UNVERSIDAD PARTICULAR DE CHICLAYO

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA

I. INTRODUCCION:
El SIDA, se identific por primera vez en 1981, es una enfermedad infecciosa inducida
por un virus VIH y caracterizada por una inmunidad fuertemente deprimida. El
principal determinante de la patogenicidad del virus es el tropismo por los linfocitos T y
los monocitos, quien utiliza la molcula CD4 como receptor para ingresar e infectar las
clulas.
Una caracterstica importante del VIH es que su replicacin en algunas clulas parece
restringida lo que da como resultado su mantenimiento en una forma latente (periodo
de ventana). La infeccin latente permite que el genoma del VIH est presente en las
clulas T y los macrfagos, en ausencia de la expresin de las protenas virales, lo que
da como resultado clulas infectadas de manera persistente que permanecen
invisibles para el sistema inmune del husped.
El SIDA representa un amplio espectro de afecciones clnicas. Habitualmente se
produce cierto nmero de infecciones oportunistas y procesos malignos que
constituyen el signo distintivo del sndrome, el ms comn es el Sarcoma de Kaposi
El diagnstico se establece por medio de la combinacin del reconocimiento de un
sndrome clnico, la demostracin de anticuerpos anti VIH sricos por medio de ELISA
y el Wester blot.
El examen de ELISA es una de la pruebas ms eficaces, rpida, efectiva y confiable
para detectar el virus del VIH su nombre viene del trmino ingls "Enzyme-linked
immunoabsorbent assay", que quiere decir Ensayo inmunoenzimtico ligado a
enzimas". su sensibilidad y fiabilidad de esta prueba es alta, aunque no al cien por
ciento. Eso significa que, en caso de un resultado positivo, el diagnstico debe
confirmarse mediante una segunda prueba. Por coincidencia, ELISA puede detectar
otros anticuerpos que no tengan nada que ver con el VIH y que estn presentes en la
muestra de sangre. Para identificar los anticuerpos como anticuerpos "reales" del VIH,
se realiza una segunda prueba en la misma muestra de sangre mediante la tcnica
"Western Bloot". Esta prueba visualiza la reaccin de los anticuerpos frente a
protenas estructurales independientes del VIH
Otras pruebas de laboratorio para confirmar la presencia de anticuerpos del VIH,
incluyen la inmunoelectrotransferencia o examen de Western Blot, la
inmunofluorescencia y la radioinmnoprecipitacin o RIPA.
"El periodo de ventana" o periodo de espera es el tiempo que una persona infectada
tarda en desarrollar los anticuerpos al virus. Para el 97% aproximadamente de las
personas infectadas, el periodo de ventana es de 3 meses. Despus de 6 meses casi
todas las personas que tengan el virus habrn desarrollado anticuerpos al mismo. Un
resultado negativo 6 meses despus del ltimo riesgo es suficiente para descartar la
posibilidad de infeccin. .
El perodo de ventana con las ltimas pruebas ELISA de cuarta generacin vara de 10
a 14 das. Este periodo puede prolongarse mximo por 6 meses.
II.
COMPETENCIAS
1. Observa y reconoce el principio del inmunoanlisis enzimtico (ELISA) para el
diagnstico del VIH.

