PENGECATAN SEDERHANA DAN PENGECATAN NEGATIF

1. Pengecatan Sederhana
Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup
sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel
bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati, tanpa mengubah bentuk serta
struktur bakteri tesebut. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu
mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Mikroba sulit dilihat
dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang
menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi
dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan bentuk serta strukur seperti spora, flagela,
dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat.
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri,
memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi
jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui,
memperjelas ukuran dan bentuk sel, menghasilkan sifat fisika dan kimia yang khas dari bakteri
terhadap zat pewarna (Lubis dkk, 2007). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan
oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24
jam).
Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion
yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna
dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang
mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila
ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut
pewarna negatif (Ramona, 2008).
Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion
protoplasma sel. Ada dua kelompok zat pewarna bakteri.
(1) bersifat asam, berupa anion dan umum digunakan dalam bentuk garam natrium.
(2) bersifat alkalis, berupa kation dan umum digunakan dalam bentuk klorida.

Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil
rekasi zat warna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat
pematek yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel. Contoh zat pematek adalah:
Amonium, fenol, Yodium, Asam tanat, Garam-garam Aluminium, Besi, Timah, Seng, Tembaga,
Chrom, dll. Pematek dapat ditambahkan sebelum pewarnaan, ditambahkan ke dalam larutan zat
warna atau saat diatara pewarnaan menggunakan dua zat warna. Umumnya larutan zat warna
dibuat dalam konsentrasi kurang dari 1% untuk meningkatkan daya lekat warna pada dinding sel
bakteri.
Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna
dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan
susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain
kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin (lay ,1994).
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme
tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena
sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui
bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan
sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana
ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya
digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnapewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif). bakteri E. coli yang dilihat di bawah mikroskop cahaya
dengan pembesaran 40x. Berwarna Ungu . Bentuk E. coli tampak seperti batang (basil) pendek
yang membentuk koloni yang tersusun seperti rantai yang memanjang.

2. Pengecatan Negatif
Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri, tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan
mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga bakteri tampak transparan dengan latar belakang
hitam. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi latar belakngnya
menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus
pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka
terjadi penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh
dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif atau
pewarnaan asam dapat terjadi karena senyawa pewarnaan berwarna negatif. Dalam kondisi pH
mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang
bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding sel menjadi
tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam
pikrat dan eosin. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada
pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahanbahan kimia, maka terjadi penyusutan dan salah satu bentuk agar penentuan sel dapat diperoleh
denagan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Hadiotomo,1990).
Pada pewarnaan negatif, lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh pewarna yang
digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini telah sesuai
dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu muatan negatif,
maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat
warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan
tetap berwarna bening (Alcamo,1996)
Selaini itu, disebutkan juga pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroseluler yang pada
dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif tidak akan
mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja (entjang,2003)