAAATGCACAGAC-3
IL-6
5-GAACAACGATGATGCACTTGC-3
5-CTTCATGTACTCCAGGTAGCTATGGT-3
IL-4
5-GGATGTGCCAAACGTCCTC-3
5-GAGTTCTTCTTCAAGCATGGAG-3
CD163
5-GCAAAAACTGGCAGTGGG -3
5-GTCAAAATCACAGACGGAGC-3
MCP-1
5-GCTCAGCCAGATGCAGTTAAC-3
5-CTCTCTCTTGAGCTTGGTGAC-3
B-actin
5-CAACCGTGAAAAGATGACCC -3
5-GTAGATGGGCACAGTGTGGG-3
RNSP1
5- AGGCTCACCAGGAATGTGAC-3
5- CTTGGCCATCAATTTGTCCT-3
SRP14
5- GAGACGAGCAGTTCCTGAC-3
5- CGGTGCTGATCTTCCTTTTC-3
1.4
1.5
Reactivos
2.1
Reactivos Generales
De Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA): se obtuvieron los siguientes
MgCl2,
MgSO4,
Na2HPO4,
KH2PO4,
CH3COONa,
CaCl2x2H2O,
cido
2.2
2.3
desoxitiminatrifosfato
(dTTP),
desoxiguaninatrifosfato
(dGTP),
2.4
2.5
Enzimas Comerciales
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvieron las enzima
2.6
Sistemas Comerciales
De Qiagen (Valencia, CA, USA) se obtuvieron los sistemas de purificacin de
DNA plasmidial HiSpeed Plasmid Midi Kit y QIAquick Gel Extraction Kit.
De Axygen (Union City, CA, USA) se obtuvo el sistema de purificacin de DNA
plasmidial AxyPrep Plasmid Miniprep Kit.
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvo el sistema de
transcripcin reversa de DNA SuperScript II RT First-Strand Synthesis System.
De Applied Biosystem (Grand Island, NY, USA) se obtuvo el sistema comercial
de extraccin de RNA Arcturus Pico-Pure RNA kit.
De Thermo Fisher Scientific (Walthman, MA, USA) se obtuvieron los sistemas de
deteccin de quimioluminiscencia utilizados para los ensayos de Western blot; West Pico,
West Dura y West Femto.
De BioRad se obtuvo el IQ SYBR Green supermix utilizado para los ensayos de
RT-PCR en tiempo real.
2.7
cultivo Dulbeccos Modified Eagle (DMEM), Opti-MEM, suero fetal bovino, tripsinaEDTA y mezcla de antibiticos-antimictico.
La lipofectamina utilizada para transfeccin transiente de clulas en cultivo se
obtuvo de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA).
3.
Metodologa
3.1
Cultivo Celular
desde 2 das despus de gatillada la diferenciacin contena AraC 0,1 mM (Larrain y cols.,
1997a).
3.2.
Ensayos enzimticos
3.2.2.. -galactosidasa
Se utiliz el kit Luminiscent -galactosidase Detection kit, el que permite la
deteccin luminiscente de la actividad de -galactosidasa. La determinacin, fue realizada
en los mismos extractos obtenidos para la deteccin de actividad de luciferasa. 50 l de
extractos, fueron incubados con 0,1 ml del reactivo de ensayo de -galactosidasa, e
incubados por 1 hora a temperatura ambiente. La cuantificacin se hizo en un luminmetro
TD-20/20, Turner Designs, con un tiempo de lectura de 10 segundos.
3.3.
Ensayo de Northern
3.4
Luego,
las
clulas
se
lisaron
tres
veces
mediante
un
proceso
de
3.5.
3.6.
producto de 100 pb. El DNA genmico se obtuvo como se detall en Metodologa 2.12.1.
La reaccin de PCR se llev a cabo como se detalla en la seccin Metodologa 2.12.2. El
producto de PCR obtenido se visualiz en un gel de agarosa al 2%.
3.7.
3.8.
3.9.
0 1 2 3
*
*
mdx
C57BL/10
Figura 1. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico de animales
distrficos mdx. Ratones mdx y controles, de 3 meses de edad, fueron sometidos a protocolos de ejercitacin,
3 veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante la tincin de Hematoxilina/Eosina. Los
asteriscos sealan fibras necrticas y las flechas ffocos de fibras musculares regenerantes.
Ejercicio
(meses)
0 1 2 3
mdx
C57BL/10
Figura 2. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico de animales
distrficos mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3
veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante inmunofluorescencia para la protena de
MEC, colgeno tipo III (verde), en azul se muestran la tincin nuclear (Hoechst).
Ejercicio
(meses)
C57BL/10
mdx
Ejercicio
(meses)
0
1
2
3
0
1
2
3
FN
GAPDH
C57BL/10
mdx
Veces
de
induccin
de
(FibrionecFna/GAPDH)
2,5
1,5
1
0,5
0
1
4
5
6
Meses
de
ejercicio
Los ratones fueron anestesiados con isofluorano, se registr el peso de cada animal
y se procedi a realizar una incisin abdominal para dejar expuesta la vena cava inferior, de
donde se procedi a extraer sangre con una jeringa de 1 ml heparinizada. El plasma se
separ del resto de los componentes sanguneos por centrifugacin a 1500 g por 20 min. a
temperatura ambiente. Posteriormente los ratones fueron sacrificados a travs de
dislocacin cervical y se procedi a remover los msculos de las extremidades,
gastrocnemius y tibialis anterior. Los msculos utilizados para los ensayos de
electrofisiologa fueron mantenidos en buffer Krebs-Ringer (118 mM NaCl, 25 mM
NaHCO3, 11 mM D-glucosa, 4,7 mM KCl, 3,2 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM
MgSO4) oxigenado a temperatura ambiente hasta su anlisis.
Los msculos utilizados para obtencin de homogenizado total de msculo para
ensayos de western blot, fueron rpidamente congelados en N2 lquido y almacenados a 80C hasta su procesamiento. Los msculos utilizados para anlisis histolgico e
inmunofluorescencia fueron rpidamente congelados en isopentano enfriado en N2 lquido
y almacenados a -80C hasta su procesamiento.
p/v SDS a 100 V por 1,5-2 hrs. y luego transferidas a una membrana de PVDF (Thermo
Fisher Scientific, Walthman MA, USA) en amortiguador 25 mM Tris-HCl pH 8,3, 192 mM
glicina, 20% v/v metanol a 350 mA por 2,5 hrs. Despus de la transferencia, la membrana
fue bloqueada con metanol, secada a 37C y almacenada a temperatura ambiente hasta su
posterior uso. Las membranas fueron incubadas con los distintos anticuerpos en TBS (150
mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5)-Tween 20 0.1% - leche 5% por una hora a temperatura
ambiente. Luego, se procedi a lavar la membrana 3 veces con TBS-Tween 20 0,1% - leche
5% por 5 min. y se adicion el anticuerpo secundario contra la IgG respectiva del primario
en TBS-Tween 20 0.1%-leche 5% por una hora a temperatura ambiente.