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III.
FUNDAMENTO:
El SIDA, se identific por primera vez en 1981, es una enfermedad infecciosa inducida
por un virus VIH y caracterizada por una inmunidad fuertemente deprimida. El
principal determinante de la patogenicidad del virus es el tropismo por los linfocitos T y
los monocitos, el virus utiliza la molcula CD4 como receptor para ingresar e infectar
las clulas. Los mecanismos de la inmunodeficiencia inducida por el VIH incluyen la
infeccin de las clulas T perifricas, precursores de las clulas T y la infeccin de los
macrfagos
tisulares como las clulas dendrticas foliculares de los centros
germinativos de los ganglios linfticos, la piel y las clulas de Langerhans, el timo y las
clulas microgliales en el cerebro. Una vez dentro de las clulas por medio de la
endocitosis mediada por el receptor el VIH experimenta un ciclo de vida tpico de un
Lentivirus.
Una caracterstica importante del VIH es que su replicacin en algunas clulas parece
restringida lo que da como resultado su mantenimiento en una forma latente. La
infeccin latente permite que el genoma del VIH est presente en las clulas T y los
macrfagos, en ausencia de la expresin de las protenas virales, lo que da como
resultado clulas infectadas de manera persistente que permanecen invisibles para el
sistema inmune del husped.
La activacin de las clulas infectadas por el VIH latente es inducida por numerosas
citoquinas celulares inmunes entre ellas, el factor de necrosis tumoral (TNF) y la IL-6, y
lleva a diversos efectos biolgicos de la expresin de virus maduros como por ejm., un
efecto citoptico como la muerte de las clulas T infectadas y a la fusin de clulas
infectadas con clulas no infectadas para formar clulas gigantes multinucleadas.
Las clulas T infectadas por el VIH 1 lisadas liberan gran nmero de partculas
infecciosas que se absorben con rapidez a las clulas CD4 vecinas no infectadas y las
infectan, tambin se liberan protenas virales solubles, incluyendo la protena de la
envoltura externa capaz de unirse con la molcula CD4.
El SIDA representa un amplio espectro de afecciones clnicas. La inmunodeficiencia
del SIDA se relaciona con la deficiencia primaria de las clulas T inducidas por el VIH1
con una disfuncin secundaria de las clulas B con hipergammaglobulinemia policlonal
y respuesta de anticuerpos especficos defectuosos y con un defecto de la f uncin de
las clulas natural Killer.
Habitualmente se produce cierto nmero de infecciones oportunistas y procesos
malignos que constituyen el signo distintivo del sndrome, el ms comn es el
Sarcoma de Kaposi
El diagnstico se establece por medio de la combinacin del reconocimiento de un
sndrome clnico y la demostracin de anticuerpos anti VIH sricos por medio de
ELISA y el Wester Blot.
PRINCIPIO DEL TEST:
La Prueba de ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica
como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado
con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin
antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada
mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un
color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro.

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IV.

MATERIAL:

PREPARACION DE LOS REACTIVOS:

A)

SOLUCION DE LAVADO
Diluir el Reactivo 2 (R2) al 1:20 en agua destilada para obtener una solucin de
lavado lista para su uso.

1 ml. de Reactivo R2 en 19 ml. De agua destilada

B)

SOLUCION DE TRABAJO: DEL CONJUNGADO 2

Agitar con suma delicadeza el vial de conjugado liofilizado 2 (R7a) sobre la mesa
de trabajo para eliminar cualquier sustancia del tapn de caucho.
Con cuidado retirar el tapn y verter el contenido del vial diluyente del conjugado
(R7b) en el vial del conjugado liofilizado R7a.
Poner de nuevo el tapn y dejar que se asiente por 10 minutos ir, agitando por
inversin de vez en cuando para facilitar su disolucin.

C)

SOLUCION DE DESARROLLO ENZIMATICO: (SOLUCION SUSTRATO)

Diluir al 1:11 el cromogen (R9) en el tapn sustrato (R8). La estabilidad dura 6
horas en la oscuridad una vez preparada.

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V.
1.
2.
3.
4.
5.

