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WESTERN BLOT

Western Blot, tambin llamado inmunoblot, es una tcnica analtica muy


utilizada para identificar una protena diana en una mezcla de protenas
complejas gracias a la especificidad de la interaccin anticuerpo-antgeno.
El mtodo se basa en la construccin de un complejo anticuerpo: protena a
travs de la unin especfica de anticuerpos a las protenas inmovilizadas
sobre una membrana de nitrocelulosa o PVDF y en la deteccin del
anticuerpo unido mediante uno de los dos diferentes mtodos de deteccin
de western blot: el mtodo de deteccin directo y el indirecto.

Mtodo de Deteccin Directo VS. Indirecto


En la deteccin indirecta de Western Blot (mtodo tradicional), las
muestras de protenas se resuelven primero por SDS-PAGE y luego son
electroforticamente transferidas a la membrana. Despus de una etapa de
bloqueo, se aade primero un anticuerpo primario para unirse al eptopo de
la protena diana, luego se sondea la membrana con un anticuerpo primario
(mono-o policlonal) especficamente dirigido contra la protena diana. Esto
es seguido por un anticuerpo secundario marcado que est dirigido contra
el anticuerpo primario.En un gran nmero de marcadores se utilizan:
enzima, tal como Horseradish Peroxidase (HRP) o fosfatasa alcalina (AP),
biotina, sondas fluorescentes tales como fluorescena o rodamina.

Figura 1 Mtodo Indirecto de marcaje de anticuerpo. La


bioconjugacin se ha realizado con la tecnologa nitzipper.

En la deteccin directa de Western blot, slo un anticuerpo primario,


marcado con un marcador fluorescente o enzima, se utiliza para detectar un
antgeno en la mancha (blot), sin necesidad de un anticuerpo secundario.

Figura 2 Mtodo Directo de marcaje de anticuerpo. La


bioconjugacin se ha realizado con la tecnologa nitzipper.

Ambos mtodos son vlidos y presentan cada uno pros y contras en


comparacin con el otro. Te proponemos un estudio de los pros y los contras
de cada mtodo en la siguiente tabla:

Mtodo DIRECTO

Mtodo INDIRECTO

PROS

CONTRAS

PROS

CONTRAS

* Rpido
porque slo
se usa un
anticuerpo y
se necesitan
menos
etapas.
*Unin
especfica
del
anticuerpo
secundario
(no hay
reactividad
cruzada).
*
Disminucin

* Falta de
sensibilidad para
detector bajos
niveles de
expresin del
antgeno.
* Necesidad de
marcar cada
anticuerpo
primario para cada
antgeno de
inters: consume
tiempo y es
costoso.
*La
inmunoreactividad
del anticuerpo

* Mayor nivel de
sensibilidad y
genera una seal
ms intensa.
* Una amplia
variedad de
anticuerpos
secundarios
marcados
disponibles
comercialmente.
*Mxima
inmunoreactividad
del anticuerpo
primario se
mantiene, ya que
no est etiquetado.

* Unin no
especfica
del
anticuerpo
secundario
y alto ruido
de fondo.
* El uso de
un
anticuerpo
secundario
requiere
pasos
adicionales
de bloqueo
y de control.

Mtodo DIRECTO

de la
variabilidad
del ensayo y
mejora de la
calidad de
los datos.

primario puede
verse afectada
adversamente por
el marcaje.
* No hay
flexibilidad en la
eleccin marcador
del anticuerpo
primario de un
experimento a
otro.
* Amplificacin de
seal mnima.
* Altos
conocimientos
cientficos
especializados
requeridos.

Mtodo INDIRECTO

*Mayor
amplificacin de la
seal debido a la
unin de varios
anticuerpos
secundarios a cada
anticuerpo
primario.

Western Blot, un proceso todava limitado por la


disponibilidad de productos
Hoy en da, una gran variedad de anticuerpos est disponible
comercialmente, pero slo unos pocos se comercializan directamente con
un marcador. Ese es uno de los problemas que los cientficos tienen que
enfrentarse cuando tienen que realizar ensayos de Western Blot.
Como los mtodos de deteccin directos e indirectos son procesos
complejos y costosos para los usuarios finales para marcar un anticuerpo,
algunos kits de marcaje han sido desarrollados por varias empresas. Sin
embargo, esta solucin todava tiene algunas limitaciones, ya que slo
ofrecen la posibilidad de marcar un nmero limitado de anticuerpos con un
nmero limitado de marcadores y por lo tanto, no siempre se ajustan a las
necesidades de los usuarios finales para la deteccin de una diana
especfica, o requieren el uso de equipos de deteccin, que por consiguiente
les convierte en una solucin cara.
Por lo tanto los cientficos todava estn limitados en sus avances en
investigacin, ya que no tienen una solucin eficaz, universal y econmica
que les permita realizar sus western blot con cualquier tipo de anticuerpos y

cualquier tipo de marcador, superando las dificultades de marcaje


convencional como la prdida de anticuerpos, la orientacin, etc.

Nitzipper - La tecnologa de marcaje de anticuerpos ms


simple, rpida y verstil para tus Western Blots
nitzipper es una tecnologa de bioconjugacin innovadora que permite el
marcaje directo de anticuerpos, protenas, pptidos u otras biomolculas
para su uso en diversas aplicaciones, el desarrollo de kits de diagnstico,
descubrimiento de nuevos medicamentos y cualquier otra aplicacin que te
puedas imaginar.
Descubre rpidamente cmo funciona la tecnologa de bioconjugacin
nitzipper gracias a la imagen de abajo. Fig.3.

Figura 3 - Grfica con tiempos del protocolo de bioconjugacin


nitzipper para el marcaje de anticuerpos.

En este ejemplo, el anticuerpo purificado est funcionalizado con el Linker U


de nitzipper y el marcador est funcionalizado con el Linker T, linkers
complementarios. El protocolo de un solo paso es tan rpido y fcil de usar,
que permite marcar los anticuerpos en menos de 30 segundos. El
investigador simplemente pipetea los anticuerpos funcionalizados con el
Linker U con el marcador de inters funcionalizado con el Linker T
complementario y se incuba unos 15 minutos.
Obtienes finalmente tu anticuerpo marcado listo para usar en tus tcnicas
de western blot en menos de 17 minutos y con una alta pureza (hasta ~
100% de conjugado anticuerpo-marcador sin necesidad de purificacin
adicional).

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