La unin del complejo anticuerpo primario/anticuerpo secundario a las muestras
proteicas fue visualizada usando el procedimiento de quimioluminiscencia (Thermo Fisher
Scientific, Walthman MA, USA) y detectadas a travs de un sistema de documentacin de
imgenes Chemidoc. (UVP, Upland CA, USA)
Las seales proteicas detectadas en los Western blots se cuantificaron mediante el
programa Image J (NIH, USA) y los niveles de expresin se normalizaron con respecto a
los niveles del control de carga respectivo en cada muestra.
deshidratadas bajo batera de alcoholes desde 70% a 100%. Finalmente las muestras fueron
incubadas en xilol y montadas en Entellan.
RESULTADOS
de
clulas
positivas
para
la
protena
smad-3
fosforilada,
aumenta
mdx
Ejercicio
+
mdx
mdx
+mdx
Ejercicio
(meses)
0
+
0
0
1
-
1
1
+2
2
32
3
3
PARACTIN
-
Ejercicio
meses)
Ejercicio
((meses)
TGF- CTGF CTGF
CTGF
28s
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
28s 28s
28s
01
21
2
3
43
Ejercicio (meses)
mdx Sedentario
mdx ejercitado
50 m
B
100
90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
mdx
Ejercicio
(meses)
0 1 2 3
CTGF
28s
Niveles relativos de expresin
del mRNA para CTGF
3
2,5
2
3
3
4
2
1,5
1
0,5
0
0
1
1
2
Ejercicio (meses)
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
TGF-
28s
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
CTGF
28s
B
Niveles relativos de expresin del
mRNA para CTGF
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
Ejercicio
+ +
50 m
mdx
C57BL/10
Andrograflido
A
Nucleos
positivos
para
smad-3
fosforilada
100
90
80
70
60
mdx
C57BL/10
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
100
90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
1.2. Determinar el efecto del andrograflido sobre los niveles de MEC e inflamacin
en msculos distrficos.
Los resultados del objetivo anterior sugieren que existe una regulacin del nmero
de clulas presentes en el tejido muscular distrfico en respuesta al ejercicio y al
andrograflido. El msculo esqueltico distrfico se caracteriza por presentar un alto
nmero de clulas inflamatorias (Macrfagos, linfocitos, etc.), muchas de las cuales son
capaces de responder a TGF. En colaboracin con el laboratorio del Dr. James Tidball
(University of California Los ngeles, Estados Unidos) estudiamos la presencia de clulas
inflamatorias en el msculo esqueltico de ratones mdx y el efecto del andrograflido sobre
estas poblaciones. Mediante inmunohistoqumica determinamos la presencia de macrfagos
(F4/80 positivos), linfocitos ayudadores (CD4 positivos, CD4+), linfocitos cito-txicos
(CD8 positivos, CD8+) y eosinfilos (MBP positivos, MBP+). Las figuras 11 y 12
muestran que el andrograflido redujo significativamente el nmero de macrfagos
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
16000
14000
Clulas/mm2
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Macrofagos
Eosinlos
CD4+
CD8+
mdx + Vehculo
12145
4635
841
339
mdx + PARACTIN
6323
2298
417
170
-
-
+
-
-
+
+
+
50 m
Figura 13. El Andrograflido inhibe la induccin de fibrosis en msculos distrficos. Ratones mdx de 3
meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al
finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante tincin de
Hematoxilina/Eosina.
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
-
-
+
-
-
+
+
+
50 m
Figura 14. El Andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III en msculos ditsrficos. Ratones
mdx de 3 meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3
meses. Al finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante
inmunofluorescencia indirecta para detectar la protena de MEC, colgeno tipo III (verde).
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
A
C57BL/10
Ejercicio
Ejercicio
Andrograflido
PARACTIN
+ -
mdx
+
+
+
+ +
+ -
+
FN
Col
III
GAPDH
mdx
Ejercicio
Paractin
Ejercicio
Andrograflido
-
-
+
-
+
-
+
+
FN
Tub
Figura 15. El Andrograflido inhibe la induccin de MEC en msculo de ratones mdx. A.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con el inhibidor de Andrograflido y
adems fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisl
el msculo Tibialis Anterior y se procedi a realizar un extracto de protenas para determinar los
niveles de Fibronectina (FN) y colgeno tipo III (Col III) mediante ensayos de western blot.
Como control de carga se evaluaron los niveles de la protena GAPDH. B. Ratones mdx de 2
semanas de edad fueron tratados o no con el inhibidor de NFkB (Andrograflido) y a partir de los
3 meses de edad fueron tambin ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el
protocolo, se aisl el msculo Tibialis Anterior y se procedi a determinar los niveles de
fibronectina (FN) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evalu la protena
Tubulina (Tub).
A
--
-- -- -- --
--
--
CTGF
B
--
--
50 --
--
50
25
--
Andrograflido (M)
CTGF
28S
18S
mdx
TGF-
TGF-
(10
ng/ml)
+ +
Andrograflido
(50M)
PARACTIN
+ -
+
FN
COL
III
CTGF
GAPDH
Figura 17. El Andrograflido inhibe la induccin de protenas de MEC por
TGF- en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas
durante 24 horas con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido. Finalizado
el protocolo se evalu mediante ensayos western blot los niveles de fibronectina,
Colgeno tipo III y CTGF. Como control de carga se utiliz la protena GAPDH.
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + Andrograflido
TGF- + PARACTIN
Figura 18. El Andrograflido inhibe la insuccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de Andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo se evalu mediante inmunofluorescencia
indirecta en celulas no permeabilizadas, la acumulacin de Colgeno tipo III
(verde). En azul (Hoechst) se muestran los ncleos celulares.
Control
Andrograflido
Paractin
TGF- + Andrograflido
TGF- + Paractin
Hoechst
TGF-
Figura 19. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo, las clulas fueron soltadas utilizando el
quelante de calcio EDTA para luego evaluar mediante inmunofluorescencia
indirecta, la deposicin de Colgeno tipo III (rojo). En azul (Hoechst) se muestran
los ncleos celulares. Se utiliz la tincin Hoechst para demostrar que la seal es
proveniente de la MEC y no de clulas adheridas.