PROCEDIMIENTO DEL TEST:

Establecer con cuidado la distribucin de las muestras y el plan de
identificacin.
Preparar la solucin de lavado diluida
Preparar la solucin de trabajo del conjugado 2
Sacar las bandejas y las tiras (R1) de la bolsa protectora
Aplicar directamente, sin lavado previo de la placa y de forma sucesiva lo
siguiente:

25 uL de conjugado 1 (R6) en cada pocillo

75 uL de control positivo Ag VIH (R5) en el pocillo A1

75 uL de control positivo Ab VIH (R4) en el pocillo B1
75 uL de control negativo (R3) en los pocillos C1, D1 y E1

75 uL de muestra en el pocillo G1
Homogenizar la mezcla mediante un mnimo de 3 aspiraciones con una pipeta
de 75 uL agitando la microplaca despus del paso del pipeteado.
6. Cubrir la microplaca con pelcula adhesiva. Apriete firmemente por todas partes
de la placa para asegurar un buen precintado.
7. Incubar la microplaca a 37C por 1 hora
8. Quitar la pelcula adhesiva y realizar los lavados:
Aspirar el contenido de los pocillos en un contenedor para productos
biolgicamente peligrosos (solucin con leja).
Agregar en cada pocillo un mnimo de 0.370 ml de solucin de lavado.

Deje que se empaque al menos 30 segundos. Aspirar y eliminar de

nuevo (Lavado)

Repetir este procedimiento un mnimo de 3 veces (3 lavados)

El volumen residual debe ser inferior a 10 uL (si es preciso secar la
placa agitando de arriba abajo en papel secante)
9. Distribuir rpidamente 100 uL de la solucin de conjugado2 en todos los
pocillos. El conjugado se debe agitar antes de su uso.
10. Siempre que sea posible, cubrir la microplaca con una nueva pelcula adhesiva
e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 30C).
11. Retirar la pelcula adhesiva y realizar 5 lavados como mnimo (paso 8)
12. Distribuir rpidamente en cada pocillo 80uL de la solucin sustrato recin
preparada antes de su uso. Incubar en oscuridad a temperatura ambiente
durante 30 minutos. No se use la pelcula adhesiva durante este paso.
13. Agregar 100 uL de la solucin de deteccin (R10) usando la misma secuencia y
tasa de distribucin que en la solucin sustrato.
La distribucin de la solucin de deteccin, que no es coloreada, se puede controlar
visualmente en este paso de la manipulacin. Despus de la adicin de la solucin de
deteccin la coloracin rosada del sustrato desaparece (en la muestra negativas) o se
vuelve un color entre azul y amarillo (para las muestras positivas)

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VI.

RESULTADOS:

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VII.

CONCLUSIN

Una prueba de deteccin rutinaria para el VIH se basa en la tcnica ELISA

(enzyme-linked immunosorbent assay). La sensibilidad y fiabilidad de esta prueba es
alta, aunque no del cien por cien. Eso significa que, en caso de un resultado positivo,
el diagnstico debe confirmarse mediante una segunda prueba. Por coincidencia,
ELISA puede detectar otros anticuerpos que no tengan nada que ver con el VIH y que
estn presentes en la muestra de sangre.
El VIH se diagnostica mediante un simple anlisis de sangre. Se extrae una muestra
de sangre y se analiza en un laboratorio clnico pata detectar la presencia de
anticuerpos del VIH.
Para identificar los anticuerpos como anticuerpos "reales" del VIH, se realiza una
segunda prueba en la misma muestra de sangre mediante la tcnica "Western Blot".
Esta prueba visualiza la reaccin de los anticuerpos frente a protenas estructurales
independientes del VIH.
Los anticuerpos son protenas producidas por las clulas del sistema inmunitario que
combaten a los antgenos. Los antgenos son partculas reconocidas como "extraas"
por el sistema inmunitario, como las bacterias, los virus y los parsitos. Cada
anticuerpo es especfico para un antgeno
concreto. As, si se detectan anticuerpos del VIH en la sangre, eso significa que el
sujeto est infectado y que el cuerpo ha iniciado una reaccin inmune contra el VIH
por medio de la secrecin de anticuerpos especficos.

VIII.

BIBLIOGRAFA:

Fernndez M. VIH. Espaa; 2009. Fecha de acceso: 02/12/15. Disponible en:

http://www.janssencilag.es/bgdisplay.jhtml?
itemname=hiv_diagnosis&product=none