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Anlisis Funcional Orgnico

Cromatografa Lquida de
Alta Resolucin (HPLC/CLAR)

PARTE A

Introduccin
Tcnicas instrumentales cromatogrficas

1. Gaseosa lquida (CGL) o slida (CGS)


2. Lquida de Alta Resolucin (HPLC/CLAR)

HPLC-AFO

Introduccin
Aplicabilidad

La muestra debe
disolverse en la FM

Amplio espectro de
compuestos

Ventajas

- Alta resolucin, eficiencia y reproducibilidad


- Anlisis rpidos, analticos y preparativos
-Resultados cuantitativos buenos std < 5%
- Automatizacin
-Lmites de deteccin buenos
UV-Vis (depende de ) 10-10 g
Fluorescencia 10-12 g

Desventajas

-Costo inicial alto y operacional medio


-Muestra debe ser soluble
-Requiere uso de patrones
-Difcil resolucin en muestras complejas
-Detectores universales
ndice de refraccin poco sensible 10-6 g
EM inversin inicial alta

HPLC-AFO

Introduccin
Teora: Conceptos bsicos

Respuesta del Detector

1. Eficiencia (N platos tericos)

HPLC-AFO

tR Tiempo de retencin
Wt Ancho de pico en la base
W1/2 Ancho de pico a media altura
A mayor valor de N mayor eficiencia
Parmetros que afectan la eficiencia:

Flujo

Longitud de la columna

Dimetro de partcula (relleno)

Distrucin del dimetro partcula

Introduccin
Teora: Conceptos bsicos
2. Factor de retencin (factor de capacidad)

Respuesta del Detector

Mide el perodo de tiempo que la muestra


reside en la fase estacionaria relativo al
tiempo que lo hace en la fase mvil. Se calcula
en funcin tR y t0.
Parmetros que afectan a k:

Fase mvil (tipo de solvente de elucin)


Composicin de la fase mvil
Fase estacionaria
Naturaleza del analito

HPLC-AFO

Introduccin
Teora: Conceptos bsicos
3. Selectividad o factor de separacin

Respuesta del Detector

= selectividad k2= Factor de retencin de 2


K1= Factor de retencin de 1
Parmetros que afectan la selectividad:

=1 los analitos eluyen juntos


HPLC-AFO

Fase estacionaria
Naturaleza del analito
Aditivos del solvente de elucin
Temperatura de trabajo
Composicin fase mvil
(analitos ionizables)

Introduccin
Teora: Conceptos bsicos
4. Resolucin

Parmetros que afectan la resolucin:


El valor de es el ms influyente en el
cambio de la resolucin.
Los parmetros que influencian a lo
hacen sobre Rs
Valores de Rs
0,6 valle entre picos. Muy bajo.
1,0 mnimo valor para cuantificar.
1,2 valor prctico de trabajo.
1,6 valor ideal.

HPLC-AFO

Introduccin
Teora: Conceptos bsicos
Ecuacin de Van Deemter

Valores de H menores
hacen el proceso ms
eficiente
Partcula chica

Altura de
plato terico

Partcula grande

Suma: Curva de
Van Deemter
Resistencia a la
transferencia de
masa FM y FE
Difusin
longitudinal

Proceso multipaso
o difusin Eddy

Velocidad Lineal

HPLC-AFO

H disminuye al reducir el
tamao de partcula

Introduccin
Componentes del equipo

4. Inyector

1. Reservorio de Fase mvil


3. Mezclador

2. Bombas

5, Columna

3. Mezclador

6. Control
Temparatura

4. Inyector
2. Bombas

5. Columna

2. Bombas

6. Control de temperatura
7. Detector

7. Detector
1. FM

8. Sistema de adquisicin y
procesado de datos
1. Solventes
8. Adquisicin y Procesado de datos
HPLC-AFO

1. Fase mvil
Requisitos

Pureza grado HPLC/UV


Compatible con el detector
Solubilice el analito
Baja viscosidad
Libre de impurezas slidas
Precio accesible
Fase normal: principalmente no polar
Fase reversa: gua + otro solvente orgnico
(metanol, acetonitrilo, THF)

Preparacin

HPLC-AFO

Filtracin al vaco.
Desgasificacin

1. Fase mvil
Mezclas de solventes
Generalmente se usan mezclas de solventes. En modo isocrtico dependiendo de la complejidad
no se utiliza el sistema de mezclado del equipo.
Siempre consultar tablas de
propiedades y miscibilidades para
evitar inconvenientes

HPLC-AFO

1. Fase mvil
Longitud de onda de corte (cut off)
Es la longitud de onda a la que la absorbancia del solvente es igual a 1 UA
(unidades de absorbancia) usando agua en la celda de referencia (1 cm
longitud de camino ptico)

Solvente

de corte

Solvente

de corte

Acetonitrilo

190

Tetrahidrofurano

212

Pentano

190

Diclorometano

233

Agua

190

Cloroformo

245

Hexano

195

Acetato de etilo

256

Metanol

205

Iso-Octane

215

Etil alcohol

210

Isobutyl Alcohol

220

cido trifluoroactico

210

HPLC-AFO

1. Fase mvil

Para compuestos ionizables,


como los cidos o bases
orgnicas, se recomienda
controlar el pH y la fuerza
inica.
El rango de pH recomendado
es de pH 2-4
El pH de trabajo es +/- 1
unidad de pH con respecto al
pKa o pKb de los analitos. Se
trabaja generalmente con un
predominio de la especie no
ionizada. El pH se ajusta
siempre en el componente
acuoso

HPLC-AFO

1. Fase mvil
Preparacin

Membrana de Nylon

La fase mvil no debe tener partculas en suspensin


filtrarla cuidadosamente cada vez que se usa
Importancia desgasificacin

Equipo para
filtrar solventes
de HPLC

Mtodos
1.
2.
3.
4.
HPLC-AFO

Ultrasonido
Vaco
Saturacin con He o N2
Desgasificacin on-line

2. Bombas y tuberas
Tipos de bomba

Tuberas

A. Reciprocante
Bomba a diafragma
B. Bomba jeringa

Modos de utilizacin
A. Isocrtico
B. Gradiente

HPLC-AFO

4. Inyector
A. Flujo normal

B. Agregado de muestra
bomba

Jeringa punta roma

Manual y automtico
bomba

loop
columna
columna
C. Ingreso al sistema
bomba

columna
HPLC-AFO

5. Columna
Tipos
Analtica: Interesa saber cuntos componentes hay, cunto hay de cada uno (cuantificar), pero no me
interesa colectarlos por separado. Cantidad de muestra < 0.1 mg
Preparativa: Interesa separar todos los componentes y colectarlos por separado para despus analizarlos
individualmente. Cantidad de muestra desde 1 mg hasta 100-200 mg

UHPLC (Ultra high


pressure liquid
chromatography):
Para reducir los tiempos de
anlisis y con resolucin
mejorada. Columnas de 1,82
m
de
tamao
de
partcula, columnas cortas (5
cm). Mejor resolucin y
eficiencia.
La
presin
aumenta a 600-1200 bar.

HPLC-AFO

5. Columna

HPLC-AFO

5. Columna
Caractersticas

HPLC-AFO

5. Columna
Fabricacin de las fases

Silanoles
libres

Uniones hidrgeno
entre silanoles
vecinales

Superficie de la slica

HPLC-AFO

uniones
siloxano

5. Columna
Estrategias de cobertura

No cubierta

HPLC-AFO

Impedimento
estrico. No
cubierta

Recubierta en dos
etapas.
Endcapped

Recubierta