A
TGF-
Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col
III
Tub
B
TGF-
Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col
III
Tub
Figura 20. El Andrograflido inhibe la induccin de protena de MEC por
TGF- en miotubos y fibroblastos. A. Clulas musculares C2C12 fueron
diferenciadas para formar miotubos, al da 5 de diferenciacin fueron incubadas
durante 24 horas con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido. Finalizado
el protocolo se evalu mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina
y colgeno tipo III, como control de carga se utiliz la protena GAPDH. B.
Fibroblastos 3T3 fueron incubados durante 24 horas con TGF-b en presencia y
ausencia de Andrograflido. Finalizado el protocolo se evalu mediante ensayos de
western blot los niveles de fibronectina y colgeno tipo III, como control de carga
se utiliz la protena GAPDH.
B
12
A
12 10
10 8
8 6
6
4
2
4
2
0
12
10
8
6
4
2
Vehculo
D
12
12
TGF-
+
BSA
TGF-
BSA
++
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
++
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
+
BSA
BSA
+
Vehiculo
TGF-
+ +
BSA
+ +
BSA
+ +
TGF-
+ +
Adv
GFP
Adv
GFP
Adv
C TGF
Adv
C TGF
Vehculo
0
Vehiculo Andrograflido
Andrograflido Vehculo
Vehiculo Andrograflido
Andrograflido
TGF- +
BSA +
+
TGF- +
TGFb
BSA
+
Vehiculo
TGFb
+
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
+
Vehculo Andrograflido
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
10
8
6
4
2
10
8
6
4
2
0
TGF- +
BSA +
TGF- +
TGFb
+
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
+
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
+
TGFb
BSA
+
Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
TGF-
+
BSA
TGF-
TGFb
++
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
++
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
+
TGFb
BSA
+
Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
TGF- (1ng/ml)
Andrograflido(50M)
-
-
-
+
+
-
+
p-smad3
smad3
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + Andrograflido
TGF- + PARACTIN
25
20
15
10
5
0
control
TGF-b
andrograflido
andrograflido
+
TGF-b
Dado que est descrito que el andrograflido inhibe a NFB y en esta investigacin
hemos demostrado que adems inhibe los efectos de TGF decidimos determinar si
TGF es capaz de activar a NFB en clulas musculares C2C12. Existen ciertos eventos
necesarios que conllevan a la activacin de NFB, como la fosforilacin de IB y la
posterior degradacin de este. La figura 25a muestra que TGF induce la fosforilacin de
IB, adems observamos que esta fosforilacin trajo por consecuencia la degradacin de la
protena IB (figura 25b). Para corroborar la observacin de que TGF podra activar la
ruta de sealizacin de NFB en clulas musculares, evaluamos la actividad de un gen
reportero que posee elementos de respuesta especficos para NFB en respuesta a TGF
en clulas musculares C2C12. Los resultados obtenidos sugieren que TGF es capaz de
inducir la actividad del reportero para NFB y que esta es inhibida completamente por el
andrograflido (Figura 26). Adems, se observa que existe una menor actividad del
reportero en las clulas no inducidas con TGF pero tratadas con andrograflido, lo cual
indica una inhibicin de la actividad basal de NFB en estas clulas.
Conclusiones objetivo 1.3: El andrograflido inhibe los efectos pro-fibrosantes y proinflamatorios inducidos por TGF de una manera smad independiente. Adems TGF es
capaz de activar la ruta cannica de NFB en clulas musculares C2C12, la cual es inhibida
por el andrograflido.
TGF-
(1ng/ml)
TGF-PARACTIN
Andrograflido
(TGF-
50M)
Andrograflido
-
+
+
--
+
+
++
+
+
+
-
--
+++
-
-
-
- -
P-P-IB
IB
IB
IB total
IB total
B
60
60
60
3360
-
-
PARACTIN
TGF-
--
P-IB
(1ng/ml)
TGF-TGF-
(1
ng/ml)
IB
-
+
+
+
-
+
Veces
de
induccin
gen
reportero
NFB
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Andrograflido (50
M)
PARACTIN
H2O2
TGF- (10
ng/ml)
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
En el objetivo anterior demostramos que el andrograflido inhibe los efectos profibrticos y pro-inflamatorios inducidos por TGF tanto in vivo como in vitro. Por lo
tanto, nos planteamos estudiar si este efecto era exclusivo para TGF o tambin poda
afectar los efectos de su mediador ro abajo CTGF. Un ensayo para determinar la actividad
de CTGF, es evaluar la formacin de fibras de estrs en respuesta a CTGF en clulas
musculares C2C12. La figura 27 muestra, a travs de inumonofluorescencia, que en clulas
tratadas con andrograflido, CTGF no es capaz de inducir la formacin de fibras de estrs,
lo cual sugiere que el andrograflido no slo afecta la expresin de CTGF, como se mostr
en el sub objetivo anterior, sino que tambin tiene un efecto ro abajo de la sealizacin de
CTGF (figura 27).
En nuestro laboratorio, Gabriela Morales (Morales y cols., 2011) demostr que
CTGF es capaz de inducir fibrosis en el msculo esqueltico de ratones control. Por ello,
decidimos evaluar si el andrograflido era capaz de inhibir, in vivo, los efectos profibrosantes inducidos por CTGF. Para tal efecto, ratones control fueron tratados o no con
andrograflido e inyectados en el msculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene
la secuencia codificante para CTGF. La figura 28 muestra una inmunohistoqumica para
colgeno tipo III en cortes histlogicos de msculo Tibialis Anterior, en donde se observa
que el andrograflido inhibi la induccin de este marcador de MEC por CTGF. Adems,
mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real (figura 29), evaluamos los niveles de
expresin de marcadores de fibrosis (colgeno tipo I) e inflamacin (IFN-, CD68 y
Control
Andrograflido
CTGF
CTGF + Andrograflido
100 m
B
12
12
A
10
8
6
4
2
0
8
6
4
2
0
Adv
+
Adv
GFP
GFP
+
Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv
GFP
GFP
++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
Adv
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
BSA
+
VGFP
ehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
+
BSA
+
PGFP
ARACTIN
Andrograflido
TGFb
Vehiculo
Adv+CTGF
+
Vehculo
Adv+
CTGF
+
TGFb
PARACTIN
Andrograflido
D
12
12
10
10
8
6
4
10
8
6
4
2
0
Adv
Adv
GFP
GFP
++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
+
Adv
GFP
GFP
+
Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
Adv
Adv
GFP
GFP
++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
GFP
GFP
+
Vehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
Andrograflido
Vehiculo
PARACTIN
Vehculo
CD206), observando que CTGF no solo acta como un pro-fibrtico sino que tambin tiene
actividad pro-inflamatoria. Ambos tipos de actividades fueron inhibidas por el
andrograflido, teniendo este un mayor efecto sobre la induccin de marcadores del tipo
M1 (CD68) por sobre M2 (CD206). Para ahondar en este tema, evaluamos mediante
inmunofluorescencia indirecta la presencia de clulas inflamatorias, especficamente
macrfagos, en el msculo esqueltico de animales tratados o no con el andrograflido que
fueron inyectados con el adenovirus codificante para CTGF. La figura 30 muestra que
CTGF indujo una elevada infiltracin macrofgica tanto del tipo M1 (F4/80 positivos y
CD206 negativos) como del tipo M2 (F4/80 positivos y CD206 positivos). El
andrograflido disminuy considerablemente esta respuesta inflamatoria inducida por
CTGF, teniendo un efecto principalmente sobre la respuesta inflamatoria del tipo M1 como
se puede observar en la figura 31.
A
Adv CTGF
+
PBS
50 m
50 m
B
2000
N de Macrfagos M2/mm2
1600
1400
1200
1000
800
600
400
Macrfagos M2
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
200
100
%
de
Macrfagos M1
o
M2/
Macrfagos
totales
N de Macrfagos M1/mm2
2000
Macrfagos M1
1800
90
80
70
60
50
Macrfagos M1
40
Macrfagos M2
30
20
10
0
Adv
CTGF
+
Vehculo
En el objetivo 1, hemos demostrado que tanto TGF y CTGF poseen efectos proinflamatorios y pro-fibrosantes y que adems el andrograflido es capaz de inhibir estos
efectos. No obstante, consideramos importante y necesario evaluar el impacto de estos
fenmenos patolgicos en la fisiologa del msculo esqueltico. Observamos que tanto
CTGF y TGF se relacionan con un deterioro del fenotipo muscular y que estos
fenmenos pueden ser reveritidos por el andrograflido, Sin embargo no queda claro cules
son los procesos celulares que la fibrosis podra estar afectando. Por un lado, para que
exista una correcta reparacin de las fibras daadas, las clulas precursoras deben llegar a
tiempo a los sitios en donde comenzarn a formar fibras musculares nuevas, por lo tanto, es
plausible pensar que en el tejido muscular fibrtico este proceso se vea dificultado. Por otra
parte, no necesariamente un msculo distrfico con menor grado de fibrosis se traducir en
un msculo de mejores caractersticas funcionales o contrctiles.
Para determinar si la fibrosis propiamente tal, afecta la migracin celular en
msculos distrficos, aislamos fibroblastos de tendn, los cuales tienen un alta capacidad
migratoria adems de tener la facultad de sobrevivir en zonas con alto contenido de MEC y
bajo contenido de oxigeno (Gargioli y cols., 2008). Estos fibroblastos fueron teidos con
una sonda lipoflica fluorescente (DiI) y fueron inyectados en el msculo tibialis anterior.
Luego de un mes los msculos fueron procesados para anlisis inmunohistolgicos. La
figura 32 muestra que la migracin se ve disminuida en msculos de animales distrficos
con un mayor grado de fibrosis (msculo ejercitado), el tratamiento previo con el
andrograflido para inhibir la induccin de fibrosis, logr recuperar a niveles control la
migracin celular. Del mismo modo, en la figura 33 se puede observar como las clulas
migratorias migran hacia zonas con menor deposicin de colgeno tipo III.
Conclusin objetivo 2.1. La fibrosis producto del ejercicio inhibe la migracin celular en
msculo de ratones mdx, efecto que puede revertirse con el tratamiento con adrograflido.
Del mismo modo, fibroblastos migratorios se distribuyen preferentemente en zonas con
bajo contenido de MEC.
30
25
20
15
10
5
0
Ejercicio
Andrograflido
-
1
-
+
2
-
-
3
+
4
+
+
Figure 32. La fibrosis inhibe la migracin celular y el andrograflido revierte este efecto.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con andrograflido y adems
ejercitados durante 3 meses. Finalizado este protocolo se procedi a inyectar 5 millones de
clulas migratorias (fibroblastos de tendn) teidas con DiI (rojo) en el musculo Tibialis
Anterior. A. Luego de transcurrido un mes post-inyeccin se cuantific el nmero de clulas
encontradas en lugares lejanos al sitio de la inyeccin en relacin al numero total de clulas
encontradas por seccin. En verde se muestra la protena colgeno tipo III teida mediante
inmunofluorescencia. B. Cuantificacin del porcentaje de clulas encontradas en zonas
alejadas al sitio de la inyeccin (mayor a 1 mm de distancia).
% de celulas migratorias
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0-10
10-20
20-30
30-40
40-50
50-60
60-70
70-80
80-90
90-100
en el msculo Tibialis Anterior con precursores miognicos (clulas satlites) estos ensayos
fueron realizados en colaboracin con el Dr. Jaime Gutirrez de nuestro laboratorio. La
figura 34 muestra una inmunofluorescencia doble, en donde se observa la disminucin de
la protena colgeno III (verde) en ratones mdx tratados con el andrograflido y un aumento
significativo en el nmero de fibras musculares que re-expresan la protena distrofina
(rojo), llegando a un incremente de ms de un 300% en comparacin a la reversin
observada en msculos provenientes de ratones mdx no tratados con el andrograflido.
Dado que el ejercicio indujo fibrosis en el msculo esqueltico de los ratones mdx y
sta es disminuida por el andrograflido (como se observ en el objetivo 1), nos
propusimos determinar cmo estos eventos afectan la funcionalidad muscular. De esta
forma, nos enfocamos en determinar directamente la fuerza muscular desarrollada en
msculos aislados, mediante tcnicas de electrofisiologa. Primero se procedi a determinar
la frecuencia en la cual el msculo desarrolla una contraccin mxima (sacudida),
realizando un barrido de 0 a 200 pulsos/segundo (pps) (De Luca y cols., 2005). En la figura
35 se observa una medicin electrofisiolgica para el msculo Gastronemio, en donde se
aprecia una curva tpica de frecuencia versus fuerza muscular tanto para el msculo de
Vehculo
Andrograflido
200
160
120
80
40
0
mdx
+
Vehculo
mdx + PARACTIN
35
30
mN/mm2
25
20
* *
C57
+ Vehculo
C57
BL/10
+
Vehculo
C57
+ Andrograflido
C57
BL/10
+
PARACTIN
mdx
+ Andrograflido
mdx
BL/10
+
PARACTIN
15
mdx
+ Vehculo
mdx
BL/10
+
Vehculo
10
5
0
0
20
40
60
Frecuencia
(pps)
80
100
ratones control como mdx tratados o no con el andrograflido. A partir de una frecuencia de
30 pps las curvas comienzan a diferenciarse significativamente, llegando el msculo del
animal control a desarrollar ms del doble de fuerza por unidad de rea que su par mdx.
Cuando se analizaron los msculos provenientes de ratones mdx y se compararon con los
provenientes de mdx tratados con andrograflido, se observ que estos ltimos desarrollan
alrededor de un 40% ms de fuerza. Este resultado es muy interesante, ya que muestra que
el andrograflido no solo inhibe la induccin de inflamacin y fibrosis, sino que a su vez es
capaz de mejorar la capacidad de generar fuerza, lo cual es vital en modelos de
enfermedades distrficas como la DMD. De la misma forma, luego de obtenida la
frecuencia mnima con la que se genera mayor fuerza contrctil, procedimos a determinar la
fuerza sostenida (ttanos) producida por estos msculos. En la figura35 podemos observar
que ratones mdx tratados con el andrograflido producen mayor fuerza contrctil llegando
incluso hasta un incremento cercano al 50%.
Se sabe que los ratones mdx presentan una disminucin en su rendimiento frente al
ejercicio cuando se comparan con ratones control. La principal caracterstica observada es
la acentuada fatiga que presentan cuando son ejercitados. De esta forma decidimos
determinar si esta caracterstica est relacionada directamente con la induccin de fibrosis.
Para dicho objetivo, montamos un protocolo para evaluar el rendimiento de los animales
frente al ejercicio (ver materiales y mtodos). En este ensayo se evalu el nmero de veces
en que los animales tienden a descansar sobre la cinta corredora. En la figura 36 se puede
observar que el nmero de veces que retrocede el ratn mdx es 5 veces mayor que sus pares
control. En contraste, los ratones mdx que recibieron el tratamiento con el andrograflido
presentan una menor fatiga, la cual en promedio es solo 3 veces mayor que las de los
30
25
mN/mm2
20
15
10
5
0
C57Bl/10
+
C57Bl/10
+
mdx+
Vehculo
mdx
+
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
30
mN/mm2
#Retrocesos
25
35
30
20
25
15
20
10
15
105
5
00
C57Bl/10
+
C57Bl/10
+
mdx+
Vehculo
mdx
+
C57
+
Vehculo
C57
+
mdx
+
Vehculo
mdx
+
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
PARACTIN
PARACTIN
animales control, o dicho de otra manera alrededor de un 50% menor que la presentada por
ratones mdx no tratados. Estos resultados en conjunto sugieren que una disminucin en la
fibrosis muscular, como tambin en la inflamacin crnica en msculos distrficos
repercute positivamente en la funcionalidad del tejido muscular.
Discusin
con el de fibrosis, sin embargo los mecanismos celulares y moleculares que ligan ambos
eventos no estn del todo claro.
En esta tesis demostramos que el andrografolido es capaz de inhibir la actividad
pro-fibrosante y pro-inflamatoria de TGF y CTGF en el msculo esqueltico. Adems,
demostramos que la fibrosis dificulta la correcta migracin celular en el msculo
esqueltico y que la disminucin de la fibrosis aumenta la eficiencia de las terapias
celulares as como tambin provoca un aumento en el desarrollo de fuerza muscular.
del ejercicio sobre la expresin de estas citoquinas o por consecuencia del dao
inflamatorio producto del estrs mecnico. En este contexto, se ha demostrado que la
expresin de CTGF, puede ser inducida en forma transitoria en respuesta al ejercicio en
msculos de individuos sanos (Kivela y cols., 2007), probablemente producto de la tensin
mecnica a la cual se someten la fibras musculares en actividad contrctil. Esta evidencia se
sustenta con experimentos in vitro que demuestran que la sola tensin mecnica de clulas
musculares induce transitoriamente la expresin de CTGF (Chaqour y cols., 2006). Estas
observaciones podran explicar la causa del aumento de la expresin de CTGF en ratones
mdx sometidos a ejercitacin, no obstante en este ltimo caso la expresin de CTGF fue
sostenida en el tiempo, lo cual da cuenta de una diferencia tangencial entre el aumento
transitorio de CTGF en msculos sanos en respuesta al ejercicio en comparacin al
aumento sostenido observado en msculo distrfico. Nuestros resultados sugieren que el
proceso de inflamacin est involucrado en este proceso, ya que demostramos que el antiinflamatorio de origen botnico, andrograflido, inhibe la induccin de CTGF en respuesta
al ejercicio sin afectar la induccin de la expresin de TGF. Nuestros resultados se
correlacionaron con la disminucin de la fibrosis inducida por ejercicio en el msculo
distrfico de ratones mdx tratados con el andrograflido, en donde observamos que el uso
del andrograflido inhibi la induccin de colgeno tipo III y fibronectina. El aumento de
expresin de TGF por el ejercicio result ser concomitante con un aumento en el nmero
de clulas positivas para la protena smad-3 fosforilada, lo cual sugiere un aumento en la
actividad de esta ruta, no obstante la razn de clulas positivas para smad-3 fosforilada y el
nmero de clulas totales, no present cambios significativos, lo cual sugiere un cambio en
el nmero total de clulas que responden a TGF y no en su actividad. Por su parte, el
clave para la induccin de CTGF en respuesta a TGF (Leask and Abraham, 2004).
Nuestros resultados indican que el andrograflido no afecta la ruta de sealizacin cannica
activada por TGF, descartando de esta forma una accin inespecfica del andrograflido,
al menos, en esta ruta de sealizacin.
En esta tesis hemos demostrado que TGF tiene actividad pro-inflamatoria in vivo.
TGF indujo la expresin de protenas de MEC como colgeno tipo III y de marcadores
especficos de clulas inflamatoria. Todos estos efectos fueron inhibidos o al menos
reducidos cuando los ratones haban sido tratados con andrograflido, por lo tanto el
andrograflido es capaz de inhibir in vivo la accin pro-inflamatoria de TGF. Es
interesante destacar, el fuerte efecto pro-inflamatorio observado en respuesta a TGF en
el msculo esqueltico, el cual indujo un fuerte aumento de los marcadores de macrfagos
M1 y M2. No obstante, este resultado no indica una accin directa de TGF sobre estas
poblaciones de clulas inflamatorias. Otra observacin importante, es que el andrograflido
tuvo un efecto inhibitorio mayor en la induccin de CD68 (marcador de macrfagos M1)
por TGF en comparacin a la expresin de CD206 (macrfagos M2).
Es interesante destacar que todos los efectos evaluados, inducidos por TGF,
fueron emulados por la sobrexpresin adenoviral de CTGF en el msculo esqueltico.
CTGF indujo una fuerte respuesta inflamatoria, caracterizada por una elevada infiltracin
de macrfagos M1 y M2. De la misma manera que lo observado para TGF, el
molculas de adhesin y quemoquinas, las cuales reclutan linfocitos al sitio de dao. CTGF
contribuye activamente a este fenmeno, de hecho estudios in vitro demuestran que CTGF
induce la adhesin de monocitos y macrfagos de una manera dependiente de integrinas
(Bai y cols., 2010; Schober y cols., 2002). La administracin sistmica de CTGF promueve
la infiltracin de linfocitos T y macrfagos en el intersticio renal (Sanchez-Lopez y cols.,
2009).
sintasa inducible (iNOS). Estos aumentan la expresin de TNF , IL-1, xido ntrico, y
las principales molculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II para de esta
forma promover la inflamacin de los tejidos. Por su parte, los macrfagos alternativamente
activados (M2) son activados por las citoquinas TH-2, IL-4 e IL-13 y expresan altos niveles
de la enzima arginasa, pero un bajo nivel de iNOS. Estos macrfagos suprimen la respuesta
TH-1 e inhiben la expresin de TNF e IL-1. El receptor de manosa CD206 parece ser
un marcador relativamente especfico de esta poblacin celular. Debido a que la arginasa
puede catalizar la conversin de arginina en L-prolina, una molcula precursora de la
sntesis de colgeno, se cree que los macrfagos M2 pueden promover la fibrosis de los
tejidos. Sin embargo, un estudio reciente demostr que la arginasa-1 que expresan los
macrfagos suprime las citoquinas TH-2 impulsada por la inflamacin y la fibrosis en el
hgado inducida por la infeccin con Schistosoma mansoni (Pesce y cols., 2009). En este
modelo de la enfermedad, la arginasa-1 que expresan los macrfagos suprime la
proliferacin de los linfocitos T CD4 + e inhibe tanto las repuestas TH-1 y TH-2 de la
arginina. Estos resultados indican que el M2 puede funcionar como un supresor de la
inflamacin y la fibrosis del tejido. La L-arginina tambin suprimi la inflamacin en los
msculos de ratones mdx. La inyeccin intraperitoneal de L-arginina en ratones mdx
suprimi la inflamacin muscular y redujo la expresin de mediadores inflamatorios,
incluyendo IL-1, TNF, IL-6 y NFB (Hnia y cols., 2008). El efecto de la L-arginina en la
fibrgenesis del msculo mdx no ha sido abordada an. Villalta y cols. estudiaron subpoblaciones funcionales de macrfagos en los ratones mdx y encontraron que ambos, M1 y
M2, estn presentes a las 4 semanas en el msculo de ratones mdx en zonas de necrosis e
inflamacin prominente (Villalta y cols., 2009). In vitro, los macrfagos M1 promueven la
lisis muscular en un mecanismo mediado por xido ntrico, mientras que los macrfagos
M2 inhiben este efecto a travs de la competencia de la enzima arginasa con la iNOS por su
sustrato en comn, la arginina. A las 12 semanas, mientras que la expresin de ambas
enzimas, iNOS y arginasa, se redujo, la expresin de IL-4 e IL-10 se increment,
desactivando el fenotipo M1. La IL-10 tambin activ el fenotipo M2, promoviendo la
proliferacin de clulas satlites para la regeneracin muscular. Estos resultados sugieren
que un cambio en el fenotipo de macrfagos pueden contribuir a la regeneracin muscular y
a la resolucin de la inflamacin en los msculos de ratones mdx. La
poblacin
de
tirosina quinasas, incluyendo c-abl, c-kit, y los receptores de PDGF (Druker, 2004) y ha
sido aprobado por la FDA de EE.UU. para el tratamiento de varios tumores malignos. El
Imatinib tambin se ha demostrado para reducir la fibrosis del tejido a travs de bloqueo de
c-abl y el receptor de PDGF en muchos modelos experimental de fibrosis, incluyendo la
fibrosis pulmonar (Abdollahi y cols., 2005; Daniels y cols., 2004), cirrosis (Yoshiji y cols.,
2005), esclerosis renal (Wang y cols., 2005), y fibrosis en la piel (Distler y cols., 2007). La
sealizacin de c-abl es una ruta alternativa no-Smad que media los efectos fibrognicos de
TGF-, adems la actividad quinasa de c-abl puede ser activada tambin por PDGF
(Daniels y cols., 2004; Wang y cols., 2005). La expresin gnica y proteca de TGF- y
PDGF (as como la de sus receptores) se encuentra aumentada en las clulas inflamatorias y
en la regeneracin de las fibras de los msculos esquelticos de pacientes con DMD y
ratones mdx (Bernasconi y cols., 1995; Tidball y cols., 1992; Zhao y cols., 2003). Se ha
probado que el Imatinib reduce la fibrosis en el ratn mdx. El Imatinib redujo la necrosis
del msculo esqueltico, la inflamacin y la fibrosis, adems de mejorar la funcin
muscular. En otro estudio realizado por Bizario y cols. Se demostr que el Imatinib reduce
la fibrosis inducida por ejercicio en ratones mdx, pero produjo una significativa prdida de
peso en los animales (Bizario y cols., 2009).
El losartn, el cual es un inhibidor del receptor I de Angiotensina II y que se ha
utilizado ampliamente como un medicamento antihipertensivo. La Angiotensina II
estimula directamente la produccin de TGF- aumentando su sealizacin mediante el
aumento de los niveles de Smad-2 y la translocacin nuclear de Smad-3 fosforilada
(Rosenkranz, 2004). Cohn y cols. trataron ratones mdx de 7 semanas a 9 meses con losartn
oral y demostraro que el tratamiento inhibe la sealizacin de TGF- y redujo
muscular, si no que este es potenciado por el fenmeno inflamatorio y fibrtico. Esto apoya
la idea de que una buena alternativa para tratar pacientes con DMD es la utilizacin de una
terapia combinada, que por un lado restablezca la expresin de distrofina en los msculos
afectados y que por otro atene la inflamacin y la fibrosis tisular para facilitar la
infiltracin, migracin e incorporacin celular en el tejido blanco
Por otra parte, evaluamos de manera sistmica si el aumento de fuerza producido
por el Andrografldio observado mediante tcnicas electofosiolgicas de msculos
aislados, repercute en una mejora en el comportamiento fsico del animal. Tanto los
pacientes con DMD como su modelo animal mdx, se caracterizan por tener un
comportamiento ms bien sedentario a medida que progresa la patologa, por un lado
debido al debilitamiento muscular y por otro, ya que la actividad fsica, aumenta el dao
mecnico por contraccin de las fibras musculares, lo cual acelera la progresin de la
patologa. Sin ir ms lejos, en clnica se recomienda a los pacientes con DMD que
desarrollen la menor actividad fsica posible, para de esta forma retardar la progresin de la
enfermedad, el uso de silla de ruedas y as tambin aumentar la esperanza de vida (Bizario
y cols., 2009).
Frente a protocolos de ejercitacin, los ratones mdx presentan un rendimiento muy
por debajo del observado en ratones control, tendiendo a descansar sobe la cinta trotadora
un mayor nmero de veces. Nuestros resultados demuestran que los animales mdx tratados
con el andrograflido presentan un claro aumento en su rendimiento frente a este protocolo,
lo cual pone de manifiesto que la accin anti-inflamatoria y anti-fibrtica de esta droga no
solo repercute en una mayor fuerza muscular sino que tiene claros efectos positivos en el
comportamiento sistmico del animal. No obstante, con estos resultados no es posible
CONCLUSIONES
Referencias
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0 1 2 3
*
*
mdx
C57BL/10
Figura 1. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico de animales
distrficos mdx. Ratones mdx y controles, de 3 meses de edad, fueron sometidos a protocolos de ejercitacin,
3 veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante la tincin de Hematoxilina/Eosina. Los
asteriscos sealan fibras necrticas y las flechas ffocos de fibras musculares regenerantes.
Ejercicio
(meses)
0 1 2 3
mdx
C57BL/10
Figura 2. El ejercicio acelera la progresin del fenotipo fibrtico en el musculo esqueltico de animales
distrficos mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitacin, 3
veces por semana, por el periodo de tiempo sealado. Al finalizar el protocolo se procedi a aislar el musculo
Tibialis Anterior para evaluar sus caractersticas histolgicas mediante inmunofluorescencia para la protena de
MEC, colgeno tipo III (verde), en azul se muestran la tincin nuclear (Hoechst).
Ejercicio
(meses)
C57BL/10
mdx
Ejercicio
(meses)
0
1
2
3
0
1
2
3
FN
GAPDH
C57BL/10
mdx
Veces
de
induccin
de
(FibrionecFna/GAPDH)
2,5
1,5
1
0,5
0
1
4
5
6
Meses
de
ejercicio
mdx
Ejercicio
+
mdx
mdx
+mdx
Ejercicio
(meses)
0
+
0
0
1
-
1
1
+2
2
32
3
3
PARACTIN
-
Ejercicio
meses)
Ejercicio
((meses)
TGF- CTGF CTGF
CTGF
28s
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
28s 28s
28s
01
21
2
3
43
Ejercicio (meses)
mdx Sedentario
mdx ejercitado
50 m
B
100
90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
mdx
Ejercicio
(meses)
0 1 2 3
CTGF
28s
Niveles relativos de expresin
del mRNA para CTGF
3
2,5
2
3
3
4
2
1,5
1
0,5
0
0
1
1
2
Ejercicio (meses)
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
TGF-
28s
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
mdx
Ejercicio
+ +
Andrograflido
+ -
+
CTGF
28s
B
Niveles relativos de expresin del
mRNA para CTGF
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Ejercicio
-1
2-
3+
+4
Andrograflido
Ejercicio
+ +
50 m
mdx
C57BL/10
Andrograflido
A
Nucleos
positivos
para
smad-3
fosforilada
100
90
80
70
60
mdx
C57BL/10
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
100
90
80
70
mdx
C57BL/10
60
50
40
30
20
10
0
Ejercicio
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
mdx
mdx + Andrograflido
200 m
16000
14000
Clulas/mm2
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
Macrofagos
Eosinlos
CD4+
CD8+
mdx + Vehculo
12145
4635
841
339
mdx + PARACTIN
6323
2298
417
170
-
-
+
-
-
+
+
+
50 m
Figura 13. El Andrograflido inhibe la induccin de fibrosis en msculos distrficos. Ratones mdx de 3
meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al
finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante tincin de
Hematoxilina/Eosina.
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
-
-
+
-
-
+
+
+
50 m
Figura 14. El Andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III en msculos ditsrficos. Ratones
mdx de 3 meses de edad, tratados o no con Andrograflido fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3
meses. Al finalizar el protocolo, se estudiaron secciones transversales del msculo Tibialis Anterior mediante
inmunofluorescencia indirecta para detectar la protena de MEC, colgeno tipo III (verde).
Andrograflido
Ejercicio
mdx
C57BL/10
A
C57BL/10
Ejercicio
Ejercicio
Andrograflido
PARACTIN
+ -
mdx
+
+
+
+ +
+ -
+
FN
Col
III
GAPDH
mdx
Ejercicio
Paractin
Ejercicio
Andrograflido
-
-
+
-
+
-
+
+
FN
Tub
Figura 15. El Andrograflido inhibe la induccin de MEC en msculo de ratones mdx. A.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con el inhibidor de Andrograflido y
adems fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisl
el msculo Tibialis Anterior y se procedi a realizar un extracto de protenas para determinar los
niveles de Fibronectina (FN) y colgeno tipo III (Col III) mediante ensayos de western blot.
Como control de carga se evaluaron los niveles de la protena GAPDH. B. Ratones mdx de 2
semanas de edad fueron tratados o no con el inhibidor de NFkB (Andrograflido) y a partir de los
3 meses de edad fueron tambin ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el
protocolo, se aisl el msculo Tibialis Anterior y se procedi a determinar los niveles de
fibronectina (FN) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evalu la protena
Tubulina (Tub).
A
--
-- -- -- --
--
--
CTGF
B
--
--
50 --
--
50
25
--
Andrograflido (M)
CTGF
28S
18S
mdx
TGF-
TGF-
(10
ng/ml)
+ +
Andrograflido
(50M)
PARACTIN
+ -
+
FN
COL
III
CTGF
GAPDH
Figura 17. El Andrograflido inhibe la induccin de protenas de MEC por
TGF- en clulas musculares. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas
durante 24 horas con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido. Finalizado
el protocolo se evalu mediante ensayos western blot los niveles de fibronectina,
Colgeno tipo III y CTGF. Como control de carga se utiliz la protena GAPDH.
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + Andrograflido
TGF- + PARACTIN
Figura 18. El Andrograflido inhibe la insuccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de Andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo se evalu mediante inmunofluorescencia
indirecta en celulas no permeabilizadas, la acumulacin de Colgeno tipo III
(verde). En azul (Hoechst) se muestran los ncleos celulares.
Control
Andrograflido
Paractin
TGF- + Andrograflido
TGF- + Paractin
Hoechst
TGF-
Figura 19. El andrograflido inhibe la induccin de colgeno tipo III por TGF. Clulas musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF- en
presencia y ausencia del inhibidor de andrograflido y el extracto enriquecido en el
(PARACTIN). Finalizado el protocolo, las clulas fueron soltadas utilizando el
quelante de calcio EDTA para luego evaluar mediante inmunofluorescencia
indirecta, la deposicin de Colgeno tipo III (rojo). En azul (Hoechst) se muestran
los ncleos celulares. Se utiliz la tincin Hoechst para demostrar que la seal es
proveniente de la MEC y no de clulas adheridas.
A
TGF-
Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col
III
Tub
B
TGF-
Andrograflido
-
-
-
+
+
-
+
+
FN
Col
III
Tub
Figura 20. El Andrograflido inhibe la induccin de protena de MEC por
TGF- en miotubos y fibroblastos. A. Clulas musculares C2C12 fueron
diferenciadas para formar miotubos, al da 5 de diferenciacin fueron incubadas
durante 24 horas con TGF- en presencia y ausencia de Andrograflido. Finalizado
el protocolo se evalu mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina
y colgeno tipo III, como control de carga se utiliz la protena GAPDH. B.
Fibroblastos 3T3 fueron incubados durante 24 horas con TGF-b en presencia y
ausencia de Andrograflido. Finalizado el protocolo se evalu mediante ensayos de
western blot los niveles de fibronectina y colgeno tipo III, como control de carga
se utiliz la protena GAPDH.
B
12
A
12 10
10 8
8 6
6
4
2
4
2
0
12
10
8
6
4
2
Vehculo
D
12
12
TGF-
+
BSA
TGF-
BSA
++
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
++
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
+
BSA
BSA
+
Vehiculo
TGF-
+ +
BSA
+ +
BSA
+ +
TGF-
+ +
Adv
GFP
Adv
GFP
Adv
C TGF
Adv
C TGF
Vehculo
0
Vehiculo Andrograflido
Andrograflido Vehculo
Vehiculo Andrograflido
Andrograflido
TGF- +
BSA +
+
TGF- +
TGFb
BSA
+
Vehiculo
TGFb
+
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
+
Vehculo Andrograflido
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
Andrograflido
10
8
6
4
2
10
8
6
4
2
0
TGF- +
BSA +
TGF- +
TGFb
+
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
+
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
+
TGFb
BSA
+
Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
TGF-
+
BSA
TGF-
TGFb
++
TGFb
+
Vehiculo
TGFb
++
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
+
TGFb
BSA
+
Vehiculo
Vehculo
Andrograflido
Andrograflido
TGF- (1ng/ml)
Andrograflido(50M)
-
-
-
+
+
-
+
p-smad3
smad3
Control
Andrograflido
PARACTIN
TGF-
TGF- + Andrograflido
TGF- + PARACTIN
25
20
15
10
5
0
control
TGF-b
andrograflido
andrograflido
+
TGF-b
TGF-
(1ng/ml)
TGF-PARACTIN
Andrograflido
(TGF-
50M)
Andrograflido
-
+
+
--
+
+
++
+
+
+
-
--
+++
-
-
-
- -
P-P-IB
IB
IB
IB total
IB total
B
60
60
60
3360
-
-
PARACTIN
TGF-
--
P-IB
(1ng/ml)
TGF-TGF-
(1
ng/ml)
IB
-
+
+
+
-
+
Veces
de
induccin
gen
reportero
NFB
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Andrograflido (50
M)
PARACTIN
H2O2
TGF- (10
ng/ml)
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
Control
Andrograflido
CTGF
CTGF + Andrograflido
100 m
B
12
12
A
10
8
6
4
2
0
8
6
4
2
0
Adv
+
Adv
GFP
GFP
+
Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv
GFP
GFP
++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
Adv
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
BSA
+
VGFP
ehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
+
BSA
+
PGFP
ARACTIN
Andrograflido
TGFb
Vehiculo
Adv+CTGF
+
Vehculo
Adv+
CTGF
+
TGFb
PARACTIN
Andrograflido
D
12
12
10
10
8
6
4
10
8
6
4
2
0
Adv
Adv
GFP
GFP
++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
+
Adv
GFP
GFP
+
Vehiculo
Vehculo
Adv
Adv
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Andrograflido
Vehculo
Vehiculo
PARACTIN
Adv
Adv
GFP
GFP
++
Andrograflido
PARACTIN
Adv
GFP
GFP
+
Vehiculo
Adv
+
Vehculo
Adv
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
CTGF
CTGF
+
+
Adv
Andrograflido
Vehiculo
PARACTIN
Vehculo
A
Adv CTGF
+
PBS
50 m
50 m
B
2000
N de Macrfagos M2/mm2
1600
1400
1200
1000
800
600
400
Macrfagos M2
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
200
100
%
de
Macrfagos M1
o
M2/
Macrfagos
totales
N de Macrfagos M1/mm2
2000
Macrfagos M1
1800
90
80
70
60
50
Macrfagos M1
40
Macrfagos M2
30
20
10
0
Adv
CTGF
+
Vehculo
30
25
20
15
10
5
0
Ejercicio
Andrograflido
-
1
-
+
2
-
-
3
+
4
+
+
Figure 32. La fibrosis inhibe la migracin celular y el andrograflido revierte este efecto.
Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con andrograflido y adems
ejercitados durante 3 meses. Finalizado este protocolo se procedi a inyectar 5 millones de
clulas migratorias (fibroblastos de tendn) teidas con DiI (rojo) en el musculo Tibialis
Anterior. A. Luego de transcurrido un mes post-inyeccin se cuantific el nmero de clulas
encontradas en lugares lejanos al sitio de la inyeccin en relacin al numero total de clulas
encontradas por seccin. En verde se muestra la protena colgeno tipo III teida mediante
inmunofluorescencia. B. Cuantificacin del porcentaje de clulas encontradas en zonas
alejadas al sitio de la inyeccin (mayor a 1 mm de distancia).
% de celulas migratorias
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0-10
10-20
20-30
30-40
40-50
50-60
60-70
70-80
80-90
90-100
Vehculo
Andrograflido
200
160
120
80
40
0
mdx
+
Vehculo
mdx + PARACTIN
35
30
mN/mm2
25
20
* *
C57
+ Vehculo
C57
BL/10
+
Vehculo
C57
+ Andrograflido
C57
BL/10
+
PARACTIN
mdx
+ Andrograflido
mdx
BL/10
+
PARACTIN
15
mdx
+ Vehculo
mdx
BL/10
+
Vehculo
10
5
0
0
20
40
60
Frecuencia
(pps)
80
100
30
25
mN/mm2
20
15
10
5
0
C57Bl/10
+
C57Bl/10
+
mdx+
Vehculo
mdx
+
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
30
mN/mm2
#Retrocesos
25
35
30
20
25
15
20
10
15
105
5
00
C57Bl/10
+
C57Bl/10
+
mdx+
Vehculo
mdx
+
C57
+
Vehculo
C57
+
mdx
+
Vehculo
mdx
+
Vehculo Andrograflido
Andrograflido
PARACTIN
PARACTIN